9-페난트롤에 민감한 양이온 전류의 특성화를 위해 갓 분리된 인간 분리기 평활근 세포의 준비 및 활용

Immunology and Infection
 

Summary

우리는 2 단계 효소 절차를 채택하는 인간 적인 오줌 방광 견본에서 단 하나 신선하게 고립된 분리근 평활근 세포의 제조를 위한 방법을 기술합니다. 얻어진 생존 가능한 DSM 세포는 생리학적 및 약리학적 특성을 밝히기 위해 기재된 암포테리신-B 패치-클램프 전기생리학을 포함하는 다양한 단일 세포 기술에 의해 연구될 수 있다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Malysz, J., Rovner, E. S., Wake, R., Petkov, G. V. Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents. J. Vis. Exp. (155), e59884, doi:10.3791/59884 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detrusor 평활근 (DSM) 세포는 궁극적으로 소변 저장 및 무효를 용이하게 하는 오줌 방광 벽 안에 존재합니다. 실행 가능하고 신선하며 단리된 DSM 세포의 준비는 후속 기능 및 분자 연구를 위한 최적의 세포를 제공하는 중요한 기술적 과제를 제시합니다. 본 명세서에서 성공적으로 10년 이상 우리 그룹에 의해 사용된 이 방법은 개방된 방광 수술에서 얻은 인간 소변 방광 표본의 해부를 설명하고 DSM 조각의 효소 2단계 치료와 새로 단리된 DSM 세포를 얻기 위한 기계적 삼각술을 설명합니다. 초기 단계는 점막 (요로 신경 통, 라미나 프로피아 및 근육점)에서 DSM 층 (또한 근육 프로피아로 알려짐)와 인접한 결합, 혈관 및 지방 조직을 분리하는 해부를 관련시킵니다. DSM은 공칭 Ca2+-함유 해부/소화 용액(DS)에서 조각(2-3 mm x 4-6mm)으로 절단됩니다. DSM 피스는 다음으로 옮겨지고 단계당 30-45분 동안 ~37°C에서 파파인 및 콜라게나아제함유 DS로 별도로 처리한다. 효소가 함유된 소 혈청과 불을 닦은 파이펫으로 삼합회를 포함하는 DS로 세차한 다음, 조각들은 단일 DSM 세포를 방출한다. 갓 단리된 DSM 셀은 이온 채널의 패치 클램프 전기 생리학적 및 약리학적 특성화에 이상적입니다. 특히, 우리는 TRPM4 채널 차단기 9-페난트롤이 암포테리신-B 천공 패치 클램프 접근법으로 기록된 전압 단계 유발 양이온 전류를 감소시킨다는 것을 보여준다. DSM 세포는 또한 단세포 RT-PCR, 마이크로어레이 분석, 면역세포 화학, 사이투 근접 결찰 분석 및Ca2+ 화상 진찰과 같은 그밖 기술에 의해 공부될 수 있습니다. 단일 DSM 세포를 활용하는 주요 장점은 단하나 세포 특성과 직접적으로 관련이 있다는 것입니다. 갓 분리된 인간 DSM 세포에 대한 연구는 오줌 방광에 양이온 투과성을 포함하여 다양한 이온 채널의 특성을 특성화하는 중요한 통찰력을 제공하고 DSM 세포 특성 및 조절 메커니즘을 해명하는 데 있어 금본위제로 계속 될 것입니다.

Introduction

Detrusor 평활근 (DSM) 세포는 오줌 방광에 있는 가장 풍부한 세포 모형을 구성하고 궁극적으로 이완과 수축을 통해 소변 저장 그리고 무효화를 각각 통제합니다. DSM 세포는 인접한 결합 조직, 신경 프로세스, 간질 세포 및 그밖 세포모형1과결합하는 평활근 묶음 형성합니다. 오줌 방광 기능에 있는 DSM 세포의 역할의 현재 이해는 다단계 통합 접근을 통해 달성되었습니다. 각 실험 방법 - 시험관 내 단하나 세포, 시험관 내 복근 번들을 포함하는 조직 스트립, 또는 생체 내 결정 (예 : 세포 측정 및 무효 기능 평가)을 기반으로하는 각 실험 방법은 DSM의 생리적 및 약리학적 특성에 대한 중요하고 구체적인 통찰력을 제공합니다 (자세한 내용은 리뷰1,2,3,4,5,6 참조). 그러나, 단리한 단 하나 세포에게서 장악된 결과의 해석은 단 하나 세포 모형 자체에 구체적으로 기인하는 결론을 허용합니다. 이러한 실현은 전체 두께의 오줌 방광 표본으로부터 신선하게 단리된 DSM 세포를 얻기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하는 원동력이 되었습니다. 다른 많은 세포 유형과 달리, 평활근 세포는 그들의 전기 생리학적 및 수축성 특성의 특정 변화를 포함하는 그들의 기본 표현형의 손실로 인해 안정적으로 배양될 수 없다7,8. 이 사실은 생리활성이 신선하게 단리된 DSM 세포에 대한 연구의 중요성을 더욱 강화한다.

1980년대 후반과 1990년대 초반, Isenberg의 그룹(독일)은 기니피그 요로 방광9,10,11,12,13 (표 1)에서얻은 갓 단리된 DSM 세포에 대한 일련의 전기 생리학적 연구를 발표했다. 이 방법은 중요한 세포를 얻는 것을 돕고 다른 사람들이 따르는 초기 지침으로 봉사한 2개의 중요한 관측을 강조했습니다. 그들은 1) 효소 처리 전에 Ca2+-free 용액 /배지로 분리 된 DSM 조각을 미리 치료하고 2) 콜라게나아제 함유 용액으로 조직 소화를 하였다. 이러한 두 가지 중요한 단계는 DSM 세포 해리 절차의 모든 후속 변이체에 통합되었다(표1). 현재, 우리 그룹은 2 단계 순차적 파파인 콜라게나아제 해리 접근법을 채택하고 있습니다. DSM 조각은 먼저 파파인을 함유한 효소 용액으로 처리한 다음 콜라게나아제 타입 II를 동일한 용액(DS, 해부/소화 액액)에 용해시켰습니다. 이러한 접근법은 기니피그, 돼지, 랫트, 마우스 및 중요한 인간을 포함하는 다양한 종으로부터 단일 DSM 세포를 산출한다(표1).

단일 DSM 세포는 다중 분자 생물학 및 생리실험을 위한 근원을 제공합니다. 지금까지, 면역 세포화학으로 연구된 단백질 및 mRNA 발현, 또는 RT-PCR/qRT-PCR 측정결과, 대형 전도도 전압 및 Ca2+-활성화(BK), 소형 전도도 Ca2+-활성화 K+ 유형 3(SK3)을 포함한 다양한 이온 채널에 대한 높은 수준의 검출이 밝혀졌습니다.), 전압 게이트 K+ (Kv),L 형 전압 게이트 Ca2 + (Cav),및 과도 수용체 전위 메라스타틴 유형 4 (TRPM4) 채널뿐만 아니라 Na / Ca2 + 교환기 14,15,16,17,18, 19,20,21,22. 그들은 모두 DSM 흥분성, 세포 내 Ca2+ 수준 및 수축성을 제어하는 것으로 생각됩니다. 기니피그, 마우스, 쥐 또는 인간 DSM세포에서 직접 수행되는 패치 클램프 전기 생리학적 접근법은 L형 Cav,K v (Kv2.x Kv),SK, BK 및 TRPM4 채널17, 19,20,21,22,24, 25의 생물 물리학 및 약리학적 특성에 대한 직접적인 데모를 제공했습니다. ,26,27,28,29,30,31. 기존의 전셀 전압 클램프, 천포전압 클램프 및 단일 채널 레코딩(셀 부착, 내부 및 외부 구성)이 이러한 접근 방식에 포함되었습니다. 추가적으로, 현재 클램프를 사용하여 DSM의 막 전위 기록은 표적-참여 약리학 약제제가 세포 흥분성을 변경한다는 증거를 제공했다. 예를 들어, TRPM4 억제제 9-페난트롤은 인간, 기니피그 및 랫트 오줌 방광19,20,22,31로부터수득된 DSM 세포에서 과분극을 유도한다. 다양한 전기 생리학적 방법 중에서, 암포테리신-B(및 니스타틴, 그라니시딘 및 β-에신) 천공 패치 클램프 기록은 본질적인 세포내 신호 분자 및 경로를 보존함으로써 주요 이점을 제공한다. 오직 낮은 분자량 양이온 및 더 적은 정도까지,Cl-하지만 Ca2+를 포함하는 단백질 또는 신호 분자는 -암포테리신-B 또는 nystatin32에의해 형성된 혈장 막 기공을 통해 투과성된다. 천포 된 패치 클램프 실험의 성공적인 결과는이 기술에 고유 한 몇 가지 일반적인 변수에 따라 달라집니다. 여기에서, 우리는 우리 그룹이 년 동안 성공적으로 사용 한 암포테리신-B를 활용하는 절차의 세부 사항을 설명15,22,33,34,35,36,37,38,39.

틀림없이, 비 선택적 양이온 채널은 DSM 세포에서 가장 잘 이해되는 채널 유형 중 하나이다. 비선택적 양이온과 같은 채널의 첫 번째 보고서는 1993년으로 거슬러 올라갑니다. 웰너와 Isenberg11에 의해 논문은 이온 투과성의 다음과 같은 순위 순서를 표시하는 33 pS 스트레치 활성화 단일 채널을 설명: K+>Na> >Cs>>>>바2+>Ca2+ 및Gd3+에 의한 채널 활성 억제, 비선택적 양이온 채널의 일반적인 억제제. 거의 10년 후, Thorneloe와 Nelson40은 전체 세포 기록을 사용하여 Gd3+에의해 억제된 마우스 DSM 세포에서Na+ 투과성 양이온 전류를 설명했습니다. 비선택적 양이온 채널의 분자 정체성과 생체 물리학적 특성이 결정되기 때문에 이 연구 분야의 향후 조사가 보장됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜은 비선택적 양이온 채널 전류의 기록을 위해-Cs+,TEA+및 니페디핀을함유하는 세포내 및 파이펫 세포내 용액을 사용하여 생리학적 및 약리학적으로 완화되는 Kv 및 Cav 전류-비선택적 양이온 채널의 전기생리학적 조사에 계속 유용하게 사용될 것이다. 우리는 기니피그, 래트 및 인간 DSM 세포에서 TRPM4 채널 차단제 9-페난트롤에 의한 전세포 양이온 전류의 억제 정도를 결정하기 위해 이러한 특이적 프로토콜을 활용하였으며,19,20,22.

종합하면, 인간 오줌 방광으로부터 갓 단리된 단일 DSM 세포를 얻기 위한 방법은 패치 클램프 기술, Ca2+-이미징, 면역세포 화학, 현장 근위 소송 분석, 단세포 RT-PCR/qRT-PCR, 마이크로어레이, RNA-sq-sq-sq 의 다양한 구성을 사용하여 전기 생리학적 조사에 매우 적합한 실용성 세포를 제공한다. 암포테리신-B 천공 패치 클램프 방법의 사용은 다른 구성과 달리 기본 셀 환경을 보존합니다. 여기에 설명된 특정 조건을 사용하여 수행될 때, DSM 세포에서K+및 Ca2+ 전류의 기여를 부정하도록 설계되고, 전압 단계 유도 전류는 생물물리학 및 약리학적 특성화에 적합한 비선택적 양이온 전류의 특성을 표시한다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 방법은 테네시 대학 건강 과학 센터의 기관 검토 위원회 (멤피스, TN, IRB # 17-05714-XP)와 사우스 캐롤라이나 의과 대학 (찰스턴, SC, IRB # 00045232)에 의해 승인되었습니다. 승인된 절차는 전체 두께 오줌 방광 견본 (>1 cm by >1 cm)를 허용합니다 - 점막, 배뇨 평활근 및 혈청을 포함한 모든 층을 포함하는 것은 또한 부착된 혈관 및 지방 조직입니다) - 방광의 외과 적 부분 적인 추출을 겪고 있는 환자 기증자에게서 집합될 수 있습니다. 환자 기증자는 성인 (지금까지 연구 된 연령 범위: 25 받는 사람 87 세), 남성 또는 여성, 또는 과민성 방광의 증상 없이 (미국 비뇨기과 협회 I-PSS 점수에 의해 분류 로41). 외과 적 절차는 비뇨 기 암에 대한 급진적 인 방광 절제술을 포함한 다양한 의료 조건을 포함, 및 선암. 이러한 경우, 수집 된 오줌 방광 표본은 종양 부위에서 멀리 떨어져 있습니다.

1. DSM 조직의 해부 및 점막이없는 DSM 조각의 준비

  1. 차가운 해부/소화 용액으로 채워진 단단히 밀봉 된 용기에 수술실에서 실험실에 도착한 전체 두께 오줌 방광 표본을 검사하십시오 (DS의 조성을 위한그림 1표 2).
    참고 : 시편은 일반적으로 실험실에 도착하기 전에 하룻밤에 몇 시간에서 차가운 DS에 보관됩니다. 더 긴 저장을 위해 DS(표 2)는1 mM CaCl2로보충됩니다.
  2. 인간의 전체 두께 DSM 표본(점막, DSM 및 혈청을 포함한 모든 층을 포함)을 얼음으로 차가운 DS로 제거하고 헹구어 부착된 파편과 혈액을 씻어냅니다.
  3. 오줌 방광 견본, 점막이 위쪽을 향하고 아래로 세로사, 실리콘 enantiomer 코팅(재료의 테이블)얼음 차가운 DS로 채워진 150mm 직경 원형 접시에(그림 1B).
  4. 인접한 지방 조직, 혈관, 상피 (요로 테륨) 및 근육 점막을 미세자극체와 집게를 사용하여 날카로운 해부에 의해 시편에서 제거하십시오.
  5. 점막이 없는 여러 조각(길이~2~3mm, 너비 4~6mm)(그림1C)을잘라냅니다.

2. 갓 분리 된 단일 DSM 세포를 산출하는 DSM 조각의 효소 해리

  1. 파페인 및 디티오트레이톨을 함유하는 DS(DS-P, 표 2)를함유한 1 내지 2 mL의 DS를 함유하는 튜브에 3 내지 6DSM 조각을 넣고 30-45분 동안 DS-P에서 DSM 조각을 배양하여 ~37°C에서 가끔 씩(10-15분마다 한 번) 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다.
    참고 : 효소 처리를위한 온도를 최적으로 제어하기 위해 조직 조각및 효소 용액이있는 튜브는 순환 가열 된 수조에 연결된 물로 채워진 유리 조직 챔버(그림 1D)또는 고정밀 온도 제어 식 흔들리는 수조(그림 1E)에배치됩니다.
  2. 튜브에서 DS-P를 제거하고, 얼음 차가운 DS로 DSM 조각을 간략하게 씻고, 튜브에서 차가운 DS를 버리고 튜브 바닥에 DSM 조각을 남겨 둡습니다.
  3. DS를 함유하는 콜라게나제 타입 II(DS-C, 표 2)를DSM 조각으로 튜브에 1~2 mL를 넣고 부드럽게 섞는다; ~37°C에서 25-40분 동안 배양하고 튜브를 가끔 씩 흔들어 줍니다(매 10-15분).
  4. DS-C를 버리고 효소 처리 된 DSM 조각을 얼음 차가운 DS로 5-10 회 씻으십시오.
  5. 마지막 세척 후, 튜브 내부에 DS 용액을 두고; 단일 DSM 셀을 방출하기 위해 여러 번 화재 광택 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 삼중화.
  6. 분산된 DSM 세포를 함유한 DS 용액 몇 방울을 유리 바닥 챔버 또는 커버슬립에 놓고, 세포가 부착될 수 있도록 적용 후 최소 5분 후에 현미경(20x 또는 40x 목표 사용)으로 품질을 시각적으로 검사합니다. 바닥에.
  7. 전기 생리학적 실험을 위해 갓 분리된 DSM 세포를 즉시 사용하거나 DS를 함유한 튜브에 보관하거나 사용 전까지 얼음이나 냉장고에 DS를 함유한 튜브에 보관하십시오(일반적으로 최대 8시간의 준비).
    참고 : 동일한 준비 내에서 세포의 품질은 매우 실행 가능한에서 과다 소화, 죽은 DSM 세포에 이르기까지 다양합니다(그림 2). 순차적 파파인 콜라게나아제 방법이 매우 많은 수의 생존 불가능한 세포를 산출할 때, 제제는 폐기되고, DSM 조각의 새로운 소화가 수행되지만 인큐베이션 간격이 감소한다. 절차가 DSM 조각의 후속 소화를 위해 너무 적은 DSM 세포를 초래하는 경우에, 배양 간격은 증가됩니다. α 평활근 액틴에 대한 양성 면역 반응성은 DSM 세포의 동일성을 확인한다(도3).

3. 암포테린-B 천공 전체 셀 전압 패치 클램프 기술을 사용하여 DSM 셀의 전압 단계 유도 양이온 전류 기록

  1. 피펫 0.25-1 mL의 셀 서스펜션을 유리 바닥 챔버상에 거꾸로 된 현미경의 무대에 앉고 세포가 유리 바닥에 부착되도록 합니다.
  2. 적어도 45 분 동안 배양 한 후, 욕조에서 DS를 제거하고 E 용액(표 2)을과급하여 인렛 튜브를 통해 중력에 의해 보조된 용액 흐름이 DS를 새로운 용액으로 대체하고 진공 폐기물 용기에 연결된 출구 튜브는 챔버 용액을 제거하고 오버플로우를 방지합니다. E 용액에는 K+ 전류를 억제하는 테트라에틸라모늄 (TEA+) 및 세슘 (Cs+) 이온이 포함되어 있습니다.
  3. 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에서 암포테리신-B의 작업 재고 솔루션을 준비하십시오 (DMSO의 10 μL 당 1 mg). 완전히 파포테리신 분말을 용해하기 위해, 초음파 (적어도 15 분) 및 잘 용액을 소용돌이.
    참고 : 이 단계는 일반적으로 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 DSMO의 30-40 μL에서 암포테리신-B 3-4 mg을 용해하는 데 10 분 미만이 걸립니다. 암포테리신-B의 더 많은 양은 일반적으로 튜브에 존재하는 암포테리신-B 고체 입자의 혼합 및 불완전한 용해화를 위한 더 긴 간격을 초래하는 더 많은 DSMO 용매를 요구한다.
  4. 파이펫 용액(용액 P, 표 2)에서암포테리신-B의 스톡 용액을 용해하여 200-500 μg/mL의 최종 농도를 얻었다. 이 단계는 파이펫 용액에서 최적의 혼합 및 암포테리신-B 침전물 형성의 예방을 보장하기 위해 단계당 ~ 30 ~60 분 동안 고속 설정 (8-10/10)에서 광범위한 초음파 처리 및 소용돌이가 필요합니다.
    참고 : 암포테리신-B는 시간이 지남에 침전하고 빛에 민감합니다. Amphotericin-B를 포함하는 작업 파이펫 용액은 용해도를 검사하고, 파이펫 충진 전에 손으로 혼합하고, 어둠 속에서 유지된다.
  5. 여러 패치 전극, 화재 폴란드어 전극 팁을 당기고 (필요한 경우) 치과 왁스로 팁을 코팅합니다.
  6. 용액에 전극을 잠깐 담그어 암포테리신-B 없이 파이펫 용액(용액 P, 표 2)으로패치 전극의 팁을 채웁니다.
  7. 암포테리신-B를 함유한 동일한 파이펫 용액으로 전극을 채웁니다.
  8. 전극을 패치 클램프 앰프 헤드스테이지에 연결된 홀더에 장착합니다.
  9. 마이크로 조작기사용으로 전극을 세포외 용액의 표면 바로 아래에 놓아 전극의 끝이 잠기게 합니다.
  10. 전압 클램프 모드에서 는 유지 전위를 0 mV로 설정하고 상업용 앰프의 파이펫 오프셋 다이얼을 사용하여 전류를 0 pA로 조정합니다(재료표).
  11. 상용 획득 소프트웨어의 멤브레인 테스트 창/기능을 사용하여 전극 저항을 결정합니다(재료표). 활성화하려면 도구>멤브레인 테스트>재생 또는 소프트웨어의 바로 가기 아이콘을 클릭합니다. 결정된 전극 저항은 2~5MΩ 범위여야 합니다.
    참고: 증폭기의 상용 수집 소프트웨어 또는 씰 테스트 옵션에 제공된 멤브레인 테스트 기능은 전압 단계를 반복적으로 적용하여 전극 저항을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
  12. 마이크로 조작기로 선택한 DSM 셀을 향해 전극을 전진시키면서 전극 저항을 계속 모니터링합니다(그림4A).
    참고 : 가능한 DSM 셀로 간주되려면 셀은 스핀들 모양의 길쭉한 형태, 셀 주위의 잘 정의 된 후광, 선명한 가장자리 및 반 수축체 (뱀) 모양을 보여주어야합니다.
  13. 전극으로 세포 표면을 만지면 - 멤브레인 테스트 기능으로 측정된 전극 저항의 급격한 증가로 나타남-튜브를 통해 전극 홀더에 부드러운 급속음압을 가하여 기가 씰을 형성한다. 이것은 기가 씰의 형성또는 전극과 플라즈마 막 사이의 매우 긴밀한 접촉에 도움을 전극으로 세포막을 당기는 전극의 끝에서 생성 된 음압을 초래한다(그림 4B).
  14. 기가 씰이 형성되면 상업용 앰프의 빠르고 느린 다이얼을 조정하여 파이펫 커패시턴스를 보정하고 멤브레인 테스트 기능을 사용하여 기가 씰 안정성(누수 전류)을 모니터링합니다.
  15. 시간을 허용, 일반적으로 30-60 분, 암포테리신-B는 파이펫 아래로 확산하고 모공을 형성하는 플라즈마 멤브레인에 삽입하는 것은 주로 단원 양이온에 선택적. 이 단계에서 멤브레인 테스트 기능을 통해 기가 씰을 계속 모니터링합니다. 세포 천공이 증가함에 따라 멤브레인 테스트 기능으로 측정된 정전 용량 과도(그림 4B와 도 4C를 비교하여 각각 유효 셀 천공 없음 및 유효 셀 천공)의 진폭도가 증가합니다.
  16. 패치 천공이 최적(일반적으로 50MΩ 미만의 안정적인 직렬 저항에 의해 판단됨)이 면, 증폭기의 셀 정전 용량 및 직렬 저항을 위해 다이얼을 조정하여 정전 용량 과도 를 취소합니다. 직렬 저항 보상도 이 때 수행될 수있다(도 4D).
  17. 일단 지정된 프로토콜에 의해 유발된 안정적인 전압 단계 유도 양이온 전류가 관찰되면, 수퍼퓨전으로 테스트하기 위해 화합물 또는 생리학적 조건을 적용하고 제어, 테스트 상태 및 세척(가능한 경우)에 대한 응답을 기록합니다. 상용 획득 소프트웨어.
    1. DSM 셀을 -64 또는 -74 mV로 잡고 -94에서 +96 또는 +106 mV로 400 또는 500 ms의 10mV 단위로 전압을 스테핑하고 유지 전위로 되돌리는 일상적인 전압 단계 프로토콜로 전류를 기록합니다.
      참고: 멤브레인 전위 값은 14 mV의 액체 접합 전위에 대해 조정됩니다(P 및 E 용액 사용, 표 2). 액체 접합 전위는(Tools>정션 전위)를클릭하고 용액 이온 성분의 농도를 입력하여 상업적 수집소프트웨어(재료 표)에서얻어진다. 램프 프로토콜을 사용하여 현재 기록을 얻을 수도 있습니다.
    2. 사전 추가 제어, 테스트 조건 및 세척을 위해 실험 기록 전류 동안 연속 ~1분 간격으로 전압 프로토콜을 실행합니다.

4. 데이터 분석 및 시각화

  1. File>Open Data를 클릭하고 열 때 관심 있는 파일을 선택하여 제어, 테스트 조건 및 세척을 위한 상용 데이터 분석 소프트웨어(자료표)에서기록된 파일을 엽니다.
    참고: 분석의 경우 일반적으로 각 조건에 대해 세 개의 파일(각 파일은 단일 프로토콜 실행에 대한 단일 추적 집합을 포함)을 열고 분석합니다. 응답은 이후에 각 조건에 대한 평균 응답을 얻기 위하여 평균됩니다. 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어에는 사용자가 지정한 여러 테스트 실행을 자동으로 수집하고 대안으로 사용할 수 있는 단일 출력 파일에 대해 평균화하는 옵션이 포함되어 있습니다.
  2. 각 전압에서 측정된 전류 트레이스에 대해 마지막 200ms에 대한 평균 응답을 구합니다. 선택한 지속 시간 간격은 전압 단계 전류 활성화의 정상 상태 수준을 반영합니다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.
    1. 상용 분석소프트웨어(재료 표)에서분석을 위해 관심 있는 파일을 선택합니다.
      참고: 소프트웨어는 가장 최근에 가져온 파일을 활성 표시 창에 배치합니다. 열린 파일은 전압 단계 프로토콜로 얻은 일련의 중첩 추적을 표시합니다. 기본적으로 활성 창 내에 4개의 커서(강조 표시된 추적에 대한 x 및 y 값 표시)가 표시됩니다.
    2. 분석 범위가 200 ms가 되도록 하기 전에 200 ms의 간격으로 400 또는 500 ms 전압 단계 및 커서 1의 끝에 커서 2를 배치하여 분석 범위를 선택합니다.
    3. 분석>빠른 그래프>IV(또는 IV 바로 가기 아이콘)를 클릭하여 각 전압에 대한 응답을 얻을 수 있습니다(데이터를 생성하기 전에 프롬프트 창에서 y축(전류) 신호 영역 옵션의 경우"커서 1..2""평균"이선택됨을 확인합니다. 확인을 클릭하여 I-V 그래프를 생성하고 Windows>결과에액세스하여 볼 수 있는 결과 열 시트에 데이터를 배치합니다.
    4. 4.2.1 - 4.2.3 단계를 반복하여 추가 파일을 분석합니다. 분석을 클릭합니다>빠른 그래프>IV 또는 IV 아이콘 바로 가기를 클릭하고, 차후 대신 추가를 선택하여 추적을 처리할 때 결과 시트에 추가 데이터를 추가합니다.
    5. 관심 있는 열을 선택하고 CTRL+C를 눌러 데이터를 스프레드시트에 복사하여 복사하고 CTRL+V를 붙여넣습니다. 파일>로 저장을클릭하여 (*.rlt) 형식으로 상용 분석소프트웨어(재료 표)에결과 워크시트를 저장합니다.
  3. 각 셀에 대해 세 가지 조건에 대한 응답을 사전 추가 제어에 대한 최대 전압 단계 값(수식에 따라 응답/응답제어-최대)으로정규화하고 응답을 전압 관계 대 전류(또는 전류 밀도) 값으로 그래프로 그래프로그립니다(그림 6).
    1. 워크시트 프로세서에서 제어, 테스트 조건(이 예에서는 9-페난트롤)을 위한 전류(pA) 또는 전류 밀도(pA/pF)로 평균 응답을 결정하고 각 전압 단계에서 세척을 수행합니다.
    2. 수식 다음의 사전 추가 제어에 대해 최고 전압(그림 6의+96 mV)에서 얻은 최대 제어 응답에 의해 각 조건의 각 전압(제어, 9-페난트롤 및 세척)에 대한 값을 나눈값: 조건(x)에 대한 정규화된 응답(x)/응답제어-최대(x)에 대한 응답 제어 최대(x).
  4. 요약 분석을 위해 시각화를 위해 그래픽 프로그램(예: GraphPad 프리즘)에 쉽게 복사할 수 있는 형식으로 데이터를 정렬합니다.

Representative Results

DSM 조각의 효소 해리는 패치 클램프 전기 생리학 및 면역 세포 화학과 같은 기능 및 분자 연구에서 일상적으로 사용되는 건강한 신선하게 분리 된 DSM 세포를 제공합니다. 그림 1은 해부 단계를 요약하고 효소 처리 단계의 온도 제어에 사용되는 설정을 시각화합니다. 도 2는 상이한 환자 공여자로부터 각각 3개의 인간 비뇨기방표본으로부터 수득된 DSM 세포의 밝은 필드 이미지를 도시한다. 건강한 단일 DSM 세포는 스핀들 모양의 형태, 선명한 잘 정의된 가장자리, 세포 주위의 잘 정의된 후광, 현미경으로 볼 때 반수축(뱀과 같은) 모양을 특징으로 합니다(그림 2의흰색 화살표로 표시된 DSM 셀 참조). 그(것)들은 또한 무스카린 성 주작동근 카르바콜 또는 높은 K+ (60 mM) 응용 프로그램과 같은 수축 자극제에 반응합니다. DSM 세포는 그들의 정체성을 확인하는 α-평활근 액틴에 대한 양성 면역 반응성을 나타내고있다(도 3).

DSM 셀은 이온 채널 특성의 패치 클램프 전기 생리학적 조사에 이상적입니다. 여기서, 우리는 파이펫 및 세포외 용액을 이용한 파포테리신-B 천공 패치 클램프 기록 방법을설명한다(표 2)전압 단계 유도 양이온 채널을 최적으로 기록한다. 채택된 특정 조건에서 Cs+/TEA+ 및 니페디핀이 있는 Kv 및 L형 Ca2+ 전류의 봉쇄는 이러한 이온 성분이 전체 셀 전압 유발 전류에 대한 기여도를 제거하도록 보장했습니다. 도 4도 5는 각각, 암포테리신-B 천공 패치 클램프 방법 및 대표적인 전체 세포 전류의 실험 단계를 3개의 상이한 인간 DSM 세포에서 유도된 전압 단계 또는 램프 프로토콜로 측정하고, 각각 상이한 환자 공여자로부터. 레코딩은 현재 진폭 및 바깥쪽 정류 측면에서 일정 정도의 가변성을 표시합니다. 추가 실험은 9-페난트롤, TRPM4 채널 억제제, 음성 및 양전압에서 인간 DSM 양이온 전류를 효과적이고 가역적으로 억제한다는 것을 밝혀냈다(그림6). 9-페난트롤에 민감한 전류 성분은 양전압 및 외부 정류에서 더 강한 억제를 나타낸다(그림6C).

Figure 1
그림 1: 효소 해리에 사용되는 단처리 평활근(DSM) 조각 및 설정의 제조를 초래하는 해부 단계의 요약. 도시된 이미지는 :(A)전체 두께의 인간 오줌 방광 표본은 얼음 차가운 DS에서 외부 수술 재료로 열린 방광 수술에서 제공된,(B)부분적으로 해부된 DSM 층으로 고정한 후,(C)DSM 층에서 잘라낸 가변 치수의 DSM 조각은 효소 소화(작은 조각) 또는 다른 실험 조사(더 큰 조각)를 위해 준비됨,(D, E)DSM 조각의 효소 소화에 사용되는 대체 설정 (1) 튜브를 통해 물로 채워진 큰 유리 조직 챔버로 연결된 온도 제어 순환 수조, 해부/소화 용액(DS, DS-P 또는 DS-C, 표 2)으로제조된 튜브용 고무 홀더, DSM 조각 및 효소 용액을 포함하는 플라스틱 튜브 및 디스플레이에 연결된 온도프로브(D)또는 (2) DSM 조각 및 효소가 있는 홀더 와 튜브를 포함하는 대형 수분 충전 온도 제어욕조(EE) ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 순차적 파파인 콜라게나아제 소화 방법을 사용하여 얻어진 인간 갓 단리된 DSM 세포의 대표적인 밝은 필드 이미지. (A-F) 디스플레이는 천포 된 패치 클램프 기록을 시도하기위한 적합한 후보로 간주 가능한, 생리 활성 DSM 세포의 이미지입니다. (G, H) 실행 불가능한 또는 과소화 된 세포의 이미지; 이러한 세포는 패치 클램프 실험을 피했다. 패널의 흰색 및 검은색화살표(A-H)는패치 클램프 기록을 시도하기 위해 각각 실행 가능하고 실행 불가능한 것으로 간주되는 DSM 셀을 가리킵니다. 패널(A, C 및 G)의검은 색 화살표는 DSM 형태가 결여된 셀 조각(원형 조각) 또는 작은 셀을 가리키며(H)세포가 창백하고 확장된 것처럼 보입니다. 심상은 3개의 상이한 요로 방광표본(A 및 B: 환자-기증자 소스 1개, C 및 D : 환자-기증자 소스 2, 및 E-H: 환자-기증자 소스 3)에서 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 면역세포화학 분석에 의한 단일 인간 DSM 세포에서 과도 수용체 전위 메라스테인 유형 4(TRPM4) 채널 및 α-평활근 특이적 액틴 면역반응의 발현. (a)인간 DSM 세포에서 TRPM4 채널 단백질 발현의 면역세포화학적 검출을 나타내는 공초점 이미지. 적색 염색(왼쪽 아래)은 TRPM4 채널 단백질을 나타낸다. 파란색 (DAPI) 염색은 세포 핵을 검출 (왼쪽 상단); 녹색 염색은 α-평활근 액틴 (α-SMA, 오른쪽 상단)을 나타냅니다. 병합된 이미지(오른쪽 아래)는 세 이미지 의 중복을 보여 줍니다. (B)단리된 인간 DSM 세포에서 TRPM4 특이적 경쟁 펩티드(CP)가 존재할 때 TRPM4 채널 단백질 발현의 면역세포화학적 검출의 감쇠를 예시하는 공초점 이미지. 청색(DAPI) 염색은 세포 핵(왼쪽 상단)을 나타낸다; 녹색 염색은 α-평활근 액틴 (α-SMA, 오른쪽 상단)을 위한 것입니다; 병합된 이미지(오른쪽 아래)는 세 이미지 의 중복을 보여 줍니다. 결과는 4명의 환자로부터 분리된 DSM 전체 조직 또는 다중 DSM 세포를 사용하여 4개의 개별실험에서 확인되었다. 이미지는 Hristov 외 에서 온 것입니다.(2016)22 허가와 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 인간 DSM 세포의 기가 씰 형성 및 암포테리신-B 천공에 관여하는 단계의 개략적 그림. 도시된 것은 피펫 및 DSM 세포를 함유하는 암포테리신-B의 공간 위치와 함께 상용 획득소프트웨어(표)에서수득된 멤브레인 시험에 대한 관련 반응과 함께 전압 단계(이 예에서 -10 또는 -20 mV)를 변경하여 저항을 결정한다. 구성은 다음과 같습니다:(A)전극을 가진 전지 접근법 전,(B)파포테리신-B 함유 피펫(빨강점으로 표현되는 암포테리신-B)을 세포 표면에 포지셔닝하여 얻은 기가-씰 형성 후,(C)기가 씰 형성 후 ~45분 후에 나타난 온셀 구성은, 이 시점에서 파포테리신-B는 파이프테와 그 분자의 프램을 삽입하여 그 분자를 삽입한 피펫과 그 분자의 삽입된 혈장 에 삽입된 피펫과 그 분자의 삽입된 페펫을 삽입하였다. (C)와 동일한 구성을 가진(C)(D)그러나 정전 용량 과도는 전셀 정전 용량 및 계열 저항을 위한 다이얼을 사용하여 취소된 앰프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 인간 DSM 세포에서 암포테리신-B 천공 패치 클램프 방법으로 기록된 전세포 양이온 전류. (A)전압 단계 프로토콜의 다이어그램은 -94에서 +96 mV까지의 -74 mV 및 전압 단계의 유지 전위를 10 mV 단위로 수행한 다음 -74 mV로 반환하는 것을 보여줍니다. (B, C) 대표적인 전류 트레이스는 2개의 상이한 인간 DSM 세포로부터의 전류 밀도 전압 플롯과 함께, 각각 (A)에 기재된 전압 단계 프로토콜로 수득된 상이한 요란성 방광 표본/환자 공여자로부터의 것이다. (D)램프 프로토콜로 얻은 전류 추적의 예(0.21 mV/ms에서 1초 동안 전압 변화가 -94에서 +116 mV로 전압 변화로 상단 인셋에 그래픽으로 표시되며, 보유 전위는 -94 mV였다). 패널(B-D)의오른쪽에는 그래프가 기록된 각 DSM 셀에 대한 전류 밀도 전압 관계를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 인간 DSM 세포에서 TRPM4 채널 차단제 9-페난트롤 매개 전압 단계 유도 양이온 전류의 억제. (a)도시된 대표적인 전류는 도 5A에 기재된 전압-스텝 프로토콜로 측정된 대표적인 전류로 제어, 9-페난트롤, 및 세척아웃을 위한 것이다. (B)7개의 다른 환자-기증자로부터 7개의 DSM 세포에서 조절, 9-페난트롤 및 세척에 대한 전압 대 정규화된 반응의 요약. (C)9-페난트롤에 민감한 성분에 대한 차전류는(B)에도시된 대조군으로부터 9-페난트롤(30 μM)의 존재시 값을 빼서 얻은 것이다. (B)(C)의데이터는 SEM에 대한 오차 막대와 함께 수단으로 표시되며, * 각 전압에서 제어 대 9-페난트롤의 비교에 대한 유의성(p<0.05, 페어링된 학생 시험)을 묘사한다. 패널(A)(B)Hristov 외22에서 재현 하 고 허가 와 함께 사용 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

절차 세부 정보 참조
기니 피그 Ca2+-free 배지로 헹구는 DSM 조각 (mM에서 : 100 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2PO4,5 MgCl2,20 포도당, 50 타우린, 측정 된 pCa = 6 (또는 1 mM) 조각으로 절단한 다음 일반적으로 90-120 분 (30 분 의 KO0 기간) 효소 배지 (m3: 10 M3의 KO0 기간)로 처리했습니다. 20 타우린, 5 피루베이트, 5 크레아틴, 10 mM HEPES, pH 7.4, 1 mg/ml 콜라게나아제, 0.2 mg/ml 프라나제 E, 1 mg/ml 지방산 프리 알부민, pCa=4.2 (63 mM) 또는 3.7 (20m)에 메탄설포산으로 조정. 단일 DSM 세포는 크래프트 브루헤(KB)-배지(mM: 85 KCl, 30K2PO4,5 MgSO4,5 Na2ATP, 5 K-피루바테, 5 크레아틴, 20 타우린, 5 베타-OH-부티레이트, 1 mg/ml 지방산 무부 알부민, KOH로 pH 7.2로 조정)에 저장하였다.
대체 방법: DSM 조각은 Ca2+-free 배지 (mM)에서 10 분 동안 헹구어 : 140 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgCl2,10 포도당, 20 황소 자리, 5 HEPES, NaOH로 pH 7.4로 조정. 그런 다음 동일한 Ca2+-프리 배지에 배양한 DSM 조각을 5 mg% 콜라게나제, 2 mg% 프로나제 및 100 μM CaCl2를 2x20 분 교반으로 보충하였다.
클록너 & 이센버그 (1985)13,34 클록너 & 이센버그 (1986)35 슈나이더 외 (1991)10 본브 & 이센버그 (1992)9 바이델트 & 이센베르크 (2000)36 무어 외 (2004)14
기니 피그, 랜드 레이스 돼지, 인간 Ca2+-free Krebs 용액에서 5 분 동안 미리 배양 한 DSM 조각은 조각으로 자르고 0.5-2 mg / ml 콜라게 나아제 타입 I 및 0.1-0.5 mg / ml pronase를 36 °C에서 20-30 분 동안 지속적으로 저어 주는 Ca2+- 무료 Krebs 용액으로 자릅니다. 경우에 따라, 소화 된 조각은 무딘 기울어진 파이펫에 의해 또는 세포를 산출 할 때까지 회전하여 더 교반되었다. 단리된 세포는 변형된 크렙스 용액(Klockner & Isenberg13에기재됨)에 저장되었고 일반적으로 3시간 이내에 사용하였다. 크렙스 용액의 조성물은 (mM): 140Na+, 6K+2+, 1.2 Mg2+ +152.4 Cl- -10 포도당, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 트리스와 함께하였다. Ca2+-free 솔루션의 경우, Ca2+ 및 Mg2+는 크렙스 솔루션에서 생략되었습니다. 이노우에 & 브래딩 (1990)37 이노우에 & 브래딩 (1991)38 나카야마 & 브래딩 (1995)39,40
인간의 Ca2+-무료 HEPES 티로드 용액에 배치 된 DSM 조각 (mM : 105.4 NaCl, 20.0 또는 22.3 NaHCO3,3.6 KCl, 0.9 MgCl2,0.4 NaH2PO4,19.5 또는 4.9 HEPES, 5.4 또는 5.5 포도당, 4.5 또는 5.5 Na-pyruvate) DSM 조각으로 잘라. 효소 용액에 담근 DSM 조각 (0.7 mg/ ml 콜라게나제 타입 I, 0.7 mg/ ml 파파인, 1 mg/ml 알부민)을 4°C에서 밤새 도록 담근 다. 스트립을 36.5°C에서 15~30분 동안 가열하고, 세척하고 신선한 용액으로 부드럽게 삼각화하였다. CA2+에 저장된 분리된 세포는 HEPES Tyrode의 용액을 함유하거나 실험에 즉시 사용되었습니다. 몽고메리 & 프라이 (1992)24 갈레고와 튀김 (1994)41 프라이 외 (1994)42 수이 외 (2001)43 우 외 (2002)44
기니 피그 DSM은 PSS의 조각으로 잘라 (mM에서 : 137 NaCl, 5.4 KCl, 2 MgCl2,2 CaCl2,0.42 KH2P04, 4.17 NaHCO3,10 포도당, 10 HEPES, NaOH와 pH 7.4). 다음 소화 용액에 10 분 동안 배치 된 DSM 조각 (mM : 80 Na-글루타메이트, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 포도당, 2 MgCl2,및 0.2 CaCl2)동일한 용액을 함유하지만 1 mg / ml 콜라게나제 2, 1 mg / ml 트립신 억제제 (때로는 생략), 1 mg / ml 무지방 소 알부민, 35 ° 35 ° 30 분에서 70 분 ~ 30 분 ~ 30 분동안 유리병으로 옮겼습니다. 단일 DSM 세포는 칼슘 및 효소 없이 동일한 용액에서 파스퇴르 피펫을 통해 삼각측에 의해 수득되었다. 삼조 후,Ca2+ (1 mM)를 첨가하고 세포를 4°C에서 저장하였다. 세포는 항상 같은 날에 사용되었다. Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner 외 (1997)26 Petkov 외 (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49
기니피그, 마우스, 쥐, 인간 프로토콜은 Ca2+-free 소화 용액에서 날카로운 해부 후 2 단계 효소 해리 처리를 사용합니다 (mM : 80 Na-글루타메이트, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 포도당 및 2 MgCl2). 첫째, DSM 조각은 해리 액에서 1 mg / ml dithioerythreitol, 1 mg / ml dithioerythreitol 및 1 mg / ml 소 혈청 알부민 (mM : 80 모노 나트륨 글루타민산 나트륨, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2,10 HEPES 및 10 포도당, NaOH를 사용하여 pH 7.3으로 조정한 다음 DSM 조각을 1-5 mg/ml 콜라게나아제 XI(시그마) 또는 콜라게나아제타입 2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민, 0 또는 1 mg/ml 트리프신 억제제 및 100 μpsin 을 함유하는 소화 용액으로 옮겼습니다. 배양 후, 소화된 조직을 효소 및Ca2+없이 소화 용액으로 여러 번 세척한 다음 부드럽게 삼각측량하여 단일 평활근 세포를 산출하였다. Petkov 외.(2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov 외 . (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et 23 Smithet 2014 20 Hristov 외 (2016)22 리 외. (2017)56 야로츠키 외 (2018)57

표 1: 다양한 종의 요로 방광으로부터 단일 DSM 세포를 분리하는 데 사용되는 효소 접근법의 요약.

솔루션 유형 컴포지션(mM)
DS (해부 / 소화 솔루션) 80 Na-글루타민산염, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2,및 11 포도당, pH를 7.4로 조정 (10 M NaOH 포함)
DS-P (파파인 함유 DS) 1-2 mg/ml 파파인, 1 mg/ml 디티오트레이톨 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 DS
DS-C (콜라게나아제 함유 DS) 1-2 mg/ml 콜라게나아제 타입 II, 1 mg/ml 소 혈청 알부민, 0 또는 1 mg/ml 트립신 억제제 및 100-200 μM Ca2+를 함유한 DS 용액
P (파이펫) 110 CsOH, 110 아스파르트산, 10 NaCl, 1 MgCl2,10 HEPES, 0.05 EGTA 및 30 CsCl, pH는 CsOH로 7.2로 조정되고 암포테리신-B (300-500 μg/ml)로 보충되었습니다.
E (세포 외) 10 테트라에틸암모늄 염화물 (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,10 HEPES, 10 포도당, pH는 NaOH 또는 CsOH와 7.3-7.4로 조정, 0.002-3 (2-3 mM) 니페디피네피네

표 2: 천공 패치 클램프 실험에 사용되는 해부/소화 용액(DS) 및 파이펫 및 세포외 용액의 조성물.

Discussion

여기에 기술된 절차는 효소 소화를 이용한 전체 두께 인간 소변 방광 표본으로부터 실행 가능한, 갓 단리된 DSM 세포의 제조에 관여하는 단계를 설명하고, 암포테리신-B 천공 패치 클램프 접근법을 채택한 TRPM4 채널 억제제 9-페난트롤에 민감한 전체 세포 양이온 전류의 기록에서. 효소 시술은 본 원에서 순차적 파파인 콜라게나아제 소화 방법으로 언급되는 2단계 순차적 노출에 의존한다. DSM 조직은 먼저 공칭 Ca2+-free 조건 하에서 파파인 및 디티오트레이톨(효소 안정화제)으로 처리되고, 낮은Ca2+의존재 하에서 콜라게나제 타입 II에 의해 두 번째 단계에서 뒤따랐다. 평활근 세포에서 낮은 Ca2+ 조건하에서 파파인 소화를 수행하기위한 근거는 1980 년대 후반으로 거슬러 올라갑니다. 파페인으로 제조된 갓 분리된 경동맥 평활근 세포는 가늘고 긴 모양을 나타내고, 생존율(Trypan Blue[ToA)]을 나타내고 수축자극(더 높은Ca2+ 및 히스타민)에 반응하였다65. 수년 후, 이 방법은 DSM 셀의 제조에 적용되었다(표 1참조). 다른 유형이 아닌 콜라게나아제 타입 II의 선택은 DSM을 포함한 평활근 조직에 이상적으로 적합한 비교적 높은 단백질 용해 활성과 관련이 있습니다. 실제로 콜라게나아제 치료만으로도 광범위한 효소 노출(≥60분)53,54를필요로 하는 단일 DSM 세포를 얻을 수 있다. 콜라게나아제 활성은 Ca2+에 의존하며 효소는 Ca2+-free 조건하에서 비활성 상태이기 때문에, DSM 조각의 최적의 효소 소화는Ca2+ 66의존재를 필요로 한다. 우리의 경우, DS-C는 100-200 μM [Ca2++ ](표 2)를함유하고 있다. 효소 처리 후, 소화된 DSM 조각은 효소 또는Ca2+없이 차가운 DS로 여러 번 부드럽게 세척하여 조직에 결합된 효소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 DS는 DSM 세포 무결성을 보존하고 남은 파파인 또는 콜라게나아제의 효소 활성을 제한하는 데 도움이 됩니다. 마지막 단계에서, 효소 처리된 DSM 조각을 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 삼각화하여 단일 DSM 세포를 방출한다. DSM 세포는 패치 클램프 연구 또는 다른 유형의 실험을 위해 기록 챔버에 즉시 배치되거나 같은 날 나중에 사용하기 위해 DS에 얼음에 저장됩니다 (일반적으로 제제 8 시간 이내에 사용하지만 세포는 최대 24 시간 동안 실행 가능한 상태로 유지됩니다).

우리는 성공적으로 단일 DSM 세포를 얻기위한 몇 가지 중요한 고려 사항을 확인했다. 첫 번째는 인간 DSM 시편 소스 품질과 관련이 있습니다. 조직 무결성을 최적으로 보존하기 위해 개방형 방광 수술에서 얻은 DSM 샘플은 가능한 한 빨리 얼음 차가운 DS에 넣고 추운 환경에서 유지됩니다. 특히, 환자로부터 외과 적 추출시, 방광 시편은 즉시 수술실에서 완전히 준비 된 사이드 테이블에 놓입니다. 전체 표본의 총 검사 (일반적으로 급진적 또는 간단한 방광 절제술 동안 얻은) 및 그것의 개구부는 따릅니다. 육안 검사 후, 전체 두께의 오줌 사다리 표본의 조각은 종양과 관련되지 않은 표본의 원격 영역에서 제거하고 즉시 차가운 (~ 4 °C) 해부 용액 (DS)을포함하는 컵 (50 또는 100 mL 중 하나)에 넣고 뚜껑으로 단단히 닫힙니다. 조직 수확의 계획된 특성으로 인해, 수확을 하는 수술실 직원 및 보조 직원은 조직 추출 시 수술실에서 사용할 수 있는 물질을 갖기 위해 수술 케이스가 시작될 때 경고를 받습니다. 이러한 예방 조치는 처리 단계의 일상적이고 반복적인 특성과 함께 DS 용액이있는 차가운 용기에 추출에서 5 분 미만까지 조직에 대한 따뜻한 허혈 시간을 유지합니다. 그런 다음 용기는 차가운 환경을 유지하기 위해 냉장고 또는 얼음에 넣고 실험실로 운반합니다. 표본이 실험실에 도착하면 해부 및 효소 해리 단계가 시작됩니다. 주어진 DSM 표본이 효소 해리 다음 고품질 DSM 세포를 산출할지 여부를 예측하는 것은 매우 어렵기 때문에 효소 해리 단계를 진행합니다. 많은 경우에, 전기 생리학적 실험과 병행하여, 우리 그룹은 동일한 DSM 표본에서 제조된 DSM 스트립에 아이소메트릭 장력 기록을 실시합니다. 우리는 우리가 일반적으로 또한 성공적으로 아이소메트릭 수축 연구 (우리의 미공개 관측)를 위한 실행 가능한 지구를 제공하는 준비에서 고품질 DSM 세포를 장악할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다.

두 번째 요인은 다른 효소 로트 가변성과 관련이 있습니다. 우리는 파파인과 콜라게나아제 타입 II 모두에 대해, 새로운 효소가 공급자로부터 도착할 때마다 조직 소화를 위한 DS의 효소 활성이 달라질 수 있음을 관찰했습니다. 따라서 우리는 각각의 새로운 부지에 대한 효소 농도와 인큐베이션 간격을 정기적으로 최적화합니다. 로트 가변성 기여도를 최소화하기 위해 동일한 로트의 대량 을 주문하고 효소의 2 mL aliquots에 대량의 재고 용액을 만들고 사용할 때까지 ~-20 °C에 저장합니다. 그러나 시간이 지남에 따라 냉동 주식 (최대 2 주 저장)은 효소 활동을 잃을 수 있습니다. 세 번째 변수는 효소 소화 치료의 온도에 관한 것입니다. 파파인과 콜라게나아제의 효소 활동은 온도 의존성을 표시합니다. 파파인 및 콜라게나아제 타입 II는 정상 체내 생리학67,68을포괄하는 온도 범위에서 활성을 나타낸다. 따라서, 우리는 DSM 세포 무결성을 보존하기 위해 더 높은 온도를 피하고 ~ 37 °C에서 안정적인 효소 처리를 유지하는 것을 목표로합니다. 네 번째 고려 사항은 매우 실행 가능한 (우수한 고전 평활근 특성을 나타내는)에서 비 건강, 과다 소화 세포에 이르기까지 각 준비 내에 존재하는 DSM 세포의 품질의 가변성에 관한 것입니다. 장기간 효소 배양 간격은 손상된 세포의 높은 숫자를 얻기위한 주요 이유 중 하나입니다. 과도 한 효소 치료 또한 이온 채널의 단백질 구조를 손상, 수용 체, 그리고 수송, 그들의 기능에 부정적인 영향을 미치는. 효소적으로 얻은 결과, 갓 분리 된 세포에서 얻은 결과의 해석마음에이 고려를 부담 한다. 효소 소화 조건의 최적화는 매우 실행 가능한 세포의 비율을 증가 하는 것을 목표로합니다. 마이크로어레이 분석과 같은 더 많은 수의 생존 가능한 세포에 의존하는 실험적 접근법은 단일 세포 패치 클램프 전기 생리학 또는Ca2+ 이미징과 같은 적은 세포에서 성공적으로 수행된 것보다 더 강력한 최적화를 필요로 합니다. 전술한 요인의 고려는 고품질 단 하나 DSM 세포를 얻기에 있는 우리의 연구 노력을 지난 10 년간 지도했습니다.

천공 패치 클램프 기술은 세기의 분기 이상에 대한 주류 전기 생리학적 접근 방식이었다. 여러 간행물은 기술적 고려 사항에 대한 세부 정보를 제공합니다.69,70,71,72,73. 세포 천공은 암포테리신-B, 니스타틴, 그라니시딘 또는 β-에신으로 얻을 수 있습니다(참조 참조)32각 개요에 대한 개요)를 참조하십시오. 다른 전기 생리학적 접근법에 비해 천공 된 패치 클램프 기록의 주요 장점은 세포 내 Ca를 포함한 기본 세포 내 환경이라는 것입니다.2+및 신호 분자(예를 들어, cAMP, PKA, 인산염 및 인산염) -가 보존된다. 이 기술은, 그러므로, 이상적으로 가까운 생리적인 조건의 밑에 전체 세포 이온 채널 전류 및 그들의 규정하는 기계장치를 조사하기에 적합합니다. 중요한 주의 사항은 세포 내 세포 조성이 기존의 전체 세포 및 단일 채널 절제 패치 (내부 및 외부 아웃) 기록과 같은 다른 전기 생리학적 방법과 달리 정밀하게 제어 될 수 없다는 것입니다. 우리의 경험에서, 세 가지 요인은 정기적으로 암포테리신-B 천공 패치 클램프 실험의 성공적인 실험 결과에 기여. 첫 번째는 레코딩을 시도하도록 선택한 DSM 셀의 품질입니다. DSM 세포가 반수축체(뱀같은)를 표시하는 것이 매우 실행 가능하다면, 고대비 반짝이는 외관은 셀 표면 주위에 잘 정의된 후광을 가지고 있고 기록 챔버의 유리 바닥에 단단히 부착한 다음 기가 씰 형성 및 세포 천공이 비교적 쉽게 발생한다. 성공을위한 두 번째 및 세 번째 요인은 각각 파포테리신 -B의 소스 및 용해 (디메틸 설폭사이드 / DMSO 및 세포 내 파이펫 용액)의 품질과 관련이 있습니다. 우리는 소스와 로트 의 변화의 관점에서 다른 공급 업체 간의 불일치를 관찰했다. 매일 우리는 분말에서 파포테리신-B 스톡 솔루션의 신선한 용액을 준비하고 세포내 파이펫 용액에서 희석합니다. 이러한 단계는 광범위한 초음파 처리 및 소용돌이가 필요합니다. 갓 만든 암포테리신-B 함유 파이펫 용액으로, 성공적인 세포 천공 (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+Ca2+, 인간, 기니 피그, 마우스 및 /또는 쥐 DSM 세포에서 비 선택적 양이온 전류17,21,22,23,29,30,31,35,60. 여기서, 우리는 인간 DSM 세포에서 비선택적 양이온 전류를 기록하기 위한 조건을 기술한다. 9-Phenanthrol, TRPM4 채널의 차단제, 감쇠 전압 단계 유도 전류 DSM 흥분성의 제어에서 이러한 채널의 역할을 지탱. 참고로, 최적 안정전압 단계 유도 비선택적 양이온 전류를 기록하기 위해 기가 씰 및 천포 개시 후 일반적으로 최소 45분이 필요하다. 전압 램프는 전압 단계 프로토콜의 대안으로도 사용할 수 있습니다.30,64. 여기서, 과분극 유지 막 전위로부터의 전압 단계 프로토콜은 램프 프로토콜보다는 오히려 램프 프로토콜이 선호되었다. 램프가 전압당 단일 데이터 포인트를 제공하는 전압 단계입니다. 후자의 점은 전류가 전압 단계 동안 가변 활성을 나타내기 때문에 인간 DSM 셀에 특히 적용됩니다(그림 5그림 6). 암포테리신-B 천공 패치 클램프 기술은 DSM 세포 및 기타 세포 유형의 특성을 식별하는 데 필수적이며 향후 새로운 발견을 제공하는 데 계속 보탬이 될 것입니다. 또한, 갓 분리된 단일 DSM 셀은 전체 셀 K를 측정하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다.+Cl-및 Ca2+패치 클램프 기술의 기존 모드와 전류, 현재 클램프와 멤브레인 전위 기록, 우리의 이전 보고서에 의해 예시된 단일 채널 기록23,29,35,64.

단세포 패치 클램프 방법 이외에, 갓 단리된 DSM 세포는Ca2+ 화상 진찰, RT-PCR/q-RT-PCR, 면역세포 화학, 심위 근접 결찰 분석 및 게놈 접근 (예를 들어, 마이크로어레이, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30 , 30 , 30 ,30을포함한 다른 기술적 접근법으로 공부할 수 있습니다. 단 세포 전사체 결정 방법이 계속 진화하고 매우 민감해짐에 따라, 우리는 개별 DSM 세포의 전기적 또는 약리학적 특성을 전사체/프로테오메 프로파일과 일상적으로 구체적으로 연결하는 미래의 능력을 구상합니다. 이것은 DSM 세포에서 첫번째 기록하고 그 때 전사체/단백질 분석에 선행된 mRNA 또는 단백질추출에 의해 달성될 것입니다. 이러한 방법은 비DSM 세포에서 이미 시험되었지만, 이들은 현재 기술적으로 도전적이고, 일상적인 것으로 간주되는 민감도가 부족하며, 몇몇 선택된 유전자제품(74)의성공적인 검출에 제한된다. 통제 및 병적 인 환자 기증자에서 파생 된 오줌 방광에서 얻은 DSM 세포에 대한 연구를 수행 할 때 기능 분자 프로필 발현은 정상적인 DSM 기능, 병인을 구동하고 효과적인 새로운 치료 접근법을 식별하는 데 필수적인 생리적 과정에 대한 통찰력을 제공합니다.

Disclosures

없음.

Acknowledgments

이 작품은 NIH-R01DK106964 및 P20DK123971 조지 V. Petkov에 대한 보조금에 의해 지원되었다. 저자들은 빅토르 야로츠키 박사와 사라 맥스웰 박사에게 원고에 대한 비판적 평가에 감사를 표합니다. 우리는 또한 MUSC와 UTHSC에서 비뇨기과 직원 외과 의사에 감사드립니다: 박사 토마스 킨, 해리 클라크, 스티븐 새비지, 로스 라메스, 산디프 프라사드, 조나단 피카드, 크리스토퍼 Ledbetter, 앤서니 패터슨뿐만 아니라 MUSC와 UTHSC 비뇨기과 주민: 박사. 본, 새뮤얼 워커 니클스, 매튜 영, 에린 번스, 저스틴 엘렛, 라이언 레비, 오스틴 영, 마크 커린, 니마 바라다란, 올루그베소라 맥코이, 트레이시 팁턴, 브라이스 와이트, 알리사 그라인, 사라 스타로스타, 아론 블로흐, 크리스틴 캘러웨이 크리스티안 드완, 에린 하이트먼, 브래들리 휴스턴, 스티븐 레그, 로버트 S. 리비, 콜 록클레어, 크리스틴 말리, 모니카 오핸론, 패트릭 프로브스트, 신시아 샤라딘, 엘리자베스 투어빌, 다니엘 자파타가 인간 조직 수집에 도움을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round-bottom tube Falcon 352054 Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps
9-Phenanthrol Sigma-Aldrich 211281 TRPM4 channel inhibitor
Amphotericin-B Fisher BP928-250 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B European Pharmacopoeia Reference Standards 5 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B Sigma-Aldrich A9528-100MG Used for patch/cell perforation
Analog vortex mixer VWR 58816-121
Aspartic acid Sigma-Aldrich A9006 Intracellular pipette solution
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 DS
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 Extracellular solution and DS
Capillary Glass Sutter BF150-110-7.5 Capillary for preparation of pulled patch electrodes
Cesium hydroxide hydrate Sigma-Aldrich C8518 Intracellular pipette solution
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs Axon Instruments/ Molecular Devices pCLAMP-10 Commerical software and part of patch-clamp rig setup
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004177 DS-C
CsCl Sigma-Aldrich 203025 Extracellular and intracellular solutions
Dental wax Miltex Dental Wax Technologies, Inc. 18058351
Digital Thermometer with Probe Fisher Scientific 15-077-32 Placed in tissue bath to monitor temperature
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Solvent
DL-Dithiothreitol (DDT) Sigma-Aldrich D9779 Reducing agents used together with Papain
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution
Flaming/Brown micropipette puller Sutter P-97 Required to pull electrodes with very fine tips
Floating foam tube rack/holder VWR Scientific 82017-634 Used for holding tubes with enzymes for temperature control
Glucose Sigma G8270
Glutamic acid (Na salt) Sigma-Aldrich G1626 DS
HEPES Sigma-Aldrich H3375 pH Buffer
KCl Fisher Scientific BP366-1 Extracellular solution
Low Noise Data Acquisition System Axon Instruments/ Molecular Devices Digidata 1440A Part of patch-clamp rig setup
Magnetic stirrer VWR 01-442-684
MgCl2 (hexahydrate) Sigma-Aldrich M2670 Extracellular and intracellular solutions
MicroForge Narishige MF-830 Used for fire-polishing electrodes
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Extracellular and intracellular solutions
NaOH Sigma-Aldrich S8045
Nifedipine Sigma-Aldrich N7634 L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives Nikon Discontinued Part of Patch-clamp rig setup
Non-metalic syringe needle, MicroFil WPI MF-34G-5 Filling of intracellular pipette solution
Papain Worthington Biochemical Corporation LS003126 DS-P
Pasteur pipette FisherBrand 13-678-20A Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces
Patch-clamp amplifier Axon Instruments/ Molecular Devices Axon Axopatch 200B Part of patch-clamp rig setup
PC computer DELL Custom configuration Part of patch-clamp rig setup
pH Meter Aspera Instruments PH700
Polyethylene tubing Intramedic 427-436 Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber
Tetraethylammonium chloride Sigma-Aldrich T2265 Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) Thermo Scientific Discontinued Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup
Tissue bath, 100 mL Radnoti 1583-101 Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps
Vinyl tubing ColePalmer 06405-3 Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath
Water circulator bath, Haake D1 L Haake Discontinued Connected to tissue bath
Weighting scale Mettler Toledo XS64
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives Carl-Zeiss Discontinued Part of patch-clamp rig setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, K. E., Arner, A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 84, (3), 935-986 (2004).
  2. Brading, A. F., Brain, K. L. Ion channel modulators and urinary tract function. Urinary Tract. Andersson, K. E., Michel, M. C. 202, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. Part of Handbook of Experimental Pharmacology book series 375-393 (2011).
  3. Brading, A. F. Spontaneous activity of lower urinary tract smooth muscles: correlation between ion channels and tissue function. Journal of Physiology. 570, Pt 1 13-22 (2006).
  4. Brading, A. F., Heaton, J. P., Hashitani, H. A survey of commonalities relevant to function and dysfunction in pelvic and sexual organs. International Journal of Impotence Research. 20, (1), 1-16 (2008).
  5. Petkov, G. V. Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction. Nature Reviews Urology. 9, (1), 30-40 (2012).
  6. Andersson, K. E. Treatment-resistant detrusor overactivity--underlying pharmacology and potential mechanisms. International Journal of Clinical Practice Supplement. 151, 8-16 (2006).
  7. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 165, (2), 627-632 (2001).
  8. Kropp, B. P., et al. Characterization of cultured bladder smooth muscle cells: assessment of in vitro contractility. Journal of Urology. 162, (5), 1779-1784 (1999).
  9. Bonev, A., Isenberg, G. Arginine-vasopressin induces mode-2 gating in L-type Ca2+ channels (smooth muscle cells of the urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 420, (2), 219-222 (1992).
  10. Schneider, P., Hopp, H. H., Isenberg, G. Ca2+ influx through ATP-gated channels increments [Ca2+]i and inactivates ICa in myocytes from guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 440, 479-496 (1991).
  11. Wellner, M. C., Isenberg, G. Properties of stretch-activated channels in myocytes from the guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 466, 213-227 (1993).
  12. Wellner, M. C., Isenberg, G. Stretch-activated nonselective cation channels in urinary bladder myocytes: importance for pacemaker potentials and myogenic response. Experientia Supplementum. 66, 93-99 (1993).
  13. Klockner, U., Isenberg, G. Action potentials and net membrane currents of isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 405, (4), 329-339 (1985).
  14. Moore, E. D., et al. Organization of Ca2+ release units in excitable smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. Biophysical Journal. 87, (3), 1836-1847 (2004).
  15. Hristov, K. L., Chen, M., Kellett, W. F., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels regulate human detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301, (4), 903-912 (2011).
  16. Afeli, S. A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. SK but not IK channels regulate human detrusor smooth muscle spontaneous and nerve-evoked contractions. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303, (4), 559-568 (2012).
  17. Hristov, K. L., et al. Kv2.1 and electrically silent Kv channel subunits control excitability and contractility of guinea pig detrusor smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (2), 360 (2012).
  18. Afeli, S. A., Malysz, J., Petkov, G. V. Molecular expression and pharmacological evidence for a functional role of Kv7 channel subtypes in Guinea pig urinary bladder smooth muscle. PLoS One. 8, (9), 75875 (2013).
  19. Smith, A. C., et al. TRPM4 channel: a new player in urinary bladder smooth muscle function in rats. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 304, (7), 918-929 (2013).
  20. Smith, A. C., et al. Novel role for the transient potential receptor melastatin 4 channel in guinea pig detrusor smooth muscle physiology. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 304, (5), 467 (2013).
  21. Hristov, K. L., Smith, A. C., Parajuli, S. P., Malysz, J., Petkov, G. V. Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel regulation by protein kinase C in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306, (5), 460-470 (2014).
  22. Hristov, K. L., et al. Novel regulatory mechanism in human urinary bladder: central role of transient receptor potential melastatin 4 channels in detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, (7), 600-611 (2016).
  23. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306, (1), 45-58 (2014).
  24. Montgomery, B. S., Fry, C. H. The action potential and net membrane currents in isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 147, (1), 176-184 (1992).
  25. Parajuli, S. P., Soder, R. P., Hristov, K. L., Petkov, G. V. Pharmacological activation of small conductance calcium-activated potassium channels with naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine decreases guinea pig detrusor smooth muscle excitability and contractility. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 340, (1), 114-123 (2012).
  26. Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels regulate action potential repolarization in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, (1), Pt 1 110-117 (1997).
  27. Petkov, G. V., Nelson, M. T. Differential regulation of Ca2+-activated K+ channels by beta-adrenoceptors in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, (6), 1255-1263 (2005).
  28. Herrera, G. M., Etherton, B., Nausch, B., Nelson, M. T. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa channels in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 289, (2), 402-409 (2005).
  29. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 465, (7), 965-975 (2013).
  30. Provence, A., Angoli, D., Petkov, G. V. Kv7 channel pharmacological activation by the novel activator ML213: role for heteromeric Kv7.4/Kv7.5 channels in guinea pig detrusor smooth muscle function. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 364, (1), 131-144 (2018).
  31. Parajuli, S. P., et al. Control of urinary bladder smooth muscle excitability by the TRPM4 channel modulator 9-phenanthrol. Channels (Austin). 7, (6), 537-540 (2013).
  32. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques: From Beginning to Advanced Protocols. Okada, Y. 4, Springer. Tokyo, Japan. 71-83 (2012).
  33. Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Regulation of transient receptor potential melastatin 4 channel by sarcoplasmic reticulum inositol trisphosphate receptors: Role in human detrusor smooth muscle function. Channels (Austin). 11, (5), 459-466 (2017).
  34. Hristov, K. L., et al. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (11), 1632-1641 (2012).
  35. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Petkov, G. V. Inhibition of phosphodiesterases relaxes detrusor smooth muscle via activation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (9), 1361-1370 (2012).
  36. Hristov, K. L., et al. Neurogenic detrusor overactivity is associated with decreased expression and function of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels. PLoS One. 8, (7), 68052 (2013).
  37. Hristov, K. L., Parajuli, S. P., Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Nongenomic modulation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels by estrogen: A novel regulatory mechanism in human detrusor smooth muscle. Physiological Reports. 5, (14), (2017).
  38. Parajuli, S. P., et al. Functional link between muscarinic receptors and large-conductance Ca2+ -activated K+ channels in freshly isolated human detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 467, (4), 665-675 (2015).
  39. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 465, (7), 965-975 (2013).
  40. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties of a tonically active, sodium-permeable current in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 286, (6), 1246-1257 (2004).
  41. Barry, M. J., et al. The American Urological Association symptom index for benign prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American Urological Association. Journal of Urology. 148, (5), 1549-1557 (1992).
  42. Klockner, U., Isenberg, G. Calcium currents of cesium loaded isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea pig). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 405, (4), 340-348 (1985).
  43. Klockner, U., Isenberg, G. Tiapamil reduces the calcium inward current of isolated smooth muscle cells. Dependence on holding potential and pulse frequency. European Journal of Pharmacology. 127, (3), 165-171 (1986).
  44. Weidelt, T., Isenberg, G. Augmentation of SR Ca2+ release by rapamycin and FK506 causes K+-channel activation and membrane hyperpolarization in bladder smooth muscle. British Journal of Pharmacology. 129, (7), 1293-1300 (2000).
  45. Inoue, R., Brading, A. F. The properties of the ATP-induced depolarization and current in single cells isolated from the guinea-pig urinary bladder. British Journal of Pharmacology. 100, (3), 619-625 (1990).
  46. Inoue, R., Brading, A. F. Human, pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation. British Journal of Pharmacology. 103, (4), 1840-1841 (1991).
  47. Nakayama, S., Brading, A. F. Possible contribution of long open state to noninactivating Ca2+ current in detrusor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 269, (1), Pt 1 48-54 (1995).
  48. Nakayama, S., Brading, A. F. Interaction of Ca2+ agonist and depolarization on Ca2+ channel current in guinea pig detrusor cells. Journal of General Physiology. 106, (6), 1211-1224 (1995).
  49. Gallegos, C. R., Fry, C. H. Alterations to the electrophysiology of isolated human detrusor smooth muscle cells in bladder disease. Journal of Urology. 151, (3), 754-758 (1994).
  50. JournalFry, C. H., Gallegos, C. R., Montgomery, B. S. The actions of extracellular H+ on the electrophysiological properties of isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Physiology. 480, Pt 1 71-80 (1994).
  51. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU International Journal. 92, (4), 476 (2003).
  52. Wu, C., Sui, G., Fry, C. H. The role of the L-type Ca2+ channel in refilling functional intracellular Ca2+ stores in guinea-pig detrusor smooth muscle. Journal of Physiology. 538, Pt 2 357-369 (2002).
  53. Bonev, A. D., Nelson, M. T. Muscarinic inhibition of ATP-sensitive K+ channels by protein kinase C in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 265, (6), Pt 1 1723-1728 (1993).
  54. Bonev, A. D., Nelson, M. T. ATP-sensitive potassium channels in smooth muscle cells from guinea pig urinary bladder. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 264, (5), 1190-1200 (1993).
  55. Petkov, G. V., Heppner, T. J., Bonev, A. D., Herrera, G. M., Nelson, M. T. Low levels of KATP channel activation decrease excitability and contractility of urinary bladder. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 280, (5), 1427-1433 (2001).
  56. Shieh, C. C., et al. Functional implication of spare ATP-sensitive K+ channels in bladder smooth muscle cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 296, (3), 669-675 (2001).
  57. Shieh, C. C., et al. Characterization of a novel ATP-sensitive K+ channel opener, A-251179, on urinary bladder relaxation and cystometric parameters. British Journal of Pharmacology. 151, (4), 467-475 (2007).
  58. Petkov, G. V., et al. Beta1-subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. Journal of Physiology. 537, Pt 2 443-452 (2001).
  59. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties and molecular basis of the mouse urinary bladder voltage-gated K+ current. Journal of Physiology. 549, Pt 1 65-74 (2003).
  60. Hristov, K. L., et al. Stimulation of beta3-adrenoceptors relaxes rat urinary bladder smooth muscle via activation of the large-conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295, (5), 1344-1353 (2008).
  61. Layne, J. J., Nausch, B., Olesen, S. P., Nelson, M. T. BK channel activation by NS11021 decreases excitability and contractility of urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 298, (2), 378-384 (2010).
  62. Lee, H., Koh, B. H., Peri, L. E., Sanders, K. M., Koh, S. D. Functional expression of SK channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Journal of Physiology. 591, (2), 503-513 (2013).
  63. Lee, H., et al. Premature contractions of the bladder are suppressed by interactions between TRPV4 and SK3 channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Scientific Reports. 7, (1), 12245 (2017).
  64. Yarotskyy, V., Malysz, J., Petkov, G. V. Properties of single channel and whole-cell Cl- currents in guinea pig detrusor smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 316, (5), 698-710 (2019).
  65. Driska, S. P., Porter, R. Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 251, (3), Pt 1 474-481 (1986).
  66. Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. The function of Ca2+ in the action of mammalian collagenases. Archives of Biochemistry and Biophysics. 173, (1), 355-361 (1976).
  67. Skelton, G. S. Papaya proteinases. I. Temperature-and pH-stability curves. Enzymologia. 35, (5), 270-274 (1968).
  68. Petrova, D., Derekova, A., Vlahov, S. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp. strain 3B. Folia Microbiologica (Praha). 51, (2), 93-98 (2006).
  69. Sharpe, E. J., St Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), (2016).
  70. Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring arterial smooth muscle Kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4263 (2012).
  71. Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor. Journal of Visualized Experiments. (101), e52652 (2015).
  72. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods. 37, (1), 15-26 (1991).
  73. Knutson, K., et al. Whole cell electrophysiology of primary cultured murine enterochromaffin cells. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
  74. Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics