Karakterisere sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser ved hjælp af et sæt praktiske og gennemførlige metoder

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I denne artikel præsenterede vi et sæt praktiske og gennemførlige metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og supplerende split der-analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den hastigt accelererede fibrosarkom (RAF) familie kinaser spiller en central rolle i cellebiologi og deres dysfunktion fører til kræft og udviklingsmæssige lidelser. En karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter vil hjælpe os med at udvælge passende terapeutiske strategier til behandling af disse sygdomme. Nylige undersøgelser har vist, at RAF Family kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter, som er stramt reguleret ved dimerisering. Her opbyggede vi en række praktiske og gennemførlige metoder til at bestemme de katalytiske og allosteriske aktiviteter og den relative dimer affinitet/stabilitet i RAF-familiens kinaser og deres mutanter. For det første ændrede vi den klassiske in vitro-kinaseanalyse ved at reducere koncentrationen af vaskemiddel i buffere ved hjælp af en blid hurtig vaske procedure og ved at anvende en glutathion S-transferase (GST) fusion for at forhindre RAF-dimere i at dissociere under Rensning. Dette gør det muligt for os at måle den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter på passende vis. For det andet udviklede vi en ny RAF-Co-aktiverings analyse for at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter ved hjælp af N-terminal trunkerede RAF-proteiner, hvilket eliminerer kravet om aktive RAS i de nuværende protokoller og dermed opnår en højere Følsomhed. Endelig, vi genereret en unik supplerende split der assay til kvantitativt at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af forskellige RAF mutanter, som er mere pålidelig og følsom i forhold til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay. Sammenfattende har disse metoder følgende fordele: (1) brugervenlig; 2) kan udføre effektivt uden avanceret udstyr 3) omkostningseffektiv (4) meget følsom og reproducerbar.

Introduction

RAF-familiens kinaser er en vigtig bestanddel af Ras/RAF/Mek/Erk signalering Cascade, som sender et signal fra Ras for at aktivere mitogen-aktiveret proteinkinase (Mek)1,2,3,4. Denne familie af kinaser spiller en afgørende rolle i cellevækst, overlevelse og differentiering, og deres ændringer fremkalde mange sygdomme, især kræft5,6,7,8. For nylig har genomiske sequencings identificeret mange sygdomsrelaterede RAF mutanter, der udviser forskellige egenskaber i signalet transmission af Ras/RAF/Mek/Erk Cascade9,10,11. En omhyggelig karakterisering af RAF-mutanter vil hjælpe os med at forstå de molekylære mekanismer for, hvordan RAF-mutanter ændrer signal outputtet fra RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, til sidst vælger passende tilgange til behandling af forskellige RAF-mutant-drevne sygdomme.

RAF-familiens kinaser omfatter tre medlemmer, Craf, BRAF og Araf, som har lignende molekylære strukturer, men forskellige evner til at aktivere downstream-signalering1,2,3,4. Blandt disse paralogs har BRAF den højeste aktivitet i kraft af sin konstitutivt fosforyleret NTA (N-tTerminal acidic) Motif12,13,14, mens Araf har den laveste aktivitet som følge af dens ikke-kanoniske APE motiv15. Dette kan forklare de forskellige Mutations frekvenser af RAF paralogs i sygdomme: BRAF > CRAF > ARAF. Desuden kan mutationer på forskellige steder inden for samme RAF paralog udløse downstream-signalering i særskilte manerer, hvilket tilføjer endnu et lag af kompleksitet til reguleringen af RAF-familie kinaser. Nylige undersøgelser har vist, at alle RAF-kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter13,14,16,17,18. Konstitutivt aktive RAF-mutanter tænder downstream-signaleringen direkte ved fosforylerende MEK, hvorimod kinase-døde RAF-mutanter kan transaktivere deres vildtype-modparter gennem side-til-side-dimerisering og aktivere MEK-ERK signalering16 ,19,20. Den dimer affinitet/stabilitet er en nøgleparameter, der ikke kun bestemmer den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter, men også påvirker den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15,21, 22. de kinase-døde RAF-mutanter med høj dimer affinitet/stabilitet kan transaktivere de endogene Wild-type RAFs direkte15, mens dem med mellemliggende dimer affinitet/stabilitet kræver en koordination af aktive RAS eller en forhøjet niveau af Wild-type RAF molekyler til funktion13,15,20,21,23. Tilsvarende, konstitutivt aktive RAF mutanter fosforylat Mek i en dimer-afhængige måde, og dem med lav dimer affinitet/stabilitet mister deres katalytisk aktivitet in vitro ved immun opstød, der bryder de svage RAF dimerer15, 21,22. Dimerens affinitet/stabilitet bestemmer også RAF-mutanternes følsomhed over for deres hæmmere og er positivt korrelerer til modstanden i RAF-hæmmere24. For at karakterisere sygdomsrelaterede RAF-mutanter er det derfor nødvendigt at måle deres katalytiske og allosteriske aktiviteter og dimer affinitet/stabilitet.

I de seneste år har vores laboratorium og andre udviklet forskellige metoder til at karakterisere RAF familie kinaser og deres mutanter. Ifølge vores laboratorium og andres erfaring, mener vi, at følgende tre assays har fordele ved at definere sygdomsrelaterede RAF mutanter: (1) in vitro kinase assay, der kan udføres med lethed til at detektere den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15; (2) RAF-Co-aktiverings analysen, der er en pålidelig og bekvem metode til at måle den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25; (3) den gratis split der assay, der har meget større følsomhed i at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF mutanter i modsætning til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay, og er i stand til at udføre uden avanceret udstyr i i modsætning til de kvantitative analytiske metoder såsom spr (soverflaoeaktive Plasmon Resonance) analyse15,22. Ved at kombinere disse tre assays kan vi nemt forstå, hvordan en sygdomsrelateret RAF-mutant ændrer downstream-signaleringen og dermed udnytter en passende terapeutisk strategi til behandling af sygdommen forårsaget af denne RAF-mutation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in vitro-Kinaseassay til måling af RAF-mutanternes katalytiske aktivitet

  1. Konstruere vektorer kodning RAF mutanter (figur 1A) med flag (DYKDDDDK) tag på C-Terminus ved hjælp af Gibson assembly eller traditionelle molekylære kloning metoder.
    1. Introducere flaget tag og mutationer i RAF kodning sekvenser af pcrs, og derefter indsætte hele sekvenser i pcdna 3.1 (+) vektor ved hjælp af Gibson assembly eller T4 DNA ligering og efter fremstillingen protokoller. Brug følgende betingelser for PCR-reaktioner: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 cyklusser af (2 til 4); (6) hold på 4 °C.
      Bemærk: PCR primere til kloning: 5-aaattaatacgactcactatagggagaccc-3 og 5-cagcgggtttaaacgggccctcta-3.
    2. Indsæt GST-kodnings sekvensen opstrøms for RAF-mutant kodnings sekvenser for at generere vektorer, der koger GST-smeltet RAF-mutanter ved hjælp af samme metoder som beskrevet i trin 1.1.1.
    3. Validerer alle vektorer ved DNA-sequencings før transfection.
  2. Plade 293T celler i 6-brønds plader ved en tæthed på 5 x 105 celler/godt en dag før transfection. Når celletætheden når 80 ~ 90% sammenløbet på den anden dag, transficere med vektorer kodning flag-mærkede RAF kinaser eller deres mutanter fra trin 1,1 i celler ved at følge fremstillings protokollen af transfektering reagenser (tabel over materialer).
  3. Udskift kulturmediet 24 timer efter transfection.
  4. Aspirer dyrkningsmediet 48 h efter transfektering, og tilsæt 400 μl/brønd af lysis-buffer (25 mm Tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) suppleret med proteasehæmmere og fosfatasehæmmere til lyse celler på is.
    Bemærk: Koncentrationen af NP-40 i lysis-buffer er afgørende for påvisning af den katalytiske aktivitet af RAF-mutanter med moderat dimer affinitet/stabilitet in vitro. En høj koncentration af vaskemiddel eller et stærkt rengøringsmiddel i lysis buffer kan bryde RAF-dimere og derved dræbe RAF-kinaser katalytiske aktivitet eller deres mutanter.
  5. Overfør celle lysaterne til et 1,5 mL rør, og drej ned med 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c for at nedbryder cellerester.
  6. Overfør 300 μL pr. prøve af rene hele celle lysater til 1,5 mL rør, tilsæt 20 μL pr. prøve af affinitets perler med anti FLAG, og Roter i et kølerum (4 °C) i 1 time. Tag også 40 μL pr. prøve af rent hele celle lysat til side for at påvise ekspression og aktivitet (phospho-ERK1/2) af RAF-mutanter ved immunoblots som beskrevet nedenfor.
  7. Anti-FLAG-perlerne vaskes én gang med lysis-buffer, derefter en gang med kinasereaktions buffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mm na3VO4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), og der tilsættes 20 μl kinasereaktions blanding (2 μg MEK1 (K97A) og 100 μM ATP i 20 μl kinase re aktions buffer) pr. stikprøve.
    Bemærk: Perle vask skal udføres forsigtigt og hurtigt, rest bufferen skal aspireres helt før tilsætning af kinasereaktions blanding, og alle operationer på dette trin skal udføres ved 4 °C i et kølerum.
  8. Inkubér kinasereaktionerne ved stuetemperatur (25 °C) i 10 minutter, og vend rørene, der indeholder kinasereaktioner, med fingrene hvert andet minut under inkuberingen.
  9. Tilsæt 5 μL 5x SDS-prøve buffer (375 mM Tris · HCl, 9% natriumdodecylsulfat (SDS), 50% glycerol, 0,03% Bromophenol blå) pr. prøve for at stoppe kinasereaktioner, og Opvarm derefter prøverne ved 90 °C i 5 min.
  10. Prøverne udtages i 9 ~ 12% polyacrylamidgel elektroforese (side) med 0,1% SDS, overføres proteinerne til nitrocellulose membranen og detekterer niveauerne af phospho-MEK og RAF-mutanter i prøver med immunoblots.
    Bemærk: Phospho-MEK kan også kvantificeres ved hjælp af γ32P-ATP inkorporering. Kortvarigt tilsættes 10 μM γ32P-ATP til kinasereaktions bufferen, og mængden af fosforyleret Mek kvantificeres derefter efter side adskillelse ved hjælp af standard Autoradiografi, phosphorimaging eller flydende scintillationsteknikker som Passende.

2. RAF-Co-aktiverings analyse til vurdering af den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter

  1. Konstruere vektorer, der indkoder RAF-modtageren (CRAF kinase-domæne med unphosphorylatable NtA-motiv, AAFF) eller kinase-Dead RAF-aktivatorer (RAF kinase-domæne med phosphorylering-mimicked NtA-motiv, SSDD, DDEE eller DGEE) (figur 1A) som beskrevet i trin 1,1.
  2. Transfect 293T-celler med to vektorer, der koder både RAF-modtageren og den kinase-døde RAF-aktivator eller en enkelt vektor, der koder et af proteiner som beskrevet i trin 1,2 og 1,3.
  3. Udskift kulturmediet ved 24 timer efter transfection, og høst 293T transfectanter ved 48 h for at tilberede hele celle lysaterne som beskrevet i trin 1,4 og 1,5.
  4. Bland det rene hele celle lysat med 5x SDS prøve buffer hurtigt ved stuetemperatur (25 °C) og kog derefter ved 90 °C i 5 min.
  5. Kør de kogte hele celle lysat prøver i 9 ~ 12% side med 0,1% SDS, overføre proteinerne til nitrocellulose membran, og detektere niveauerne af phospho-ERK1/2 og kontrol proteiner ved immunoblots.

3. gratis split luciferase assay til måling af den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF-mutanter

  1. Konstruere vektorer kodning FLAG-Tagged RAF mutanter smeltet til N-endestation af Nluc (N-endestation af Firefly luciferase, aa2-416) eller C-endestation af Cluc (C-endestation af Firefly luciferase, aa398-550) som beskrevet i trin 1,1.
  2. Transfect 293T-celler med et par vektorer, der indkoder forskellige Nluc-RAF-mutanter og Cluc-RAF-mutanter som beskrevet i trin 1,2.
  3. Ved 24 timer efter transfection, replate 293T celle transfectanter i krystal sorte billedplader ved celletætheden på 2x105 per brønd med farve frit medium (dvs., DMEM uden phenol rød).
  4. 24 h senere, tilsæt D-luciferin (0,2 mg/ml) til 293t celle transfectanter, Inkuber i 30 min, og måle der signaler ved hjælp af en multi Detection System (tabel over materialer).
  5. Efter måling af der signalerne, aspirere mediet og lyse 293t transfectanter med lysis buffer til at forberede hele cellen lysater som beskrevet i trin 1,4 og 1,5.
  6. Køre hele cellen lysat prøver i 9 ~ 12% side med 0,1% SDS og detektere ekspression niveauer af nluc-RAF mutanter og cluc-RAF mutanter ved anti-flag immun som beskrevet i trin 2,5. De relative ekspressionsniveauer for både Nluc-RAF-mutant og Cluc-RAF-mutant i 293T transfectanter kvantificeres ved hjælp af billede J fra deres immunoblots.
  7. Normaliserer der signalerne af 293t celle transfectanter i henhold til ekspressions niveauerne af nluc-RAF-mutanter og cluc-RAF-mutanter. Dette opnås kortvarigt ved at dividere det rå der-signal med det relative ekspressionsniveau for nluc-RAF-mutanter og cluc-RAF-mutanter fra trin 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RAF-familiens kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter, som gør det muligt for deres sygdomsrelaterede mutanter at tænde downstream-signaleringen gennem forskellige mekanismer13,14,16,17 ,18. Den konstitutivt aktive RAF mutanter direkte fosforylere deres substrater, mens kinase-døde RAF mutanter opfylde deres funktion gennem transaktiverende vild-type modparter. Som vist i figur 1Ber både konstitutivt aktive RAF-mutanter (f. eks. regulatoriske rygsøjlen (R-rygsøjlen) mutanter (BRAF (L505M), Craf (ddee/L397M) og Araf (dgee/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E) og BRAF (∆ nvtap)) og kinase-døde RAF-mutanter (såsom katalytisk rygsøjle (C-ryg)-SMELTET BRAF (∆ nvtap/V471F)15) aktiverer Erk, når det udtrykkes i 293t celler. Derfor kan RAF-mutanternes evne til at aktivere ERK signalering i celler ikke tjene som standard for at skelne en konstitutivt aktiv mutant fra en kinase-død mutant, selv om nogle kinase-døde mutanter med moderat dimer affinitet/stabilitet tænder downstream signalering kun med samarbejde af aktive RAS. Tre metoder, som vi præsenterede her, kan hjælpe os med effektivt at karakterisere alle sygdomsrelaterede RAF-mutanter. De biologiske egenskaber af alle RAF-mutanter, som blev afsløret ved hjælp af disse analyser i vores tidligere studier, er opsummeret i tabel 1.

Den første metode, som vi kan bruge til at skelne de konstitutivt aktive RAF-mutanter fra de kinase-døde RAF-mutanter, er in vitro-kinaseanalysen. I denne analyse blev RAF-mutanter renset ved immunopræcipitation, og de katalytiske reaktioner blev udført in vitro med kinase-Dead MEK1 (K97A) og ATP som substrater. RAF-mutanternes katalytiske aktivitet blev målt som al (enat LOOP)-fosforylering af MEK1 (K97A) i kinasereaktions blandingerne med immunoblot. Som vist i figur 1C, denne analyse kan effektivt sonde den katalytiske aktivitet af R-rygsøjlen mutanter af BRAF, Craf og Araf13,15,23, BRAF (V600E)9, og BRAF (∆ nvtap)15, men ikke af kinase-Dead BRAF (V471F/∆ NVTAP)15 , der har en smeltet C-ryg. Den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter med svag dimer affinitet/stabilitet såsom Araf R-rygsøjlen mutant (Araf (dgee/L358M)) (figur 1C, Lane 4), Craf-og Araf-mutanter med ændret dimer-grænseflade (Craf (ddee/ L397M/R401H), Araf (dgee/L358M/Ape/R362H))15,22 (figur 1D, E) kan ikke probed ved hjælp af denne analyse, da deres dimere blev brudt under rensningen, især når rensningen blev udføres med buffere, der indeholder stærke eller højt koncentrerings midler. For at undgå tab af katalytisk aktivitet af RAF-mutanter med svag dimer affinitet/stabilitet, sammensmeltet vi normalt disse mutanter med GST (glutathion S-transferase), et dikemat protein med stærk affinitet/stabilitet, før udførelse in vitro kinase assay, som kan redde den katalytiske aktivitet af disse RAF mutanter15,22 (figur 1E). Generelt kunne de fleste RAF-mutanter klassificeres som konstitutivt aktive eller kinase-døde mutanter ved hjælp af denne analyse.

Den anden metode, som vi beskrev her, er RAF-Co-aktiverings analysen, der kan bruges til at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter13,15,21,22,23 , 25. selv om nogle få kinase-døde RAF-mutanter med meget høj dimer affinitet/stabilitet såsom BRAF (V471F/∆ nvtap)15, kan direkte aktivere endogene RAF-molekyler, når de udtrykkes i celler (figur 1B, Lane 7), de fleste kinase-døde RAF-mutanter kræver samarbejde med aktive RAS for at transaktivere vildtype-RAFs. Men, aktive RAS er en direkte aktivator af ERK signalering, hvis indførelse vil øge basal niveau af aktive ERK. For at undgå interferens fra aktive RAS brugte vi N-Terminus-trunkerede RAF-mutanter i denne analyse (figur 2A). Som vist i figur 2B, kinase-døde mutanter af BRAF, Craf og RAF med syreholdigt NTA-motiv og C-Spine fusion (BRAF (V471F, aa431-766), CRAF (ddee/V363F, aa323-648) og ARAF (dgee/V324F, aa284-606)) fungerede som allosteriske aktivatorer til udløse katalytisk aktivitet af CRAF med ikke-phosphorylatable NtA motiv (CRAF modtager, CRAF (AAFF, aa323-648)) når Co-udtrykkes i 293T celler. I modsætning hertil er kinase-Dead BRAF mutant (V471F/∆ NVTAP, aa431-766), der har meget høj dimer affinitet/stabilitet (se nedenfor), aktiveret ERK signalering ved at udløse endogene RAFs, selv uden Co-ekspression af CRAF receiver. Samlet set kan denne analyse bruges til at evaluere transaktiveringsevnen for alle kinase-døde RAF-mutanter.

Dimeriseringen af RAF-familie kinaser regulerer ikke kun deres evne til at aktivere downstream MEK-ERK signalering, men bestemmer også deres følsomhed over for RAF-hæmmere15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. I modsætning til andre protein-protein interaktioner mellem denne vej33,34,35, er denne af RAF familie kinaser og deres mutanter relativt svage og svære at blive evalueret ved hjælp af traditionelle biokemiske analyser som co-immunopræcipitation. For at løse dette problem, har vi for nylig udviklet en gratis split der assay til måling af den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF familie kinaser og deres mutanter15,22,36. Som vist iFigur 3Ablev RAF kinase-domænerne (aa431-766 for BRAF, aa323-648 for Craf og aa284-606 for Araf) sammensmeltet med henholdsvis N-Terminus (aa2-416) eller C-Terminus (aa398-550) af Firefly der (nluc og cluc), som samles for at samle intakt der ved RAF dimerization. Der-aktiviteten i denne analyse korrelerer direkte med mængden af RAF-dimere. Denne analyse er meget følsom og kan detektere selv en meget svag denne af RAF mutanter. Som vi rapporterede før15fungerer onkogene BRAF (V600E) som en dimer, og kun en sammensat mutation med ARG-til-hans-mutationen (R509H) i dimer-grænsefladen og den ikke-canoniske Ape-ændring (P622A i Ape-motiv) kan helt ophæve dens dimerisering og derved blokere dens katalytiske aktivitetFigur 3B). Ved at anvende in vitro-kinaseassay fandt vi yderligere, at BRAF (V600E) varianten med det ændrede APE-motiv, BRAF (V600E/AAE), men ikke, at med ARG-til-hans-mutationen i dimer-grænsefladen, BRAF (V600E/R509H), mistede sin katalytiske aktivitet ved oprensning (Figur 3C), hvilket tyder på, at den tidligere variant har langt mindre dimer affinitet/stabilitet end sidstnævnte. For direkte at måle tilbøjeligheden af disse BRAF (V600E) varianter til at danne dimers, vi foretog en gratis split der assay, og bekræftede, at disse varianter havde helt anden dimer affinitet/stabilitet med BRAF (V600E) højere end BRAF (V600E/ R509H) end BRAF (V600E/AAE) end BRAF (V600E/R509H/AAE) (Figur 3D). Luciferasesignalet produceret af mono BRAF (V600E/R509H/AAE) var sammenligneligt med det, der ikke var overført til 293t Control (Figur 3D, venstre panel Lane 5), hvilket indikerer, at denne analyse har en meget lav baggrund. For yderligere at bestemme effektiviteten af gratis split der assay, vi næste målt ved hjælp af denne analyse den relative dimer affinitet/stabilitet af en gruppe af onkogene BRAF mutanter med in-frame sletninger af β3-αc loop, der blev identificeret af os og andre Grupper15,37,38. Som vi har vidst, selv om alle disse mutanter aktiveret ERK signalering, når de udtrykkes i 293T celler (Figur 3E), udviste de ret differentiel katalytisk aktivitet in vitro (Figur 3F). BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) og BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) var meget aktive ved rensning ved immunoprecipitaion, hvorimod BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) og BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) mistede deres katalytiske aktivitet under samme betingelse, selv om det kunne reddes af GST fusion. Desuden udviste den kinase-døde version af BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) en stærk styrke til at aktivere endogene RAFs, når de udtrykkes i celler (Figur 1BLane 7). Disse data tyder på, at denne gruppe af BRAF mutanter har en helt anden dimer affinitet/stabilitet med BRAF (∆ NVTAP) højere end BRAF (∆ MLN) end BRAF (∆ NVTAPT) og BRAF (∆ QA). Faktisk, resultatet fra den gratis split der assay fuldt ud støttede vores slutning (Figur 3G). Samlet set indikerer vores data, at den gratis split der assay er en pålidelig metode til at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF-mutanter.

Figure 1
Figur 1 : Probe den katalytiske aktivitet af RAF-mutanter ved hjælp af in vitro-kinaseanalyse. A) et skematisk diagram for RAF-mutationer, der anvendes i dette studie. B) både konstitutivt aktive og kinase-døde RAF-mutanter kan aktivere Erk signalering, når de udtrykkes i celler. 293T celler blev transficeret med vektorer, der indkode forskellige RAF mutanter, og aktiviteten af ERK blev detekteret af anti-phospho-ERK1/2 immunoblot. C) konstitutivt aktive RAF-mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet samt kinase-døde RAF-mutanter kan ikke fosforylere Mek in vitro ved rensning ved immunopræcipitation. RAF-mutanter i B blev renset ved hjælp af anti-FLAG perler, og deres katalytiske aktivitet blev probed ved hjælp af in vitro kinase assay som beskrevet i protokollen. (D-E) Den in vitro-katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet kan reddes af GST fusion. D) KONSTITUTIVT aktive RAF-mutanter og deres GST-smeltet modparter blev udtrykt i 293T-celler, og deres aktivitet blev målt ved anti-phospho-ERK1/2 immunoblot. E) RAF-mutanter i D blev renset ved immunopræcipitation, og deres in vitro-katalytiske aktivitet blev probed ved hjælp af in vitro-kinaseassay som beskrevet i forsøgsprotokollen. RAF R-Spine mutanter: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M) og ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP" repræsenterer sletning af aa486-490 i BRAF. APE-mutationen af ARAF betyder A475P, der genererer et kanonisk APE-motiv i ARAF. "KD" repræsenterer for "kinase Domain" i den fulde tekst. BRAF (KD) betyder aa431-766-fragmentet af BRAF, mens CRAF (KD) og ARAF (KD) repræsenterer henholdsvis aa323-648-fragmentet af CRAF og aa284-606-fragmentet af ARAF. Resultaterne i dette tal er blevet rapporteret tidligere15,22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Evaluere, om RAF-mutanter har mulighed for at transaktivere vildtype-RAFs ved hjælp af RAF-Co-aktiverings analysen. A) et diagram, der illustrerer RAF-Co-aktiverings analysen. (B) kinase-døde RAF-mutanter med syreholdigt NTA-motiv blev co-udtrykt med katalysis-kompetent Craf-modtager i 293t-celler, og aktiviteten af ERK1/2 i 293t transfectanter blev målt ved anti-PHOSHO-ERK1/2 immunoblot. De fleste kinase-døde RAF-mutanter undtagen BRAF (V471F/∆ NVTAP), der har en meget høj dimer affinitet/stabilitet, krævede Co-ekspression af eksogene RAF-modtager for at tænde ERK signalering. Resultaterne i dette tal er blevet rapporteret tidligere15,22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Mål den relative dimer affinitet/stabilitet for RAF-mutanter ved hjælp af den gratis split der-analyse. A) et diagram, der illustrerer den gratis split der-analyse. (B-D) Denne af BRAF (V600E) varianter er nødvendig for deres katalytiske aktivitet in vivo og in vitro. (B) den monomeriske BRAF (V600E) variant, BRAF (V600E/R509H/AAE) har ingen katalytisk aktivitet in vivo, som kan inddrives ved GST fusion. BRAF (V600E) varianter og deres GST-smeltet modparter blev udtrykt i 293T celler, og deres aktivitet blev målt ved anti-phospho-ERK1/2. (C) BRAF (V600E) varianten med lav dimer affinitet/stabilitet, BRAF (V600E/AAE) mistede sin katalytiske aktivitet in vitro ved rensning, som kan reddes af GST fusion. BRAF (V600E) varianter fra B blev renset ved immunopræcipitation, og deres katalytiske aktivitet blev probed ved in vitro-kinaseanalyse som beskrevet i forsøgsprotokollen. (D) den relative dimer affinitet/stabilitet af BRAF (V600E) varianter blev målt ved hjælp af den gratis split der assay som beskrevet i protokollen. (E-G) BRAF mutanter med in-frame sletning af β3-αc loop funktion som dimerer at aktivere Erk signalering. (E) BRAF mutanter med in-frame sletning af β3-αc loop aktivere Erk signalering, når de udtrykkes i celler. BRAF-mutanter blev udtrykt i 293T-celler, og deres aktivitet blev målt som beskrevet i B. (F) BRAF mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet fra E mistede deres katalytiske aktivitet in vitro, som kan reddes af GST fusion. Den in vitro-katalytiske aktivitet af BRAF mutanter og deres GST-smeltet modparter fra E blev målt som i C. (G) BRAF mutanter med in-frame sletning af β3-αc loop har en helt anden dimer affinitet/stabilitet. Den relative dimer affinitet/stabilitet af BRAF mutanter med in-frame sletning af β3-αC loop blev målt som i D. Fejllinjer i D & G repræsenterer s.d. for at vise variansen mellem uafhængige eksperimenter (n = 4). AAE-mutationen af BRAF betyder P622A i APE-motiv, der genererer et ikke-kanonisk APE-motiv. "∆ MLN", "∆ NVTAPT" og "∆ QA" repræsenterer henholdsvis sletninger af aa484-486, aa486-491, aa496-497 i β3-αC loop af BRAF. Nogle resultater i dette tal er blevet rapporteret tidligere15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: Den biologiske ejendom af forskellige RAF mutanter. Den katalytiske aktivitet, allosteriske aktivitet og relativ dimer affinitet/stabilitet for alle RAF-mutanter, der anvendes i dette studie, er opsummeret i denne tabel. "Y" betyder "ja", mens "N" står for "nej". "N*" indikerer, at disse mutanter har katalytisk aktivitet, hvis de er smeltet sammen med GST. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" og "-" repræsenterer henholdsvis "meget stærk", "stærk", "mellemliggende", "svag" og "ingen".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel præsenterede vi tre metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og gratis split der-analyse. Da RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet og allosterisk aktivitet, kan forskellige RAF-mutanter aktivere downstream-signaleringen gennem to særskilte mekanismer13,14,16,17, 18. de konstitutivt aktive RAF-mutanter fosforerer direkte den nedstrøms EFFECTOR Mek, hvorimod de kinase-døde RAF-mutanter udløser downstream-signaleringen ved at Trans aktivere deres vildtype-modparter. Men både konstitutivt aktive og kinase-døde RAF mutanter kræver denne at opfylde deres funktion15,16,17,19,20, og dimer RAF-mutanternes tilbøjelighed afgør ikke blot den katalytiske eller allosteriske aktivitet af RAF-mutanter, men også deres følsomhed over for RAF-hæmmere15,24. In vitro kinase assay, RAF Co-Activation assay og gratis split der assay giver os et sæt af enkle, effektive og pålidelige metoder til at skelne de konstitutivt aktive mutanter fra kinase-døde mutanter samt evaluere deres mulighed for at aktivere downstream-signalering.

In vitro-kinaseanalysen er en klassisk metode til påvisning af proteinkinases katalytiske aktivitet. For at anvende denne metode til måling af den katalytiske aktivitet af RAF-mutanter har vi foretaget nogle betydelige ændringer i reagenser og procedurer15,21,22. Da RAF-familie kinaser fungerer som dimere til phosphorylering af deres substrat, MEK, og deres dimer affinitet/stabilitet er relativt lav, har vi reduceret koncentrationen af vaskemiddel NP-40 fra 1% til 0,25% i buffere til rensning af RAF-proteiner for at forhindre RAF-dimere fra dissociation. Af samme grund har vi også brugt en blid hurtig vask procedure for RAF protein rensning. Disse ændringer er afgørende for påvisning af den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter med meget svag dimer affinitet/stabilitet, som kan identificeres som "kinase-døde" RAF-mutanter ved den klassiske in vitro-kinaseanalyse. Derudover har vi påvist, at GST-fusionen er en god alternativ måde at forhindre RAF-dimere i at dissociere under rensningen i denne analyse15,21,22. Med hensyn til de kinase-døde RAF-mutanter, selv om de er smeltet sammen med GST, udviser de ikke nogen katalytisk aktivitet i denne analyse.

RAF-Co-aktiverings analysen er udviklet af os for at evaluere kinase-Dead RAF-mutanternes evne til at Trans aktivere deres vildtype modstykker13,15,21,22,23 , 25. i denne nye analyse bruger vi N-Terminus TRUNKEREDE RAF-proteiner og har dermed ikke brug for Co-ekspression af aktive RAS-mutanter eller aktivering af RAS, hvilket gør denne analyse meget følsom. Desuden kan den allosteriske aktivator (kinase-Dead RAF mutant) og modtageren (katalysis-kompetent RAF-mutant) i denne analyse let isoleres og renses for at undersøge molekylære hændelser i processen med dimerization-drevet transaktiveringen 13.

Som vi nævnte ovenfor, er den dimer affinitet/stabilitet en nøglefaktor, der regulerer funktionen af RAF familie kinaser og deres mutanter, og bestemmer også deres følsomhed over for RAF-hæmmere13,14,15, 16,17,18,24. Men den dimer affinitet/stabilitet af RAF familie kinaser og deres mest sygdomsrelaterede mutanter er meget lav. For at måle denne parameter, de traditionelle biokemiske assays kræver komplicere eksperimentelle procedurer og avanceret udstyr (såsom spr assay), eller næppe producere pålidelige og reproducerbare data (såsom chromatinimmunpræcipitation assay). I modsætning hertil er den gratis split der assay en enkel, følsom, konsekvent og omkostningseffektiv metode til at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF familie kinaser og deres mutanter15,21, 22af36. Denne analyse kan sonde den subtile forskel af dimer affinitet/stabilitet blandt forskellige RAF mutanter. Som vi rapporterede før15, BRAF (V600E/AAE) har en meget svag dimer affinitet/stabilitet og dens dimere vil være helt brudt ved rensning, selv hvis du bruger en meget blid procedure. Ved hjælp af denne analyse kan vi skelne den svage dimer affinitet/stabilitet af BRAF (V600E/AAE) fra mono BRAF (V600E/AAE/R509H) (figur 3).

Sammenfattende kan dette sæt af praktiske og gennemførlige metoder opfylde kravene til at definere alle sygdomsrelaterede RAF-mutanter og dermed hjælpe os med at udvælge passende strategier til behandling af forskellige RAF-mutant-baserede sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende den behårede celle Leukemia Fellowship for støtte af Yuan Jimin. Dette arbejde blev støttet af Asia fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge-finansierings pris (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF-overgangs tilskuddet (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) og SHF Academic Medicine Forskningstilskud (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15, (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579, (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119, (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26, (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773, (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7, (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6, (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39, (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18, (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154, (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161, (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37, (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116, (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34, (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41, (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461, (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140, (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11, (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293, (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35, (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480, (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36, (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383, (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383, (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61, (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20, (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464, (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588, (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4, (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6, (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29, (4), 477-493 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics