使用一套实用可行的方法,描述英国皇家空军家族激酶与疾病相关的突变体

Cancer Research

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Summary

在本文中,我们提出了一套实用可行的方法,用于描述RAF家族激酶与疾病相关的突变体,包括体外激酶测定、RAF共活化测定和补充裂化荧光酶测定。

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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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Abstract

迅速加速的纤维肉瘤(RAF)家族激酶在细胞生物学中起着核心作用,其功能障碍导致癌症和发育障碍。与疾病相关的RAF突变体的特征将帮助我们选择适当的治疗策略来治疗这些疾病。最近的研究表明,RAF家族激酶具有催化和脱硫活性,受二聚体化的严格调节。在这里,我们构建了一套实用可行的方法,以确定RAF家族激酶及其突变体的催化和碱性活动以及相对二聚体亲和力/稳定性。首先,我们修正了经典的体外激酶测定,通过降低缓冲液中的洗涤剂浓度,采用温和的快速洗涤程序,并采用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合,以防止RAF二聚物在净化。这使我们能够适当地测量组织活性RAF突变体的催化活性。其次,我们开发了一种新型的RAF共激活测定法,通过使用N端截断的RAF蛋白来评估激酶死原体突变体的机分活性,消除了当前协议中活性Ras的需求,从而实现了更高的灵敏度。最后,我们生成了独特的互补裂化荧光素酶测定法,定量测量了各种RAF突变体的相对二聚体亲和力/稳定性,与传统共免疫沉淀测定相比,它更可靠、更灵敏。总之,这些方法具有以下优点:(1) 用户友好;(二)无先进设备,能够有效进行;(3) 性价比高;(4) 高度敏感且可重复。

Introduction

RAF家族激酶是RAS/RAF/MEK/ERK信号级联的关键组成部分,它传输来自RAS的信号来激活线粒体激活蛋白激酶(MEK)1、2、3、4。这个家族激酶在细胞生长、存活和分化中起着至关重要的作用,它们的改变诱发了许多疾病,特别是癌症5,6,7,8。最近,基因组测序已经发现许多与疾病有关的RAF突变体在RAS/RAF/MEK/ERK级联9、10、11的信号传输中表现出不同的特性。仔细描述RAF突变体将有助于我们了解RAF突变体如何改变RAS/RAF/MEK/ERK级联的信号输出的分子机制,最终选择适当的方法来治疗各种RAF突变体驱动的疾病。

皇家空军家族激酶包括三个成员,CRAF,BRAF和ARAF,它们具有相似的分子结构,但激活下游信号1,2,3,4的能力不同。在这些参数中,BRAF 因其构成性磷酸化 NtA (N-t erminal acidic) 主题12、13、14 而 ARAF 具有最低的活性活动产生于其非规范的APE主题15。这可能解释不同突变频率的皇家空军参数在疾病:BRAF>CRAF>ARAF。此外,在同一个 RAF 参数中,不同站点的突变可能会以不同的方式触发下游信号,这为 RAF 家族激酶的调节增加了另一层复杂性。最近的研究表明,所有皇家空军激酶都有催化和阿尔波斯特活动13,14,16,17,18。组织活性RAF突变体通过磷化MEK直接打开下游信号,而激酶死RAF突变体可以通过侧对侧二聚变并激活MEK-ERK信号16转动其野生型对等体 ,19,20.二角亲和力/稳定性是一个关键参数,它不仅决定激酶死RAF突变体的碱性活性,而且影响构成活性RAF突变体的催化活性15,2122.具有高二聚体亲和力/稳定性的激酶死原生突变体可以直接将内源性野生型RAF转动15,而那些具有中间二聚体亲和力/稳定性的突变体需要主动Ras或高度的野生型RAF分子功能13,15,20,21,23。同样,构成活性RAF突变体以二分位依赖方式磷化MEK,而那些具有低二分位亲和力/稳定性的突变体在免疫沉淀后失去其在体外催化活性,而免疫沉淀打破了弱的RAF二聚体15, 21,22.二聚体亲和力/稳定性也决定了RAF突变体对其抑制剂的敏感性,并与RAF抑制剂24的抗性呈正相关。因此,为了描述与疾病相关的RAF突变体,有必要测量其催化和碱化活性,以及二角体亲和力/稳定性。

近年来,我们的实验室和其他实验室已经开发出各种方法来表征皇家空军家族激酶及其突变体。根据我们的实验室和其他年的经验,我们认为以下三种检测在定义与疾病相关的RAF突变体方面具有优势:(1)易于检测组织催化活性的体外激酶测定活性RAF突变体15;(2)RAF联合激活测定,这是一个可靠和方便的方法,以测量激酶死亡的RAF突变体13,15,21,22,23的活性。25;(3) 与传统的共免疫沉淀测定相比,在测量RAF突变体的相对二聚位亲和/稳定性方面具有更高灵敏度的免费裂化荧光酶测定,并且能够在没有先进设备的情况下进行。与定量分析方法如SPR(S尿面P拉斯蒙Resonance)分析15,22。结合这三种检测,我们可以很容易地了解与疾病相关的RAF突变体如何改变下游信号,从而利用适当的治疗策略来治疗由此RAF突变引起的疾病。

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Protocol

1. 用于测量 RAF 突变体催化活性的 Vitro 激酶测定

  1. 使用吉布森组装或传统的分子克隆方法,在C-总站用FLAG(DYKDDDDK)标记构建用RAF突变体编码的载体(图1A)。
    1. 通过 PCR 将 FLAG 标记和突变引入 RAF 编码序列,然后使用吉布森组件或 T4 DNA 结扎并遵循制造商的协议,将整个序列插入 pCDNA3.1(+) 载体中。对PCR反应使用以下条件:(1) 95 °C,2分钟;(2) 95 °C, 30 s;(3) 59 °C, 30 s;(4) 68 °C, 3 分钟;(5) 20 个周期(2 到 4 个);(6) 4 °C 保持。
      注:用于克隆的PCR引基器:5- AAAATATACACATATATATGGAGACC-3和5-CAGCGGAACGGCCCTTA-3。
    2. 在 RAF 突变编码序列的上游插入 GST 编码序列,以便使用步骤 1.1.1 中所述的相同方法生成编码 GST 融合 RAF 突变体的矢量。
    3. 在转染前通过DNA测序验证所有载体。
  2. 在转染前一天,在6孔板中的板293T细胞,密度为5 x 105细胞/孔。当细胞密度在第二天达到80~90%汇合时,通过编码FLAG标记的RAF激酶或其突变体,通过遵循制造转染试剂(材料表)的协议,将载体转染成细胞,从步骤1.1到细胞中。
  3. 转染后24小时更换培养基。
  4. 转染后48小时吸气培养基,并加入400μL/井的易莱缓冲液(25 mM Tris*HCl, 150 mM NaCl, 1 mM 乙烯二甲酸 (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) 补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂,以裂解冰上细胞.
    注:利地缓冲液中NP-40的浓度对于检测具有中度二聚体亲和力/稳定性的RAF突变体的催化活性至关重要。高浓度的洗涤剂或强洗涤剂在分解缓冲液中可能会破坏RAF二聚体,从而杀死RAF激酶或其突变体的催化活性。
  5. 将细胞分解转移到1.5 mL管中,在4°C下旋转12,000 x g10分钟,以耗尽细胞碎片。
  6. 将清洁全细胞解液量的每个样品转移300μL至1.5 mL管,每样品加入20μL的抗FLAG亲和珠,并在冷室(4°C)中旋转1小时。还要将每个清洁全细胞酸化酶的样品取至40μL,以检测免疫突变体的表达和活性(磷-ERK1/2),如下所述。
  7. 用解酶缓冲液清洗抗FLAG珠一次,然后用激酶反应缓冲液(20 mM HEPES,10 mM MgCl2,0.5 mM Na3VO4, 0.5 mM DTT, pH 7.2),加入20 μL的激酶反应混合物(2μg MEK1(K97A)和100 μM ATP在20 μL的kinas每个示例的操作缓冲区)。
    注:珠子清洗应轻柔快速完成,在加入激酶反应混合物之前,应完全吸气剩余的缓冲液,在冷室4°C下进行此步骤的所有操作。
  8. 在室温(25°C)下孵育激酶反应10分钟,并在孵育过程中每隔一分钟用手指翻转含有激酶反应的管。
  9. 添加 5 μL 的 5x SDS 样品缓冲液(375 mM Tris*HCl,9%硫酸钠(SDS),50%甘油,0.03%溴酚蓝),每个样品停止激酶反应,然后在90°C加热样品5分钟。
  10. 用0.1%SDS运行9~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品,将蛋白质转移到硝化纤维素膜,并通过免疫波液检测样品中的磷-MEK和RAF突变体水平。
    注:磷-MEK也可以量化使用+32P-ATP合并。简单地说,将10μM=32P-ATP添加到激酶反应缓冲液中,然后使用标准自辐射学、磷成像或液体闪烁计数技术,在PAGE分离后量化磷酸化MEK的量。适当。

2. 皇家空军联合激活评估激酶死亡皇家空军突变体的阿尔罗斯特活动测定

  1. 构造对 RAF 接收器(CRAF 激酶域具有不可磷化 NtA 图案、AAFF)或激酶死 RAF 活化器(具有磷酸化-模拟 NtA 图案、SSDD、DDEE 或 DGEE 的 RAF 激酶域)的载体(图 1 A)(图 1A)步骤 1.1 中所述。
  2. 转染293T细胞与两个向量编码RAF接收器和激酶死RAF激活器或单个载体编码蛋白质之一,如步骤1.2和1.3所述。
  3. 转染后24小时更换培养基,在48小时收获293T转染剂,按照步骤1.4和1.5所述制备整个细胞易食物。
  4. 在室温(25°C)下快速将清洁的全细胞液化液与5x SDS样品缓冲液混合,然后在90°C下煮5分钟。
  5. 用0.1%SDS在9~12%PAGE中运行煮熟的全细胞酸洗样品,将蛋白质转移到硝化纤维素膜,检测磷-ERK1/2水平,并通过免疫液控制蛋白质。

3. 用于测量 RAF Mutants 的相对二聚位器亲和力/稳定性的免费拆分 Luciferase 测定

  1. 构造载体编码 FLAG 标记的 RAF 突变体融合到 Nluc 的 N 端(萤火虫荧光素酶的 N 端,aa2-416) 或 C-C-总站(萤火虫荧光素酶的 C 端,aa398-550),如步骤 1.1 所述。
  2. 转染293T细胞与一对载体编码不同的Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体,如步骤1.2所述。
  3. 在转染后24小时,用无色介质(即无苯酚红的DMEM)将293T细胞转染剂重新板入Krystal黑色图像板,其细胞密度为每孔2x105。
  4. 24小时后,将D-荧光素(0.2mg/mL)加入293T细胞转染剂中,孵育30分钟,并使用多检测系统(材料表)测量荧光素酶信号。
  5. 测量荧光素酶信号后,用莱沙缓冲液吸出介质和莱塞293T转染剂,以制备步骤1.4和1.5中所述的整个细胞莱沙。
  6. 使用 0.1% SDS 在 9~12% PAGE 中运行整个细胞解液样本,并通过抗 FLAG 免疫球检测 Nluc-RAF 突变体的表达水平,如步骤 2.5 所述。293T转染剂中的Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的相对表达水平通过使用其免疫体中的图像J进行量化。
  7. 根据Nluc-RAF突变体的表达水平,使293T细胞转染剂的荧光素酶信号正常化。简单地说,这是通过将原始荧光素酶信号除以步骤 3.6 中 Nluc-RAF 突变体和 Cluc-RAF 突变体的相对表达水平来实现的。

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Representative Results

皇家空军家族激酶具有催化和异体活动,这使得其与疾病有关的突变体能够通过不同的机制打开下游信号13、14、16、17 ,18.构成活性的RAF突变体直接磷化其基质,而激酶死RAF突变体通过转活野生型对等体实现其功能。如图1B所示,两种构成活性 RAF 突变体(如调节脊柱 (R-spine) 突变体 (BRAF (L505M)、CRAF(DDEE/L397M) 和 ARAF(DGEE/L358M))13、23、25,26、BRAF(V600E)和BRAF([NVTAP))和激酶死亡RAF突变体(如催化脊柱(C-脊柱)-融合BRAF(+NVTAP/V471F)15)在293T细胞中表达时激活ERK。因此,RAF突变体在细胞中激活ERK信号的能力不能作为标准来区分组织活性突变体和激酶死突变体,尽管一些具有中度二分位亲和力/稳定性的激酶死突变体打开下游信号只与活动Ras的合作。我们在这里介绍的三种方法可以帮助我们有效地描述所有与疾病相关的RAF突变体。在以前的研究中,使用这些测定法所揭示的所有RAF突变体的生物性质已在表1中得到总结。

我们可以用来区分组织活性RAF突变体和激酶死RAF突变体的第一种方法是体外激酶测定。在本次测定中,通过免疫沉淀对RAF突变体进行纯化,在体外进行催化反应,以激酶死MEK1(K97A)和ATP为基质。用免疫蛋白测定,在激酶反应混合物中,将RAF突变体的催化活性作为MEK1(K97A)的AL(A正ct Loop)磷酸化。如图1 C所示,此测定法可有效探测BRAF、CRAF和ARAF13、15、23、BRAF(V600E)9和BRAF(+NVTAP)15的R-spine突变体的催化活性。但不是激酶死BRAF(V471F/_NVTAP)15,它有一个融合的C-spine。然而,具有弱二聚体亲和力/稳定性的构成活性RAF突变体的催化活性,如ARAF R-spine突变体(ARAF(DGEE/L358M))(图1C,车道4),CRAF和ARAF突变体,具有改变的二分界面(CRAF(DDEE/L397M/R401H),ARAF(DGEE/L358M/APE/R362H)15、22(图1D,E)可能无法使用此测定法进行探测,因为它们的调暗剂在净化过程中破裂,特别是当净化时使用含有强或高浓度洗涤剂的缓冲液进行。为了避免具有弱二聚体亲和力/稳定性的 RAF 突变体的催化活性损失,我们通常将这些突变体与 GST(glutathione S-t流酶)融合在一起,这是一种具有强亲和力/稳定性的二分蛋白。进行体外激酶测定,可挽救这些RAF突变体的催化活性15,22(图1E)。一般来说,大多数RAF突变体可以分类为组织活性或激酶死突变体使用此测定。

我们在这里描述的第二种方法是RAF联合激活测定,可用于评估激酶死RAF突变体13、15、21、22、23的异体活性,25.虽然一些激酶死皇家空军突变体具有非常高的二聚体亲和力/稳定性,如BRAF(V471F/_NVTAP)15,但在细胞中表达时可以直接激活内源性RAF分子(图1B,车道7),大多数激酶死RAF突变体需要活性Ras的合作来转用野生型RAF。然而,活性Ras是ERK信号的直接激活器,其引入将增加有源ERK的基础水平。为了避免活性Ras的干扰,我们在此测定中使用N-终点截断的RAF突变体(图2A)。如图2B所示,BRAF的激酶死突变体, CRAF 和 RAF 具有酸性 NtA 图案和 C-spine 融合 (BRAF(V471F,aa431-766)、CRAF(DDEE/V363F、aa323-648)和 ARAF(DGEE/V324F、aa284-606))作为异体活化剂在293T细胞中共同表达时,用非磷化NtA图案(CRAF接收器,CRAF(AAFF,aa323-648)触发CRAF的催化活性。相反,具有极高二分位亲和力/稳定性(见下文)的激酶死BRAF突变体(V471F/_NVTAP,aa431-766)通过触发内源性RAF打开ERK信令,即使没有CRAF接收器的共同表达。总体而言,此测定可用于评估所有激酶死RAF突变体的转能。

RAF家族激酶的二分化不仅调节其激活下游MEK-ERK信号的能力,还决定了它们对RAF抑制剂的敏感性15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32.与该途径之间的其他蛋白质-蛋白质相互作用相反33,34,35,RAF家族激酶及其突变体的二聚位化相对较弱,难以用传统的生物化学方法进行评价,如共免疫沉淀。为了解决这个问题,我们最近开发了一种免费的裂解荧光酶测定法,用于测量RAF家族激酶及其突变体的相对二聚体亲和力/稳定性15,22,36.如图 3A,RAF 激酶域(BRAF 的 aa431-766、CRAF 的 aa323-648 和 Aa284-606(Aa284-606)分别与 N-总站 (aa2-416) 或 C-总站 (aa398-550) 融合在一起,以完整地组装起来。荧光酶在皇家空军二聚化时。此测定中的荧光素酶活性与 RAF 二聚子的数量直接相关。这种测定是非常敏感的,甚至可以检测到RAF突变体非常弱的二分化。正如我们之前报告的那样15,致癌BRAF(V600E)作为二聚体,只有二分界面中Arg-his突变(R509H)和非甲酸APE改变(APE图案中的P622A)才能完全消除其二聚体化,从而阻止其催化作用。活动(图 3B).通过使用体外激酶测定,我们进一步发现BRAF(V600E)变异与改变的APE图案,BRAF(V600E/AAE),但不是与Arg-his突变在二分界面,BRAF(V600E/R509H),失去其催化活性在纯化(图 3C),表示前者的亲和力/稳定性比后者低得多。为了直接测量这些BRAF(V600E)变型形成二聚体的倾向,我们进行了免费的裂化荧光酶测定,并确认这些变型与BRAF(V600E)相比,BRAF(V600E/) 具有完全不同的二分位亲和力/稳定性。R509H) 比 BRAF(V600E/AAE)比 BRAF(V600E/R509H/AAE)(图 3D).单体BRAF(V600E/R509H/AAE)产生的荧光酶信号可与非转染293T控制()图 3D,左面板车道5),表明此测定具有非常低的背景。为了进一步确定免费裂化荧光酶测定的有效性,我们接下来通过使用此测定法测量了一组致癌BRAF突变体的相对二分位亲和力/稳定性,其中含有我们和其他识别的β3-μC环的帧内缺失组15,37,38.正如我们所知,虽然所有这些突变体激活ERK信号时,在293T细胞表达(图 3E),在体外表现出相当不同的催化活性(图 3F).BRAF(+MLN(aa484-486 del)和BRAF([NVTAP(aa486-490 del)]在免疫沉淀物净化时非常活跃,而BRAF([NVTAPT(aa486-491 del))和BRAF(Aa496-497 del))在相同条件下失去了催化活性。可以拯救由GST融合。此外,BRAF(+NVTAP)、BRAF(V471F/_NVTAP)的激酶死性版本在细胞中表达时表现出强大的功效来激活内源性RAF(图 1B车道7)。这些数据表明,这组BRAF突变体与BRAF([NVTAP)的二分位亲和力/稳定性比BRAF(+NVTAP)高,比BRAF([NVTAPT)]和BRAF(+QA)具有完全不同的二分位亲和力/稳定性。事实上,免费裂性荧光素酶测定的结果完全支持我们的推论(图 3G).综合来看,我们的数据表明,免费裂化荧光素酶测定是测量RAF突变体相对二聚位器亲和力/稳定性的可靠方法。

Figure 1
图 1:利用体外激酶测定,探测RAF突变体的催化活性。(A) 本研究中使用的 RAF 突变原理图.(B) 在细胞中表达的构成活性和激酶死RAF突变体都可以激活ERK信号。293T细胞用编码不同RAF突变体的载体转染,通过抗磷-ERK1/2免疫球体检测ERK活性。(C) 具有低二聚位亲和力/稳定性以及激酶死原皇家突变体的组织活性RAF突变体,在免疫沉淀净化后,不能对体外MEK进行磷化。B中的RAF突变体使用抗FLAG珠子进行纯化,并使用方案中描述的体外激酶测定来探查其催化活性。(D-E)具有低二聚位亲和力/稳定性的构成活性RAF突变体的体外催化活性可以通过GST融合来挽救。(D) 组织活性RAF突变体及其GST融合的对应物在293T细胞中表达,其活性通过抗磷-ERK1/2免疫球体测量。(E) D中的RAF突变体通过免疫沉淀进行纯化,并使用方案所述的体外激酶测定来探查其体外催化活性。RAF R-spine 突变体:BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M)和 ARAF(DGEE/L358M)。"_NVTAP"表示在BRAF中删除aa486-490。ARAF 的 APE 突变是指在 ARAF 中生成规范的 APE 主题的 A475P。"KD"表示全文中的"激酶域"。BRAF(KD)是指BRAF的aa431-766片段,而CRAF(KD)和ARAF(KD)分别代表CRAF的aa323-648片段和Aa284-606片段。这一数字的结果已于15日、22日报告。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:使用RAF联合激活测定法评估RAF突变体转用野生型RAF的能力。(A) 说明皇家空军联合激活测定的图表.(B) 具有酸性NtA图案的激酶死原体突变体与具有催化能力CRAF的接收者在293T细胞中共同表达,293T中转体中ERK1/2的活性通过抗磷-ERK1/2免疫球体进行测量。除BRAF(V471F/_NVTAP)具有非常高的二分位亲和力/稳定性外,大多数激酶死原体突变体都需要外源性RAF接收器的共同表达才能打开ERK信令。这一数字的结果已于15日、22日报告。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:使用免费的裂化荧光素酶测定法测量RAF突变体的相对二聚体亲和力/稳定性。(A) 一个图表,说明免费的裂解荧光素酶测定。(B-D)BRAF(V600E)变型的二聚化是其体内和体外催化活性所必需的。(B) 单体BRAF(V600E)变型BRAF(V600E/R509H/AAE)在体内没有催化活性,可以通过GST融合回收。BRAF(V600E)变种及其GST融合对应物在293T细胞中表达,其活性通过抗磷-ERK1/2进行测量。(C) BRAF(V600E)变型具有低二聚位亲和力/稳定性,BRAF(V600E/AAE)在纯化后在体外失去催化活性,可以通过GST融合来挽救。B的BRAF(V600E)变异通过免疫沉淀进行纯化,其催化活性通过体外激酶测定进行探查,如协议所述。(D) 使用协议所述的免费裂化荧光酶测定法测量BRAF(V600E)变型的相对二聚位器亲和力/稳定性。(E-G)带在帧内删除 +3-μC 环路的 BRAF 突变体可作为二聚器激活 ERK 信令。(E) 在细胞中表达时,带帧内删除 β3-μC 环的BRAF突变体激活ERK信号。BRAF突变体在293T细胞中表达,其活性在B中描述。 (F) BRAF突变体具有低二聚位亲和力/稳定性,在体外失去催化活性,可以通过GST融合来挽救。BRAF突变体及其来自E的GST融合对应体的体外催化活性在C中进行了测量。(G) 带在帧内删除 β3-°C 环的BRAF突变体具有完全不同的二分位亲和力/稳定性。在±3-°C环的帧内删除下,BRAF突变体的相对二聚体亲和力/稳定性在D中进行了测量。D&G 中的错误条表示 s.d. 以显示独立实验之间的方差 (n = 4)。BRAF 的 AAE 突变在 APE 主题中意味着 P622A,从而产生非规范的 APE 图案。[MLN],"[NVTAPT"和"_QA"分别表示在BRAF的+3-+C回路中删除aa484-486、aa486-491、aa496-497。这个数字的一些结果已经报告之前15。请点击此处查看此图的较大版本。

Table 1
表 1:各种RAF突变体的生物特性。本表总结了本研究中使用的所有RAF突变体的催化活性、二分位活性和相对二聚位体亲和力/稳定性。"Y"表示"是",而"N"表示"否"。"N="表示这些突变体如果与GST融合,具有催化活性。"*"、"+"、"+"、"+"和"-"分别表示"非常强大"、"强大"、"中间"、"弱"和"无"。

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Discussion

在本文中,我们提出了三种描述与疾病相关的RAF突变体的特征的方法,包括体外激酶测定、RAF共激活测定和免费裂化荧光酶测定。由于RAF激酶具有催化活性和铀活性,各种RAF突变体可以通过两个不同的机制13、14、16、17激活下游信号。18.构成活性RAF突变体直接磷化下游效应器MEK,而激酶死RAF突变体通过转激活其野生型突变体触发下游信号。然而,无论是构成活性和激酶死RAF突变体都需要二聚体,以履行其功能15,16,17,19,20和二分器RAF突变体的倾向不仅决定着RAF突变体的催化活性或异化活性,而且决定了它们对RAF抑制剂15、24的敏感性。体外激酶测定、RAF共激活测定和免费裂化荧光酶测定为我们提供了一套简单、有效、可靠的方法,用于区分组织活性突变体和激酶死突变体,并评估其激活下游信令的能力。

体外激酶测定是检测蛋白激酶催化活性的经典方法。为了采用这种方法测量RAF突变体的催化活性,我们在试剂和程序15、21、22方面作了重大修改。由于RAF家族激酶作为二聚子作用于其基质MEK,其二聚位亲和力/稳定性相对较低,因此,我们已将洗涤剂NP-40的浓度从1%降至0.25%,用于纯化RAF蛋白的缓冲液,以防止皇家空军二分器解离。同样,我们还使用温和的快速洗涤程序进行RAF蛋白质纯化。这些变化对于检测具有非常弱二聚体亲和力/稳定性的构成活性RAF突变体的催化活性至关重要,通过经典的体外激酶测定,可以确定为"激酶死"RAF突变体。此外,我们已经证明,GST融合是一个很好的替代方法,以防止皇家空军二分剂在净化期间,在这个测定15,21,22。至于激酶死RAF突变体,即使它们与GST融合,它们也不会在本次测定中表现出任何催化活性。

英国皇家空军联合激活测定法由我们开发,以评估激酶死皇家空军突变体转活其野生型对口13,15,21,22,23的能力,25.在本文的新颖测定中,我们使用N-终点截断的RAF蛋白,因此不需要活性RAS突变体或激活RAS的共同表达,这使得这种测定非常敏感。此外,此测定中的异物活化剂(激酶死RAF突变体)和接收器(具有催化能力的RAF突变体)可以很容易地分离和纯化,用于在二分化驱动转活过程中调查分子事件13.

正如我们上面提到的,二聚体亲和力/稳定性是调节RAF家族激酶及其突变体功能的关键因素,也决定了它们对RAF抑制剂13、14、15的敏感性。 16,17,18,24.然而,RAF家族激酶及其大多数与疾病相关的突变体的二聚体亲和力/稳定性非常低。为了测量这个参数,传统的生物化学测定需要复杂的实验程序和先进的设备(如SPR测定),或者很难产生可靠和可重复的数据(如免疫沉淀测定)。相比之下,免费裂化荧光酶测定是一种简单、灵敏、一致且具有成本效益的方法,用于测量RAF家族激酶及其突变体的相对二聚体亲和力/稳定性。 22,36.该测定可以探测各种RAF突变体之间二角体亲和力/稳定性的细微差异。正如我们在15日之前报道的,BRAF(V600E/AAE)具有非常弱的二分位亲和力/稳定性,即使使用非常温和的程序,其二分器在纯化时也会完全破碎。通过这种测定,我们可以区分BRAF(V600E/AAE)与单体BRAF(V600E/AAE/R509H)的弱二聚体亲和力/稳定性(图3)。

总之,这套实用可行的方法可以满足定义所有与疾病相关的RAF突变体的要求,从而有助于我们选择适当的策略来治疗各种RAF突变体驱动的疾病。

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Disclosures

提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者感谢毛细胞白血病奖学金对袁继明的支持。这项工作得到了亚洲基金癌症研究(AFCR2017/2019-JH)、杜克-新加坡国立大学Khoo桥资助奖(杜克-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRF桥接赠款(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRF试点赠款(NCCRF-YR2017-JUL-PG3)和SHF学术资助。研究补助金(AM/TP011/2018)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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