実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

Cancer Research

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Summary

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。

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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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Abstract

急速に加速した線維全腫(RAF)ファミリーキナーゼは細胞生物学において中心的な役割を果たし、その機能不全は癌および発達障害につながる。疾患関連のRAF変異体の特徴付けは、これらの疾患を治療するための適切な治療戦略を選択するのに役立ちます。最近の研究では、RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、これは二層化によって厳しく規制されている。ここでは、触媒およびアロステリック活性とRAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を決定するための実用的かつ実行可能な方法のセットを構築した。まず、バッファー内の洗剤濃度を低減し、緩やかなクイックウォッシュ手順を利用し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合を採用して、RAFダイマーの解離を防ぐことで、古典的なインビトロキナーゼアッセイを修正しました。浄化。これにより、構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を適切に測定することができる。第二に、N末端切り捨てられたRAFタンパク質を用いてキナーゼ死死性RAF変異体のアロステリック活性を評価する新規RAF共活性化アッセイを開発し、現在のプロトコルにおける活性Rasの要件を排除し、より高いレベルを達成した。感度。最後に、我々は、従来の共免疫沈殿アッセイと比較して、より信頼性が高く、敏感である様々なRAF変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を定量的に測定するために、ユニークな相補的な分割ルシフェラーゼアッセイを生成しました。要約すると、これらの方法には、(1) ユーザーフレンドリーな利点があります。(2)高度な機器なしで効果的に行うことができる。(3) 費用対効果が高い。(4)高感度で再現性が高い。

Introduction

RAFファミリーキナーゼは、RAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの重要な構成要素であり、RASからのシグナルを伝達してミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MEK)1、2、3、4を活性化します。キナーゼのこのファミリーは、細胞の増殖、生存および分化に重要な役割を果たし、その変化は多くの疾患、特に癌5、6、7、8を誘発する。近年、ゲノムシーケンシングは、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード9、10、11のシグナル伝達において異なる特性を示す多くの疾患関連RAF変異体を同定した。RAF変異体の慎重な特徴付けは、RAF変異体がRAS/RAF/MEK/ERKカスケードの信号出力を変化する方法の分子メカニズムを理解するのに役立ち、最終的には様々なRAF変異体駆動疾患を治療するための適切なアプローチを選択する。

RAFファミリーキナーゼは、CRAF、BRAF、およびARAFの3つのメンバーを含み、同様の分子構造を有するが、下流シグナル伝達1、2、3、4を活性化する能力が異なる。これらのパラログの中で、BRAFは、その構成的にリン酸化されたNtA(N -t erminal acidic)モチーフ12、13、14、ARAFが最も低いのに対して、最も高い活性を有する。その非正規APEモチーフ15から生じる活動.これは、疾患におけるRAFパラログの異なる突然変異周波数を説明するかもしれません: BRAF>CRAF>ARAF.さらに、同じRAFパラログ内で、異なる部位の突然変異が異なる方法で下流シグナリングを引き起こす可能性があり、これはRAFファミリーキナーゼの調節に複雑さの別の層を追加します。最近の研究は、すべてのRAFキナーゼが触媒およびアロステリック活性の両方を持っていることを実証しています13,14,16,17,18.構成的にアクティブなRAF変異体は、MEKをリン酸化することによって下流シグナリングを直接オンにするのに対し、キナーゼ死んだRAF変異体は、左右のダイマライゼーションを通じて野生型の変異体を転移させ、MEK-ERKシグナリング16を活性化することができます。 、19、20.ダイマーアフィニティ/安定性は、キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を決定するだけでなく、構成的に活性なRAF変異体15、21の触媒活性に影響を与える重要なパラメータです。22.ダイマー親和性/安定性の高いキナーゼ死血RAF変異体は、内因性野生型AFを直接15をトランス活性化することができ、中間ダイマー親和性/安定性を有するものは、活性Rasまたは機能する野生型RAF分子の上昇レベル13,15,20,21,23.同様に、構成的に活性なRAF変異体は、ダイマー依存的な方法でMEKをリン酸化し、弱いRAFダイマー15を破壊する免疫沈殿時にインビトロでの触媒活性を失う。 21、22。ダイマーアフィニティ/安定性はまた、それらの阻害剤に対するRAF変異体の感受性を決定し、そしてRAF阻害剤24の耐性に正に相関する。したがって、疾患関連のRAF変異体を特徴付けるためには、触媒およびアロステリック活性、およびダイマー親和性/安定性を測定する必要がある。

近年、当研究室等では、RAFファミリーキナーゼとその変異体を特徴付ける様々な方法を開発しています。当研究室や他者の経験によると、以下の3つのアッセイは、疾患関連のRAF変異体を定義する上で有利であると考えています:(1)構成的に触媒活性を容易に検出できるインビトロキナーゼアッセイアクティブRAF変異体15;(2)キナーゼ死存RAF変異体13、15、21、22、23のアロステリック活性を測定するための信頼性が高く便利な方法であるRAF共活性化アッセイ25;(3)従来の共免疫沈殿アッセイとは対照的に、RAF変異体の相対的な薄暗い親和性/安定性を測定する上ではるかに高い感度を有し、かつ高度な装置なしで行うことができる無料のスプリットルシフェラーゼアッセイSPR(Surface PラスモンRエソナンス)分析15、22などの定量分析方法と対照的である。 これら3つのアッセイを組み合わせることで、疾患関連のRAF変異体が下流シグナル伝達をどのように変化させるかを容易に理解し、このRAF変異によって引き起こされる疾患を治療するための適切な治療戦略を利用することができます。

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Protocol

RAF変異体の触媒活性を測定するためのインビトロキナーゼアッセイ

  1. ギブソンアセンブリまたは従来の分子クローニング法を用いて、C終産でFLAG(DYKDDK)タグを用いてRAF変異体(図1A)をコードするベクターを構築する。
    1. FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに配列全体を挿入し、製造プロトコルに従います。PCR反応には以下の条件を使用してください: (1) 95 °C, 2 分;(2) 95 °C, 30 s;(3) 59 °C, 30 s;(4) 68 °C、3分;(5) 20サイクル(2~4);。(6)4°Cホールド。
      注:クローニング用PCRプライマー:5-AAATTAACGACTCACTATAGGCCCCCCCCCCCCCC-3および5-CAGCGGGTッタACGCGCCCTCTA-3。
    2. RAF 変異型コーディング シーケンスの上流に GST コード シーケンスを挿入し、ステップ 1.1.1 で説明したのと同じ方法を使用して、GST 融合 RAF 変異体をエンコードするベクトルを生成します。
    3. トランスフェクションの前にDNAシーケンシングによってすべてのベクターを検証します。
  2. 5 x 105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート中のプレート293T細胞/ウェルトランスフェクションの前日。細胞密度が2日目に80〜90%の合流点に達すると、トランスフェクション試薬(材料表)の製造プロトコルに従って、STEP 1.1からステップ1.1からFLAGタグ付きRAFキナーゼまたはその変異体をコードするベクターでトランスフェクトする。
  3. トランスフェクション後24時間培養培地を交換してください。
  4. トランスフェクション後48時間培養培地を吸引し、400 μL/ウェルのリシスバッファーを追加します(25 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 1 mM エチレンディアミンテトラセチン酸 (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補味し、氷上の細胞を溶解する。
    注:溶解バッファー中のNP-40の濃度は、インビトロで適度なダイマー親和性/安定性を有するRAF変異体の触媒活性を検出するために重要である。リシスバッファーに高濃度の洗剤または強い洗剤が入ると、RAFダイマーが壊れ、RAFキナーゼまたはその変異体の触媒活性が殺される可能性があります。
  5. 細胞を1.5mLチューブに移し、4°Cで10分間12,000xgでスピンダウンして細胞の破片を枯渇させます。
  6. クリーンな全細胞のサンプル1サンプルにつき300μLを1.5mLチューブに移し、抗FLAGアフィニティビーズのサンプル1個につき20μLを加え、1時間冷たい部屋(4°C)で回転させます。また、以下に説明するように免疫ブロットによるRAF変異体の発現および活性(ホスホ-ERK1/2)を検出するために、クリーンな全細胞リサートの試料当たり40μLを取り除く。
  7. 抗FLAGビーズをライシスバッファーで一度洗浄し、キナーゼ反応バッファー(20 mM HEPES、10 mM MgCl2、0.5 mM Na3VO 4、0.5 mM DTT、pH 7.2)を加え、20 μLのキナーゼ反応混合物(MEK1(K97A)および10μMの2μGを加える。アクション バッファ)をサンプルごと使用します。
    注:ビーズ洗浄は穏やかに迅速に完了する必要があり、残留バッファーはキナーゼ反応混合物を追加する前に完全に吸引する必要があり、このステップでのすべての操作は、コールドルームで4°Cで行われるべきです。
  8. 室温(25°C)でキナーゼ反応を10分間インキュベートし、インキュベーション中に1分おきに指でキナーゼ反応を含むチューブを反転させます。
  9. 5x SDSサンプルバッファの5 μLを追加します(375 mMトリス·HCl、9%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50%グリセロール、0.03%ブロモフェノールブルー)を試料1枚につきキナーゼ反応を停止し、90°Cで5分間加熱します。
  10. 0.1%SDSで9〜12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)でサンプルを実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、免疫ブロットによるサンプル中のホスホ-MEKおよびRAF変異体のレベルを検出します。
    注:ホスホ-MEKはまた、γ32 P-ATP組み込みを用いて定量することができる。簡単に言えば、10 μM γ32P-ATP をキナーゼ反応バッファーに添加し、次いで標準的な自動無線撮影、蛍光化、または液体シンチレーションカウント技術を用いてPAGE分離後にリン酸化MEKの量を定量化する。適切。

2. キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を評価するためのRAF共活性化アッセイ

  1. RAF受信機(非リン酸化性NtAモチーフ、AAFFを持つCRAFキナーゼドメイン)またはキナーゼ死死RAF活性化剤(リン酸化模倣NtAモチーフ、SSDD、DDEEまたはDGEEを含むRAFキナーゼドメイン)をコードするベクターを構築する(図1A)手順 1.1 で説明します。
  2. RAF受信機とキナーゼ死死RAF活性化剤またはステップ1.2および1.3に記載されているタンパク質の1つをコードする単一のベクターの両方をコードする2つのベクターを持つトランスフェクト293T細胞。
  3. トランスフェクション後24時間で培養培地を交換し、48時間で293Tトランスフェクタントを収穫し、ステップ1.4および1.5に記載されているように細胞全体のリサテスを調製する。
  4. 清潔な全細胞リサートを室温(25°C)で素早く5x SDSサンプルバッファーで混合し、90°Cで5分間沸騰させます。
  5. 0.1%SDSで9〜12%PAGEで沸騰した全細胞リザートサンプルを実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ホスホ-ERK1/2のレベルを検出し、免疫ブロットによってタンパク質を制御します。

3. RAF変異体の相対ダイナー親和性/安定性を測定するための無料のスプリットルシフェラーゼアッセイ

  1. ステップ1.1に記載されているように、NlucのN終点(ホタルルシフェラーゼのN終点、aa2-416)またはC-終点(ホタルルシフェラーゼのC-終点、aa398-550)に融合したFLAGタグ付きRAF変異体をコードするベクターを構築する。
  2. ステップ1.2で説明するように、異なるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体をコードするベクターのペアを持つトランスフェクト293T細胞。
  3. トランスフェクション後24時間で、無色媒体(すなわち、フェノール赤色のないDMEM)を用いてウェル当たり2x105の細胞密度でクリスタルブラック画像プレートに293T細胞トランスフェクトを再プレートする。
  4. 24時間後、D-ルシフェリン(0.2mg/mL)を293T細胞トランスフェクタントに添加し、30分間インキュベートし、マルチ検出システム(材料表)を用いてルシフェラーゼシグナルを測定する。
  5. ルシフェラーゼ信号を測定した後、培地を吸引し、293Tトランスフェクタントをライシスバッファーで吸引し、ステップ1.4および1.5に記載されているように細胞全体のリサテスを調作する。
  6. 0.1%SDSで9〜12%PAGEで全細胞リサートサンプルを実行し、ステップ2.5に記載されている抗FLAG免疫ブロットによるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の発現レベルを検出する。293TトランスフェクタントにおけるNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の相対発現レベルは、それらの免疫ブロットからの画像Jを用いて定量される。
  7. Nluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の発現レベルに従って293T細胞トランスフェクタントのルシフェラーゼ信号を正規化する。簡単に言えば、これは、ステップ3.6からNluc-RAF変異体およびCluc-RAF変異体の相対発現レベルによって生ルシフェラーゼ信号を分割することによって達成される。

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Representative Results

RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、疾患関連変異体が異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達をオンにすることを可能にする 、18.構成的に活性なRAF変異体は基質を直接リン酸化し、キナーゼ死死性RAF変異体は野生型の変異体を通じてその機能を果たす。図1Bに示すように、構成的に活性なRAF変異体(例えば、調節性脊椎(R-spine)変異体(BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M)、およびARAF(DGEE/L358M)13、23、25,26、BRAF(V600E)、およびBRAF(NVTAP)およびキナーゼ死死RAF変異体(触媒脊椎(C脊椎)融合BRAF(NVTAP/V471F)15)は、293T細胞で発現するとERKを活性化する。したがって、細胞内でERKシグナル伝達を活性化するRAF変異体の能力は、中程度のダイマー親和性/安定性を有するキナーゼ死変異体の一部がオンであるが、構成的に活性な変異体をキナーゼ死媒由来と区別する標準として機能することができない。アクティブなRasの協力を受けてのみ下流シグナリング。ここで提示した3つの方法は、すべての疾患関連RAF変異体を効果的に特徴付めるのに役立ちます。我々の以前の研究でこれらのアッセイを用いて明らかにされたすべてのRAF変異体の生物学的特性は、表1に要約されている。

構成的に活性なRAF変異体とキナーゼ死血性RAF変異体を区別するために使用できる最初の方法は、インビトロキナーゼアッセイです。このアッセイでは、RAF変異体を免疫沈殿により精製し、キナーゼ死死MEK1(K97A)およびATPを基質としてインビトロで触媒反応を行った。RAF変異体の触媒活性を、免疫ブロットによるキナーゼ反応混合物中のMEK1(K97A)のAL(A ctivation Loop)-リン酸化として測定した。図1Cに示すように、このアッセイは、BRAF、CRAFおよびARAF 13、15、23、BRAF(V600E)9、およびBRAF(NVTAP)15のR-脊椎変異体の触媒活性を効果的にプローブすることができる。しかし、融合C脊椎を有するキナーゼ死性BRAF(V471F/+NVTAP)15のそれではない。しかし、ARAF R-spine変異体(ARAF(ARAF/L358M)のような弱いダイマー親和性/安定性を有する構成的に活性なRAF変異体の触媒活性(図1C、レーン4)、変更されたダイマーインターフェースを有するCRAFおよびARAF変異体(CRAF(DDEE/L397M/R401H)、ARAF(DGEE/L358M/APE/R362H))15、22(図1D、E)は、精製中にダイマーが壊れたため、このアッセイを用いてプローブされない場合があります。強いまたは高濃度の洗剤を含むバッファーで行う。弱いダイマー親和性/安定性を有するRAF変異体の触媒活性の損失を避けるために、我々は通常、これらの変異体をGST(gルタチオンS -tランスフェラーゼ)と融合し、以前は親和性/安定性が強いダイメリックタンパク質である。 これらのRAF変異体15、22(図1E)の触媒活性を救うことができるインビトロキナーゼアッセイを行う。一般に、ほとんどのRAF変異体は、このアッセイを用いて構成的に活性またはキナーゼ死んだ変異体として分類することができる。

ここで説明した2番目の方法は、キナーゼ死死性RAF変異体13、15、21、22、23のアロステリック活性を評価するために使用できるRAF共活性化アッセイである。,25.BRAF(V471F/+NVTAP)15のような非常に高いダイマー親和性/安定性を有するいくつかのキナーゼ死んだRAF変異体は、細胞で発現すると内因性RAF分子を直接活性化することができるが(図1B、レーン7)、ほとんどキナーゼ死んだRAF変異体は、野生型のAOFを転行させるためにアクティブなRasの協力を必要とする。しかし、アクティブラスはERKシグナリングの直接アクティベーターであり、その導入はアクティブERKの基礎レベルを増加させる。アクティブなRasの干渉を避けるために、このアッセイでN-終産切り捨てRAF変異体を使用しました(図2A)。図2Bに示すように、BRAFのキナーゼ死体変異体、 CRAF、および酸性NtAモチーフとC脊椎融合(BRAF(V471F、aa431-766)、CRAF(DDEE/V363F、aa323-648)、およびARAF(DGEE/V324F、aa284-606))はアロストアクチベーターとして機能し、アロストアクチベーターとして機能しました。293T細胞で共発現すると、非リン酸化性NtAモチーフ(CRAF受信機、CRAF(AAFF、aa323-648))を用いてCRAFの触媒活性を引き起こす。対照的に、非常に高いダイマー親和性/安定性を持つキナーゼ死性BRAF変異体(V471F/+NVTAP、aa431-766)は、CRAF受信機の共発現なしでも内因性AFをトリガすることによってERKシグナリングをオンにした。全体的に、このアッセイは、すべてのキナーゼ死血性RAF変異体のトランス活性化能を評価するために使用することができる。

RAFファミリーキナーゼの二量化は、下流のMEK-ERKシグナル伝達を活性化する能力を調節するだけでなく、RAF阻害剤に対する感受性を決定する15歳,16歳,20歳,22歳,24歳,27歳,28歳,29歳,30歳,31歳,32歳.この経路間の他のタンパク質とタンパク質の相互作用とは対照的に33歳,34歳,35歳、RAFファミリーキナーゼとその変異体の二量化は比較的弱く、共免疫沈殿などの従来の生化学アッセイを用いて評価することは困難である。この問題を解決するために、我々は最近、RAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を測定するための無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを開発しました。15歳,22歳,36歳.に示すように図 3A、RAFキナーゼドメイン(BRAFの場合はaa431-766、CRAFの場合はaa323-648、ARAFのaa284-606)は、それぞれN-ターミナス(aa2-416)またはC-ターミナス(aa398-550)と融合し、フチルフェラーゼ(aa398-550)を組み立てます。RAFの偏光にルシフェラーゼ。このアッセイにおけるルシフェラーゼの活性は、RAFダイマーの量と直接相関する。このアッセイは非常に敏感であり、RAF変異体の非常に弱い偏光を検出することができます。前に報告したように15歳発生性BRAF(V600E)はダイマーとして機能し、ダイマー界面におけるArg-to-His変異(R509H)と非単一APE変異(APEモチーフのP622A)のみがそのダイラ化を完全に廃止し、それによって触媒を遮断することができる。アクティビティ (図 3B).インビトロキナーゼアッセイを用いることで、改変されたAPEモチーフのBRAF(V600E/AAE)バリアントであるBRAF(V600E/AAE)が、ダイマーインターフェースのArg-to-His変異では、BRAF(V600E/R509H)が活性化時に触媒を失ったことがわかりました(図 3C)は、前者のバリアントが後者よりもはるかに少ないダイマーアフィニティ/安定性を持っていることを示唆しています。これらのBRAF(V600E)変異体の傾向を直接測定するために、我々は、無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを実施し、これらの変異体はBRAF(V600E/より高いBRAF(V600E)と全く異なるダイマー親和性/安定性を持っていることを確認しました。R509H) BRAF(V600E/R509H/AAE) よりブラフ(V600E/R509H/AAE)図 3D).モノマーブラフ(V600E/R509H/AAE)によって生成されるルシフェラーゼ信号は、非トランスフェクトされた293T制御()図 3D、左パネルレーン5)は、このアッセイが非常に低い背景を有することを示す。無料のスプリットルシフェラーゼアッセイの有効性をさらに決定するために、次に、私たちおよび他の人によって同定されたβ3-αCループのフレーム内欠損を伴う発因性BRAF変異体群の相対ダイマー親和性/安定性をこのアッセイを用いて測定した。グループ15歳,37歳,38歳.我々が知っているように、これらの変異体のすべては293T細胞で発現したときにERKシグナル伝達を活性化するが、図 3E)、彼らはインビトロでかなり微差触媒活性を示した(図 3F).BRAF(Aa484-486デル)およびBRAF(Aa486-490デル))は、免疫沈殿物による精製時に非常に活性であった。 一方、BRAF(Aa486-491デル)とBRAF(QA(aa496-497デル))は、同じ条件下で触媒活性を失いました。GST融合によって救出される可能性があります。また、キナーゼデッドバージョンのBRAF(NVTAP)、BRAF(V471F/+NVTAP)は、細胞内で発現した場合に内因性AFを活性化する強い効力を示した(図 1Bレーン 7)。これらのデータは、BRAF変異体のこのグループは、BRAF(※NVTAPT)およびBRAF(+QA)よりもBRAF(+NVTAP)よりも高いBRAF(+NVTAP)との間で全く異なるダイマー親和性/安定性を持つことを示唆している。確かに、無料のスプリットルシフェラーゼアッセイの結果は、完全に私たちの推論をサポートしました(図 3G).我々のデータをまとめると、無料のスプリットルシフェラーゼアッセイは、RAF変異体の相対的なダイナー親和性/安定性を測定する信頼性の高い方法であることを示しています。

Figure 1
図 1: インビトロキナーゼアッセイを用いてRAF変異体の触媒活性をプローブする。(A) 本研究で用いたRAF変異の概略図。(B)構成的に活性およびキナーゼ死死RAF変異体の両方が細胞で発現するとERKシグナル伝達を活性化することができる。293T細胞は、異なるRAF変異体をコードするベクターでトランスフェクトされ、ERKの活性は抗ホスホ-ERK1/2免疫ブロットによって検出された。(C) 低ダイマー親和性/安定性を有する構成的に活性なRAF変異体およびキナーゼ死死性RAF変異体は、免疫沈殿による精製時にインビトロでMEKをリン酸化することができない。BにおけるRAF変異体を抗FLAGビーズを用いて精製し、その触媒活性をプロトコルに記載のインビトロキナーゼアッセイを用いて調べた。(D-E)低ダイマー親和性/安定性を有する構成的に活性なRAF変異体のインインビトロ触媒活性は、GST融合によって救出することができる。(D) 構成的に活性なRAF変異体およびそのGST融合の変異体は293T細胞で発現し、その活性は抗ホスホ-ERK1/2免疫ブロットによって測定された。(E)DにおけるRAF変異体を免疫沈殿により精製し、そのインビトロ触媒活性をプロトコルに記載のインビトロキナーゼアッセイを用いて調べた。RAF R脊椎変異体:BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M)、およびARAF(DGEE/L358M)。「NVTAP」はBRAFにおけるaa486-490の削除を表します。ARAFのAPE突然変異は、ARAFで正規APEモチーフを生成するA475Pを意味する。「KD」は全文の「キナーゼドメイン」を表します。BRAF(KD)はBRAFのaa431-766フラグメントを意味し、CRAF(KD)およびARAF(KD)はそれぞれCRAFのaa323-648フラグメントとARAFのaa284-606フラグメントを表します。この図の結果は、以前に15,22報告されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: RAF共活性化アッセイを用いて、野生型AOFをトランス活性化するRAF変異体の能力を評価する。(A) RAF共活性化アッセイを示す図。(B)酸性NtAをモチーフにしたキナーゼ死死RAF変異体を293T細胞において触媒能性CRAF受信機と共発現し、293TトランスフェクタントにおけるERK1/2の活性を抗phosho-ERK1/2免疫ブロットにより測定した。非常に高いダイマー親和性/安定性を有するBRAF(V471F/+NVTAP)を除くほとんどのキナーゼ死んだRAF変異体は、ERKシグナリングをオンにするために外因性RAF受信機の共発現を必要としました。この図の結果は、以前に15,22報告されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを使用して、RAF変異体の相対ダイナー親和性/安定性を測定します。(A) 無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを示す図。(B-D)BRAF(V600E)変異体の二量化は、生体内およびインビトロにおける触媒活性のために必要とされる。(B) 単調なBRAF(V600E)バリアント、BRAF(V600E/R509H/AAE)は、GST融合によって回収できる生体内の触媒活性を有しない。BRAF(V600E)変異体およびそのGST融合は293T細胞で発現し、その活性は抗ホスホ-ERK1/2によって測定された。(C) 低ダイマー親和性/安定性を有するBRAF(V600E)バリアント、BRAF(V600E/AAE)は、GST融合によって救出することができる精製時にインビトロで触媒活性を失った。B由来のBRAF(V600E)変異体は免疫沈殿により精製され、その触媒活性は、プロトコルに記載されているインビトロキナーゼアッセイによって調べた。(D) BRAF(V600E)変異体の相対ダイナー親和性/安定性は、プロトコルに記載されている無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。(E-G)β3-αCループ機能をダイマーとしてフレーム内で取り消したBRAF変異体は、ERKシグナリングを活性化します。(E) β3-αCループのフレーム内欠失を伴うBRAF変異体は、細胞内で発現するとERKシグナル伝達を活性化する。BRAF変異体は293T細胞で発現し、その活性はBに記載されているように測定した。(F) Eからの低ダイマー親和性/安定性を有するBRAF変異体は、GST融合によって救出することができるインビトロでの触媒活性を失った。BRAF変異体およびE由来のGST融合対応物質のインインビトロ触媒活性は、Cのように測定された。 (G) β3-αCループのフレーム内欠失を伴うBRAF変異体は、ダイマー親和性/安定性が全く異なる。β3-αCループのフレーム内欠失を有するBRAF変異体の相対ダイナー親和性/安定性をDと同様に測定した。D&G の誤差バーは、独立した実験間の分散を示す s.d. (n = 4) を表します。BRAFのAAE突然変異は、非正規APEモチーフを生成するAPEモチーフのP622Aを意味します。「及びMLN」、「及び」および「QA」は、BRAFのβ3-αCループにおけるaa484-486、aa486-491、aa496-497の欠損についてそれぞれ表す。この図のいくつかの結果は、以前に15.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Table 1
表 1:様々なRAF変異体の生物学的性質。この研究で使用されるすべてのRAF変異体の触媒活性、アロステリック活性および相対的なダイマー親和性/安定性をこの表に要約した。「Y」は「はい」を意味し、「N」は「いいえ」を意味します。「N*」は、これらの変異体がGSTと融合した場合に触媒活性を有することを示す。"++++"、"++"、"++"、"++"、"+"、"-"、"-"は、それぞれ"非常に強い"、"強い"、"中間"、"弱い"、"なし"を表します。

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Discussion

本稿では,インビトロキナーゼアッセイ,RAF共活性化アッセイ,無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを含む疾患関連RAF変異体を特徴付けるための3つの方法を紹介した.RAFキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有するので、様々なRAF変異体は、2つの異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達を活性化することができます。18.構成的に活性なRAF変異体は、下流のエフェクターMEKを直接リン酸化し、キナーゼ死んだRAF変異体は野生型の変異体を通じて下流シグナル伝達を引き起こす。しかし、構成的に活性なRAF変異体とキナーゼ死んだRAF変異体の両方は、その機能15、16、17、19、20、およびダイマーを満たすためにダイマ化を必要としますRAF変異体の傾向は、RAF変異体の触媒またはアロステリック活性だけでなく、RAF阻害剤15,24に対する感受性も決定する。インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および無料のスプリットルシフェラーゼアッセイは、キナーゼ死んだ変異体から構成的に活性な変異体を区別し、それらを評価するためのシンプルで効果的で信頼性の高い方法のセットを提供します。ダウンストリームシグナリングをアクティブにする機能。

インビトロキナーゼアッセイは、タンパク質キナーゼの触媒活性を検出する古典的な方法である。RAF変異体の触媒活性を測定するためのこの方法を採用するために、試薬および手順15、21、22にいくつかの重要な改訂を行った。RAFファミリーキナーゼは、基板MEKをリン酸化するダイマーとして機能し、そのダイマー親和性/安定性が比較的低いため、RAFタンパク質を精製するためのバッファー中の洗剤NP-40の濃度を1%から0.25%に低減しました。解離からRAFダイマー。同じトークンによって、我々はまた、RAFタンパク質精製のための穏やかな迅速な洗浄手順を使用しています。これらの変化は、古典的なインビトロキナーゼアッセイによって「キナーゼ死んだ」RAF変異体として識別される可能性がある非常に弱いダイマー親和性/安定性を有する構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を検出するために重要である。さらに、我々は、GST融合は、このアッセイ15、21、22の精製中にRAFダイマーが解離するのを防ぐための良い代替方法であることを実証しました。キナーゼ死んだRAF変異体に関しては、それらがGSTと融合されていても、このアッセイにおいて触媒活性を示さない。

RAF共活性化アッセイは、キナーゼ死んだRAF変異体が野生型の変異体13、15、21、22、23を転移する能力を評価するために開発された,25.この新しいアッセイでは、N-終産切り捨てられたRAFタンパク質を使用し、活性RAS変異体の同時発現や活性RAS活性化を必要とせず、このアッセイを非常に敏感にします。さらに、このアッセイにおけるアロステリック活性化剤(キナーゼ死存RAF変異体)および受信機(触媒能性RAF変異体)は、ダイメレーゼーション駆動トランス活性化の過程で分子事象を調査するために容易に単離および精製することができる。13.

前述したように、ダイマーアフィニティ/安定性は、RAFファミリーキナーゼとその変異体の機能を調節する重要な要因であり、また、RAF阻害剤13、14、15に対する感受性を決定する。 16,17,18,24.しかし、RAFファミリーキナーゼおよびその最も疾患関連変異体の薄膜親和性/安定性は非常に低い。このパラメータを測定するために、従来の生化学アッセイでは、実験手順や高度な装置(SPRアッセイなど)を複雑にしたり、信頼性の高い再現性のあるデータ(免疫沈殿アッセイなど)をほとんど生成できない必要があります。対照的に、無料のスプリットルシフェラーゼアッセイは、RAFファミリーキナーゼおよびその変異体15、21の相対的なダイナー親和性/安定性を測定するためのシンプルで、敏感で、一貫性があり、費用対効果の高い方法です。 22、36。このアッセイは、様々なRAF変異体間のダイマー親和性/安定性の微妙な違いを調知ることができる。我々は15前に報告したように、BRAF(V600E/AAE)は非常に弱いダイマーの親和性/安定性を有し、そのダイマーは非常に穏やかな手順を使用しても精製時に完全に壊れます。このアッセイを用いれば、BRAF(V600E/AAE/AAE)の弱いダイマー親和性/安定性と単光BRAF(V600E/AAE/R509H)の弱いダイマーアフィニティ/安定性を区別することができます(図3)。

要約すると、この実用的で実行可能な方法のセットは、すべての疾患関連RAF変異体を定義する要件を満たすことができるので、様々なRAF変異体駆動疾患を治療するための適切な戦略を選択するのに役立ちます。

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Disclosures

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

Acknowledgments

著者らは、元ジミンの支援のための毛深い細胞白血病フェローシップを認めたい。この研究は、アジアファンドがん研究(AFCR2017/2019-JH)、デューク-NUSクーブリッジファンディングアワード(デューク-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRFブリッジ助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(N研究助成金(AM/TP011/2018)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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References

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