שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

היווצרות preסינפסה הוא תהליך דינמי כולל הצטברות של חלבונים סינפטית בסדר הנכון. בשיטה זו, היווצרות preסינפסה מופעלות על ידי חרוזים מצועם עם חלבון preסינפא מארגן על גיליונות סיבי של "כדור תא העצב" התרבות, כך הצטברות של חלבונים סינפטית קל להיות מנותח במהלך היווצרות preסינפסה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במהלך פיתוח עצבי, היווצרות סינפסה. הוא צעד חשוב להקמת מעגלים עצביים כדי ליצור סינפסות, חלבונים סינפטית חייבים להיות מסופקים בסדר המתאים על ידי הובלה של גופי תא ו/או תרגום מקומי בסינפסות בלתי ילדותית. עם זאת, זה לא באופן מלא להבין איך חלבונים סינפטית להצטבר הסינפסות בסדר הנכון. כאן, אנו מציגים שיטה הרומן לנתח היווצרות טרום סינפטיות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום להיווצרות preסינפסה. כדורי תא העצב כי הוא אגרגטים עצביים התא לספק גיליונות סיבי הרחק גופי התא ו דנדריטים, כך אותות פלורסנט חלשה של טרום הסינפסות ניתן לזהות על ידי הימנעות אותות מכריע של גופי תא. כמו חרוזים כדי להפעיל את היווצרות preסינפסה, אנו משתמשים חרוזים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2), מארגן presynapse מדומה. באמצעות שיטה זו, הדגמנו כי מנשא גלוטמט vesicular 1 (vGlut1), חלבון שלפוחית סינפטית, שנצבר מראש מהיר יותר מאשר Munc18-1, חלבון אזור פעיל. Munc18-1 מצטבר תרגום-בהתלהבות בקדם-סינפסה גם לאחר הסרת גופי תאים. ממצא זה מצביע על הצטברות Munc18-1 על-ידי תרגום מקומי באקסונים, לא הובלה מגופי תאים. לסיכום, שיטה זו מתאימה לנתח הצטברות של חלבונים סינפטית בטרום הסינפסות ומקור של חלבונים סינפטית. כמו תרבות כדור העצב היא פשוטה ואין צורך להשתמש מכשירים מיוחדים, שיטה זו יכולה להיות ישימה פלטפורמות ניסיוני אחרים.

Introduction

היווצרות סינפסה הוא אחד מהצעדים הקריטיים במהלך פיתוח מעגלים עצביים1,2,3. היווצרות של הסינפסות כי הם תאים מיוחדים מורכב pre-לאחר הסינפסות הוא תהליך מורכב רב מעורבים הכרה מתאימה של אקסונים ו דנדריטים, היווצרות אזור פעיל צפיפות פוסט סינפטית, ויישור נאות של ערוצי יון וקולטני נוירוטרנסמיטר1,2. בכל תהליך, סוגים רבים של חלבונים סינפטית להצטבר אלה תאים מיוחדים בעיתוי הנכון על ידי הובלת חלבונים סינפטית מגופי התא ו/או על ידי תרגום מקומי בתאים. חלבונים סינפטית אלה נחשבים מסודרים באופן מאורגן כדי ליצור סינפסות תפקודית. תפקוד של כמה חלבונים סינפטיות מעורבים היווצרות סינפסה תוצאות מחלות נוירולוגיות4,5. עם זאת, זה עדיין לא ברור איך חלבונים סינפטית מצטברים בעיתוי הנכון.

כדי לחקור כיצד מצטברים חלבונים סינפטיים באופן מאורגן, יש צורך לבחון את הצטברות החלבונים הסינפטית בסדר כרונולוגי. דיווחים מסוימים הפגינו הדמיה חיה כדי לבחון את היווצרות סינפסה בתרבות המונתק של נוירונים6,7. עם זאת, זה זמן רב למצוא נוירונים אשר רק להתחיל היווצרות סינפסה תחת מיקרוסקופ. כדי להתבונן הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות, היווצרות סינפסה חייב להתחיל בזמן שבו החוקרים רוצים לגרום להיווצרות. האתגר השני הוא להבחין הצטברות של חלבונים סינפטית עקב הובלה של גופי תאים או תרגום מקומי בסינפסות. לצורך זה, רמת התרגום הכרחית למדידה במצב שאינו מאפשר העברה של חלבונים סינפטית מגופי התא.

פיתחנו הרומן טרום הסינפסה היווצרות באמצעות שילוב של תרבות כדור העצב עם חרוזים כדי לגרום preסינפסה היווצרות8. כדור תא העצב תרבות מפותח כדי לבחון האקסון האקאליות, בשל היווצרות של גיליונות סיבי המקיפים גופים תא9,10. השתמשנו חרוזים מגנטיים מצועם עם לוקיצין עשיר לחזור על הקרום העצבי 2 (LRRTM2) כי הוא מארגן טרום סינפטיות כדי לגרום הפרסינפסות מרגש (איור 1a)11,12,13. באמצעות חרוזי LRRTM2, היווצרות preסינפסה להתחיל בזמן כאשר החרוזים מוחלים. משמעות הדבר היא כי היווצרות preסינפסה מתחיל באלפי אקסונים של כדור עצב באותו זמן, ובכך הוא מאפשר לבחון את הזמן המדויק של הצטברות של חלבונים סינפטית ביעילות. בנוסף, התרבות כדור העצב הוא קל לחסום התחבורה חלבונים סינפטית מ סומה על ידי הסרת גופי תא (איור 1B)8. כבר אישרו כי אקסונים ללא גופים תא יכול לשרוד הם בריאים לפחות 4 h לאחר ההסרה של גופות תאים. כך, פרוטוקול זה מתאים לחקור מאיפה חלבונים סינפטיות נגזרות (גוף תא או axon), וכיצד חלבונים סינפטית להצטבר באופן מאורגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו על פי ההנחיות המפורטות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת השימוש של האוניברסיטה העירונית של יוקוהמה.

1. הכנת כדורי תא העצב כתרבות תלייה תלויה (ימים במבחנה (DIV) 0-3)

הערה: ההליכים המתוארים כאן להכנת התרבות כדור העצב מבוססים על השיטה שדווחה בעבר על ידי קבוצת sasaki עם כמה שינויים9,10. כמו כן אימצנו מספר הליכים משיטת הבנקאי לתרבות המונתק14.

  1. אישור הטיפול לפני התחלת הניתוח
    1. הכן את כל הפתרונות הדרושים ועקר אותם באמצעות האוטוקלבים/סינון מראש.
    2. לשמור מוכנים כל המכשירים והחומרים לשמש כל השלבים של התרבות הזאת העצב הקליפת.
    3. לרסס ולנגב את הארון האוויר הלבינארי זרימה, שולחן לחיתוך, צלחת הבמה של stereomicroscope, מספריים, מלקחיים עם 70% אתנול.
  2. המתת חסד העכבר על היישום של CO2 ונתח את הבטן כדי להשיג עוברים E16.
  3. להסיר את המוחות מעוברים בזהירות בעזרת טיפים עדינים של מלקחיים ולהעביר אותם לתוך 60 mm מנות התרבות התא המכיל 4 מ ל של הכלב באגירה תמיסת מלח (HBSS).
    הערה: מדיום לחיתוך HBSS מכיל 10 מ"מ HEPES (pH 7.4), 140 mM הנאקל, 5.4 מ"מ KCl, 1.09 mM Na2hpo4, 1.1 mm KH2PO4, 5.6 מ"מ D-גלוקוז, ו 5.64 μm פנול אדום.
  4. להסיר את הקרקפת, לחתוך את הנורה הריח, להפריד מתוך האונה ממוח כל באמצעות עצות בסדר של מלקחיים תחת stereomicroscope, ולהעביר לעוד 60 mm מנות המכילות HBSS טרי. השתמש לפחות 3-5 עוברים עבור כל תרבות כדור העצב נפרד.
  5. חותכים את המפתלים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים של קפיץ בתוך כיסוי התרבות של תאי הזרימה.
  6. העברת מסכת כתוש אל שפופרת של 15 מ ל וטריסיזציה של מסכת הבשר הטחון ב-4 מ ל של 0.125% טריפסין ב-HBSS עבור 4.5 דקות באמבט מים ב-37 ° c.
    הערה: זמן זה טריסימיזציה הוא קריטי לתרבות הנוירונים יעיל כמו הזמן הגובר (> 4.5 דקות) מוביל נוירונים הרבה יותר מתים.
  7. העבר את אגרגטים התא לצינורית חדשה של 15 מ ל המכילה 10 מ ל של HBSS על ידי פיפטה העברה סטרילית, ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.. חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
  8. העבר את אגרגטים התא לצינורית חדשה של 15 מ ל המכיל 2 מ ל של מדיה נוירובסיס המכילה גלוטמקס, B27 תוספת (NGB בינוני), 0.01% DNase I ו 10% סרום סוסים.
  9. Triturate את מחלת הטריסיזציה על-ידי מלטף אותם שוב ושוב מעלה ומטה (3-5 פעמים) באמצעות אש מלוטש זכוכית מלוטשת פסטר.
    הערה: קוטרו של זכוכית מלוטשת מלוטש מבריק פסטר מאוד חשוב כפי שמתואר ב שיטת הבנקאי נייר14. אם הפיפטה צר מדי להעברת מידות, הכינו את ה2-3 בגדלים שונים, ונסו מפיפטה גדול יותר.
  10. להכנת כדורי תא העצב, לקחת את השעיית התא הנ ל ולהתאים את צפיפות התא ל 1 x 106 תאים/mL באמצעות מדיום ngb.
  11. תרבות הנוירונים קליפת הבטן כמו טיפות תלויות המכיל 10,000 תאים/טיפה (1 טיפה הוא 10 μL) בתוך העפעפיים העליונים של 10 ס מ מנות תרבות.
  12. הוסף 7 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) לחלק התחתון של מנות התרבות, ולאחר מכן לשמור בחממה עבור 3 ימים ב 37 ° c עם 5% CO2 תחת המצב לחות כדי לאפשר מערך כדור העצב.

2. הצבת כדורי תא העצב על שמיכות זכוכית מצופה PLL ותחזוקת התרבות (DIV 3-11)

הערה: לפני ציפוי של שמיכות זכוכית עם פולי-L-ליזין (PLL), שטיפת שמיכות באמצעות ניקוי הוא חשוב. שמיכות זכוכית הם לפעמים לא כל כך נקי עבור תרבות עצבית וציפוי אחיד עם PLL. ציפוי pll לא אחיד עשוי לגרום הארכה סיבי אחידה של כדורי תא העצב.

  1. משרים את הכיסויים ב1/20 מדולל בחומר ניקוי נטול זרחן בארונות חרס בעבור 1-3 overnights ילות.
  2. שוטפים את הכיסויים 8 פעמים במים באולטרה-סאונד, ולאחר מכן מעקר בתנור ב-200 ° c במשך 12 שעות.
    הערה: יש לבצע את כל הצעדים מכאן במכסה התרבותי של תאי זרימת אוויר למינארי.
  3. העבר שמיכות אפוי למנות 100-mm. לאחר איטום המנה על ידי parafilm בין מכסה לבין הצלחת התחתונה, שמיכות אפוי ניתן לשמור לאחסון לטווח ארוך.
  4. אופציונלי למרוח נקודות פרפין על הכיסויים. הנקודות להפוך את החלל כדי למנוע כדורי תא העצב להתנתק מתוך שמיכות במהלך כתמים חיסוני על ידי מגע ישיר של כדורי תא העצב על מנות פלסטיק. ממיסים את הפרפין בבקבוק מתאים באמבט מים חמים בסביבות 90 ° c. טובלים את הפיפטה של פסטר לתוך הפרפין, ולאחר מכן גע בו במהירות כדי ליצור שלושה מקומות בסמוך לקצה של שמיכות.
  5. מעיל pll (MW > 300,000) על פרפין שמיכות זכוכית החרוזים ב 60-mm מנות באמצעות פתרון pll (15 μg/mL במאגר בוראט), ולשמור אותם לפחות 1 h בחממה CO2 .
  6. לאחר שטיפת 4 פעמים עם PBS, להעביר את כיסוי PLL מצופה לצלחת 4-הבאר המכילה 350 μL של NGB בינונית בכל טוב ו ציטוסינוס β-D-arabinofuranoside הידרוכלוריד (AraC, 3 μM) למדיה כדי להרוג תאים מפרידים.
  7. שמור את הצלחת 4-הבאר המכילה את שמיכות PLL-מצופה בחממה2 לפחות עבור 20 דקות כדי להבטיח את הטמפרטורה של המדיום להגיע 37 ° צ' לפני העברת כדורי תא העצב.
  8. ב-DIV 3 כאשר "כדורי תא העצב" נוצרות היטב, להעביר אותם אל PLL-מצופה שמיכות בתוך הצלחת 4-הבאר (5 כדורי תא העצב/טוב) שמורים בחממה2 .
  9. לאחר 48 h, להחליף את כדור העצב בינונית תרבות עם מדיום חדש AraC-חינם NGB. השתמשו בפלטה חמה במכסה האוויר המבינארי של כיסוי האויר שהטמפרטורה שלו מוכנה ב-37 ° c מיד לפני הליך זה.
    הערה: יש צורך לבצע את המדיום משתנה במהירות האפשרית על צלחת חמה כדי להקטין את הזמן שבו התרבויות נמצאות בחוץ של החממה CO2 .
  10. שמור את התרבות הזאת כדור עצב בחממה CO2 עד DIV 11.
    הערה: ב-DIV 11-12, כדורי תא העצב הארכת neurites עד 1-2 מ"מ משמשים לניסויים.

3. החלת LRRTM2 חרוזים על תרבות כדור העצב עם או בלי גופי תא (DIV 11-12)

הערה: לפני יישום של חרוזים LRRTM2 על תרבות כדור העצב, מומלץ להסיר את גופי התא. לכן, להכין LRRTM2 חרוזים בהתחלה, לאחר מכן להסיר את גופי התא ומאוחר יותר להחיל חרוזים LRRTM2 לתרבות מוקדם ככל האפשר. Biotinylated LRRTM2 מסופק על ידי הקבוצה של Nogi (באוניברסיטת יוקוהמה העיר) כמדיום מותנה. הם משתמשים בוקטור ביטוי כולל הרצף של ביוטין קבלה וביוטין ליגאז מ -E. coli חוז רמאללה מיכל בן 15 , 16 כדי לצרף את ביוטין ל LRRTM2, ואת וקטור הביטוי הוא מנוכר Expi293F תאים כלולים במערכת Expi293 expression. המידע הווקטורי זמין באיור המשלים 1. Biotinylated LRRTM2 מצופחת streptavidin חרוזים מופחתת רקע של מכתים מאוד לעומת LRRTM2-Fc – חלבון מצוח חרוזים המשמשים עבור אב טיפוס LRRTM2 מערכת8.

  1. הכנת חרוזים LRRTM2 ביולוגיים
    1. כדי להסיר ביוטין עודף מתוך בינוני ממוזג של Expi293F תאים המבטא biotinylated LRRTM2, להחיל 1.7 mL של המדיום הממוזג מעורבב עם 0.8 mL של PBS (סה כ 2.5 mL) לטור PD-10 ג'ל סינון. העמודה PD-10 הוא מנוכה מראש עם 25 מ ל של מים באלקטרופורזה 25 מ ל של PBS.
    2. אליוט עם 3.5 mL של PBS ולאסוף את הזרימה כמניה LRRTM2.
      הערה: ניתן לLRRTM2 מלאי זה כדי לשמור ולאחסן ב-80 ° c לטווח ארוך. רמות הביטוי של biotinylated LRRTM2 לעיתים משתנות מהרבה ללוט. כך, כמות נאותה של מלאי LRRTM2 המשלים את החרוזים צריך להיות נחוש בטופס הסינפסות מספיק על כדורי תא העצב, כאשר הרבה חדש של LRRTM2 מניות משמש בפעם הראשונה.
    3. לקחת 20 μL מן ההשעיה של חלקיקים מגנטיים streptavidin מצופה (קוטר: 4-5 μm) לצינור מיקרוצנטריפוגה. לשתק את החרוזים למנגנון בעבודת יד עם מגנטים קבועים שניאודימיום ולשטוף שלוש פעמים עם 100 μL של PBS-MCBC ב 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות.
      הערה: PBS-MCBC מכיל PBS כולל 5 מ"מ MgCl2, 3 מ"מ cacl2, 0.1% bsa, ו 0.1% השלם edta ללא תשלום.
    4. לאחר הסרת לחלוטין PBS-MCBC מן החרוזים, להוסיף נפח מראש של LRRTM2 stock (בדרך כלל 500-1000 μL, ראה הערה 3.1.2) אל החרוזים שטף. מודטה את התערובת באמצעות מסובבי ב 4 ° צ' עבור 1-2 h.
    5. שטוף את החרוזים פעמיים עם 100 μL של PBS-MCBC, ומאוחר יותר עם 100 μL של מדיום NGB.
    6. השהה מחדש את חרוזי LRRTM2 ב-50 μL של מדיום NGB עבור יישום לתרבות כדור העצב.
    7. השתמש בהליכים זהים להכנת חרוזי הבקרה (בקרה שלילית) בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר, למעט הוספת חלבונים ביולוגיים-LRRTM2.
  2. הסרת גוף התא מכדורי תא העצב ב-DIV 11-12 והחלת חרוזים LRRTM2
    1. סמן את הבארות של צלחת בעלת 4 הצלחות כ"גוף תא (+)" ו-"גוף התא (-)".
    2. חותכים את הסוף של קצה צהוב בזווית 45 ° עם להב תער שריסס בעבר עם 70% אתנול תחת stereomicroscope (איור 1B).
    3. שים את קצה הקצה הצהוב באזור גוף התא של כדור עצב ולהסיר את גופי התא על ידי יניקה (איור 1B).
    4. כדי לזהות כל אחד מהתנאים המפורטים בניסוי, תייג שוב את הבארות כ-"LRRTM2 חרוזים" ו-"חרוזי בקרה".
    5. החל את LRRTM2 ואת חרוזי בקרה על תרבות כדור העצב, ולטבול לתחתית הצלחות עבור 1 דקות באמצעות מגנטים פריט להתחיל היווצרות preסינפסה. הליך זה מבטיח לטאצ'דאון כל החרוזים באותו זמן. במיוחד, זה יהיה יעיל לדגירה זמן קצר (למשל, 30 דקות ו 1 h) עם LRRTM2 חרוזים סינכרוני.
    6. כדי לבצע ניסויים בזמן הקורס, לתייג כל היטב גם 0 דקות, 30 דקות, 1 h, 2 h, 4 h ו 18 h ולהחיל LRRTM2 חרוזים במרווחי זמן שצוינו.
    7. לאחר תוספת של LRRTM2 חרוזים, מודיית את התרבות כדור תא העצב עם חרוזים עבור הזמן שצוין (0 דקות עד 18 h) כדי ליצור טרום הסינפסות.

4. חיסוני ומיקרוסקופיה

הערה: תקן את התאים במשך 4 שעות באמצעות דגירה עם LRRTM2 חרוזים בתנאים ניסיוני עם וללא גופי תא, כמו אקסונים נוטים בהדרגה למות העדר גופי תא לאחר 4 h. במקרה של קורס זמן עם חרוזי LRRTM2, תקן את התאים בזמן שצוין.

  1. תיקון וצביעת נוירונים בתרבות כדור העצב לאחר היווצרות preסינפסה עם חרוזים LRRTM2
    1. להסיר בינונית NGB ולתקן את כדורי תא העצב עם 4% התחתית ב-PBS (250 μL/טוב) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם 500 μL של PBS 4 פעמים כל 5 דקות.
    2. לשטוף את התאים קבוע עם TBS (טריס-באגירה מלוחים: 50 mM טריס-HCl (pH 7.3) ו 150 mM הנאל) עבור יותר מ 5 דקות.
    3. החדירות התאים/axons של תרבות כדור העצב עם TBS המכיל 0.3% טריטון X-100 עבור 5 דקות.
    4. שמור את התאים 1 h עבור חסימה עם חסימת מאגר (0.1% טריטון X-100 ו 5% NGS (סרום עז רגיל) ב-TBS).
    5. מודב את התאים עם נוגדנים העיקרי; anti-ארנבת-vGlut1 (המשלח גלוטמט ושטר 1 (1:4000)) ו anti-mouse-Munc18-1 (1:300) מדולל עם נוגדן מדלל עבור לילה ב 4 ° c.
    6. לשטוף את הכיסויים 4 פעמים עם מאגר immunofluorescence (IF) מתווך (0.1% טריטון X-100 ו 2% BSA ב-TBS) ו דגירה עבור 30 דקות עם fluorophore הצבע (אלקסה)-נוגדנים 2nd מעלה; אנטי-עכבר-IgG-אלקסה 555 (1:500), אנטי ארנבת-IgG-אלקסה 488 (1:1000).
    7. הכתם את הגרעינים של גופי התא של נוירונים עבור 5 דקות עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI, 1 μg/mL) ב PBS.
    8. לשטוף את שמיכות שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן לעלות על שקופיות זכוכית באמצעות מדיה להרכבה המכילה 167 mg/mL פולי (ויניל) ו 6 מ"ג/mL N-פרופיל.
    9. אחסן את שקופיות הזכוכית במקרר ב-20 ° c עד למיקרוסקופ. אותות פלורסנט של שקופיות הזכוכית מאותנים לפחות 1 שנה כאשר השקופיות מאוחסנות ב-20 ° c.
  2. לקיחת תמונות תחת מיקרוסקופ של קרינה פלואורסצנטית
    1. לכידת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ותמונות אם תחת מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם מצלמה CCD מקורר באמצעות 60X שמן טבילה העדשה. לתוכנה לרכישת תמונות, השתמש במערכת מיקרוסקופ מותקנת בתוכנה. השתמש בתמונה J כתוכנה לניתוח תמונות.
    2. מדוד את עוצמת IF בסינפסות מראש ב-אקסון באמצעות הנוסחה הבאה; אם עוצמות של אזור הריבית על חרוזים (ROI) – כבוי בעוצמה אזור החרוזים/העוצמה axonal לאורך 20 יקרומטר מחרוזים – עוצמת הרקע. עוצמת יחס זו מספקת אינדקס הצטברות חלבון (איור 4A). בצע את המדידות בתמונות 16 סיביות המקוריות באמצעות תוכנת Image J.
    3. כדי לכמת את רמת ההצטברות של חלבון מסוים ב preסינפסה המושרה עם חרוזים LRRTM2, תמיד לבחור את האזור הרחק 2 שדה של תצוגה או יותר מלבד גוף התא עם מיקרוסקופ (60X).
      הערה: הבחירה של האזור בכדור העצב עבור דימות הוא קריטי כמו אקסונים צפוף הם ליד גוף התא הפריפריה של כדור תא העצב יכול לספק אקסונים יחיד.
    4. למדידה מדויקת, בחר באפשרות 5-שדה סיבי שונה (מרחק דומה מגופי התא)/cover,.
    5. שמור על תנאי דימות זהים ביום אחר ובין ניסויים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מראים את התוצאות הנציגים של הצטברות של חלבונים טרום סינפטיות בLRRTM2 המושרה של גיליונות סיבי של תרבות כדור העצב. כמו חלבונים טרום סינפטיות, ניתחנו את הסינפטיות שלפוחית החלבונים vGlut1 חלבון האזור הפעיל Munc18-1. כמו כן בחנו את קורס הזמן של הצטברות של vGlut1 ו-Munc18-1 ב טרום הסינפסות, והשיגה תוצאות המציינות את המקור של Munc18-1 ב טרום הסינפסות באמצעות אקסונים הסרת גופי תא ומעכבי סינתזה חלבון. לאחרונה, אנו חקרו תפקיד של חלבון שברירי X לפיגור חלבונים (FMRP) על הצטברות של Munc18-1 ב טרום הסינפסות8. Fmrp, שהוא מוצר גנטי סיבתי של תסמונת X שביר (FXS), הוא חלבון מחייב mrna לדכא תרגום17,18,19. בדקנו גם את המעורבות של FMRP ב-Munc18-1 הצטברות באמצעות עכברים מודל FXS אשר לקויה Fmr1 gene קידוד FMRP.

יישום של LRRTM2-חרוזים לתוך תרבות כדור העצב ב DIV11 המושרה הצטברות של Munc18-1 ב טרום הסינפסות של אקסונים של כדורי תא העצב (איור 2a). גם באקסונים אשר הוסרו גופי התא, הצטברות של Munc18-1 נצפתה תחת חרוזים דומה אקסונים של כדורי תא העצב עם גוף תאים (איור 2b). במקרה אופייני, מעל 80% של חרוזים לאחר 4 h-דגירה עם כדורי תא העצב יכול לגרום להצטברות של חלבונים סינפטיות ב טרום הסינפסות, נשפט על ידי צביעת Munc18-1 ו-vGlut-1. מכיוון אקסונים הם כל כך צפוף וחופפים ליד גופי תא (איור 2Aa, Ba), אזור היקפי יותר של גיליונות אקסונים נמדדו כאשר אקסונים אינם חופפים כל כך (איור 2Ab, Bb, למשל, אזור היקפי הרחק 2 שדה של השקפה או יותר מלבד גוף התא עם מיקרוסקופ (60X)). כאשר האזור ההיקפי של גיליון סיבי נותח על-ידי עדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה גבוהה (60x), vGlut1 ו-Munc18-1 נצבר באופן ברור הסינפסות של סיבי תחת החרוזים (איור 3). לפעמים, אותות פלורסנט של חלבונים סינפטיים סינפטית כמו vGlut1 קשה להתגלות באזור סיבי מחוץ החרוזים, כי אלה חלבונים הסינפטיות הסינפטית להצטבר כל כך הרבה תחת חרוזים. במקרה של Munc18-1, אותות פלורסנט ניתן לזהות חלש באזור סיבי מחוץ החרוזים.

כדי לכמת רמת הצטברות של חלבונים סינפטיות הנגרמת על ידי LRRTM2 חרוזים, עוצמות פלורסנט של אקסונים תחת החרוזים ומחוץ החרוזים נמדדו, ולאחר מכן מחושב כמו "מדד הצטברות חלבון" (איור 4a, ו מתואר בסעיף פרוטוקול בפירוט). ניסויים בקורס זמן הפגינו כי הצטברות של vGlut1 ב טרום הסינפסות גדל באופן משמעותי ב 30 דקות (איור 4B). מצד שני, Munc18-1 הצטברות החלה להגדיל באופן משמעותי ב 2 h, ולהגיע לרמה ב 4 h (איור 4C). נתונים אלה מצביעים על כך vGlut1 חלבון שלפוחית הסינפטית מצטבר ב טרום הסינפסות מוקדם יותר מאשר חלבון אזור פעיל Munc18-1. הצטברות Munc18-1 ב טרום הסינפסות של Fmr1-KO נוירונים הגדילו 1.5 פעמים יותר מאשר אלה בסוג פראי (WT) (איור 4c), המציין מעורבות של fmrp בהצטברות Munc18-1. לאחר מכן, כדי להבחין את הצטברות Munc18-1 עקב הובלה של גופי תא או תרגום מקומי ב axons, השפעה של החלבון סינתזה אניסומצין מעכבי נבדקו על הצטברות בנוכחות או העדר גופי תא (איור 4D) . Anisomycin דיכא את Munc18-1 הצטברות באופן משמעותי ב אקסונים (איור 4d), המציין כי הצטברות היא חלבון סינתזה התלויים. הצטברות הסינפסות של אקסונים ללא גופי תאים לא היה שונה באופן משמעותי לזה עם גופי תא (איור 4d). תוצאות אלה מרמזות כי הצטברות של Munc18-1 ב טרום הסינפסות נגזרות בעיקר axons, אבל לא הובלה של Munc18-1 מגופי התא. אם הצטברות של חלבונים סינפטית מדוכאים מראש של אקסונים על ידי הסרת גופי תא, הוא נחשב כי ירידה זו נובעת הובלה מגופי התא. למעשה, כאשר בדקנו את הצטברות של החלבונים החדשים מסונתז לאחרונה metabolically מתויג על ידי צבע פלורסנט, הסרת גופים תא מופחת באופן משמעותי את הצטברות של חלבונים מסונתז הכולל לאחרונה, לעומת טרום הסינפסות של אקסונים עם גוף תא8. למרות הצטברות Munc18-1 ב Fmr1-KO גדל יותר לעומת wt, anisomycin דיכא את הצטברות ברמה דומה ל wt והסרת גופים תא לא היתה השפעה על הצטברות (איור 4d). תוצאות אלה מציעות כי FMRP מעורב בתרגום מקומי של Munc18-1 ב-axons.

תוצאות הנציגה המוצגות כאן מדגימות כי שיטה זו מתאימה לחקור כיצד החלבונים הסינפטיים מצטברים באופן מאורגן על-ידי ניסויי קורס זמן, ולבחון את מקור החלבונים הסינפטיים (הובלה מגופי תאים או מקומיים תרגום ב axons) על ידי הסרת גופי תא.

Figure 1
איור 1. הערכת מבנה טרום-סינפסה. והסרת גופי תאים מכדור העצב
(א) שיטת היווצרות טרום הסינפסה באמצעות biotinylated LRRTM2 streptavidin חרוזים כדי לגרום את הסינפסות באקסונים של תרבות כדור העצב מוכן מE16. LRRTM2, חלבון פוסט-סינפטית, נקשר neurexin (NRXN) ולשמש מארגן טרום סינפסה. חרוזים Streptavidin מצוקדים לאזורי biotinylated LRRTM2 (LRRTM2 חרוזים) הוחלו ב DIV11-12 לתרבות כדור העצב כדי לגרום טרום הסינפסות. איור זה השתנה מהפרסום הקודם8. (ב) קצה הקצה הצהוב נחתך והוצב באזור הגוף התא של תרבות כדור העצב בזווית 45 °. גופות התאים הוסרו על ידי שאיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
. איור 2 Munc18-1 הצטברות בטרום סינפסות בנוכחות והעדר גופי תא של כדור העצב.
(א) לאחר הדגירה 4 h עם חרוזים LRRTM2, חלבון האזור הפעיל Munc18-1 שנצבר באתרים טרום סינפטיות המושרה אקסונים (הפאנל העליון; מערכת ניסיונית, אמצע; שלב התמונה, נמוך יותר; אם תמונות של הצטברות Munc18-1). תמונות נתפסו כתמונות הגדלה נמוכה באמצעות עדשת 10X והגדלה בינונית (1.5 X) כדי לראות את התמונה כולה המורכבת כדור עצב, axons, ו חרוזים. ריבועים מקווקווים מציינים את האזור של כדור העצב עבור מיקום הדמיה מדויק של חרוזים. סרגל קנה מידה, 20 יקרומטר (שמאל; תמונה מקורית), 10 יקרומטר (מימין; תמונה מוגדלת). (ב) Munc18-1 הצטברו היטב גם בהיעדר גופי תא באתרים טרום סינפטיות המושרה באקסונים. תוצאה זו מציינת כי אקסונים יכולים לשרוד וליצור הסינפסות גם לאחר הסרת גופי תאים לפחות 4 h. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
. איור 3 הצטברות של vGlut1 ו-Munc18-1 ב טרום הסינפסות של אקסונים עם וללא גופי תא.
סמן סינפטיות הvGlut1 (ירוק) ו-Munc18-1 (אדום) שנצבר בטרום הסינפסות 4 h לאחר הוספת חרוזים LRRTM2. (החלונית העליונה; עם גופי תאים, נמוך יותר; ללא גופי תאים). תמונות נתפסו באמצעות 60X שמן טבילה עדשה להגדלה גבוהה כדי למדוד את עוצמת פלורסנט. עיגול מקווקו התווה את מיקום החרוזים. Munc18-1 הצטברו כמעט במידה דומה בנוכחות והעדר גופי תא ב טרום הסינפסות אך הצטברות vGlut1 מופחתת ללא גוף תא8. סרגל בקנה מידה, 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. נוהל של IF מדידה עוצמה וההשפעה של גופים תא הסרת וחלבון סינתזה מעכבי על Munc18-1 הצטברות בכדורי תא העצב.
(א) דיאגרמה הראתה את שיטת הקוונפיקציה של עוצמת IF באתר המושרה-טרום סינפטיות ב אקרון של תרבות כדור העצב. סרגל בקנה מידה, 5 μm. הפרטים מתוארים בסעיף הפרוטוקולים. (ב) מסלול הזמן של הצטברות vGlut1 ב טרום הסינפסות המושרה עם LRRTM2 חרוזים. נתונים המוצגים הם ממוצע ± SEM עבור n = 20. ANOVA דו-כיוון עם מבחן השוואה מרובה של Tukey. * *p < 0.01. (ג) מסלול הזמן של הצטברות Munc18-1 ב WT ו- Fmr1-KO טרום-מתחת חרוזי LRRTM2. נתונים המוצגים הם ממוצע ± SEM עבור n = 20, ANOVA דו-כיוון עם מבחן השוואה מרובה של Tukey. נ, לא משמעותיים; * *p < 0.01, שונה באופן משמעותי בין WT ו-KO. (ד) גרף הבר הראה Munc18-1 רמת הצטברות ב טרום הסינפסות של WT ו Fmr1-KO כדורי נוירונים בנוכחות או היעדרות של 25 μm Anisomycin (aniso) עם (הקשר +) או ללא (cb-) הגופים התא. נתונים המוצגים הם ממוצע ± SEM עבור n = 20. ANOVA דו-כיוון עם מבחן השוואה מרובה של Tukey. * *p < 0.01, נ, לא משמעותי. המצוין p < 0.01, שונה באופן משמעותי עם ובלי anisomycin. נתונים אלה שונו מהפרסום הקודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1. וקטור ביטוי אופניים עבור LRRTM2-ecr (אזור המיליתאי) ובירה (biotin ליגאז מתוך E. coli ).
בין LRRTM2-ECR ובירה רצפי קידוד, יש רצף הזנה הפנימי של אתר הריבוזומבית (IRES) המאפשר לבטא את שני החלבונים מ-mRNA יחיד. היזם hEF1-HTLV כוננים ב-mRNA, ושני החלבונים מופרשים באמצעות רצפי פפטיד איתות לאחר התרגום. LRRTM2-ECR רצף קידוד מצורף למספר רצפים של תגי פפטיד (DYKDDDDK, TEV, Myc ו התגים שלו) ו Biotin הרצף ביוטין (BAS). בירה מצורפת לדייקלייב תגית. בירה מופרש הביוטיטים ליזין של רצף BAS של LRRRTM2-ECR כדי לאגד לחרוזי streptavidine. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו שיטה הרומן לבחון היווצרות preסינפסה מגורה עם LRRTM2-חרוזים באמצעות תרבות כדור העצב. כיום, רוב שיטת היווצרות טרום-סינפסה כוללת מחרוזות מצופות פולי-ליזין (PDL) והתרבות המונתק/חדר מיקרופלואידיג20,21,22. אחד היתרונות של שיטה זו הוא LRRTM2 חרוזים. בעוד LRRTM2 אינטראקציה עם neurexin ליצור מפרסינפסות באופן ספציפי11,12,13, PDL-חרוזים מעורר הן מרגש ו מעכבות טרום הסינפסות לא במיוחד20. בשיטה זו, מארגני טרום-סינפסה, שחבריה הם מעל 10 חלבונים3, חלים על מנת לגרום לסינפסות על ידי שינוי תחום החילוץ של חלבון biotinylated בהתאם למטרה ניסיוני.

יתרון נוסף הוא תרבות. כדור העצב במקרים מסוימים, השתמשו בתרבות המקובלת כדי לנתח את היווצרות הפרסינפסה20. עם זאת, התרבות המונתק אינה מתאימה לנתח רמות נמוכות של חלבונים סינפטיות בתוך טרום הסינפסות, משום שאותות מכריעים בגופי תאים ודנדריטים מפריעים לאותות הפרפסות. במקום זאת, חלק מהקבוצות משתמשות בתרבות המונתק בחדר מיקרופלואידיג, שהוא מכשיר מיוחד לאקטונים תרבותיים וגופי תאים בנפרד ב -2 שחזורים21,22. באמצעות תא microflu, גיליון סיבי נוצר בתוך תא סיבי, וגופים תא מסוגלים להסיר מתא הגוף התא, בדומה תרבות כדור העצב. עם זאת, קאמרית microflu, c הוא מכשיר מיוחד, והוא דורש מיומנויות מסוימות כדי לשמור על מצב תרבותי קבוע. התרבות כדור תא העצב אינו נחוץ כדי להשתמש מכשירים מיוחדים, והוא קל יחסית להיות מוצג כשיטה ניסיונית חדשה. בגלל המהות של תרבות כדור העצב היא רק למקם אגרגטים התאים העצביים (כדורי תא העצב) לתוך זכוכית תחתית הצלחת/תא, זה יכול להיות בשילוב בקלות עם שיטות אחרות. לדוגמה, הוא נחשב כי תרבות כדור העצב באמצעות LRRTM2-חרוזים הוא ישים עבור הקרנת תוכן גבוה כדי למדוד את הזריחה של 10-20 חרוזים באזור באותו זמן.

הצעד הקריטי בפרוטוקול זה הוא ציפוי באמצעות PLL. אם ציפוי pll אינו אחיד, אקסונים של כדורי עצב לא להאריך אחיד לכל הכיוונים. זה מפריע לניתוח יעיל. של מערך טרום-סינפסה אנו משתמשים שמיכות זכוכית ומנות התחתון זכוכית, עם זאת, זכוכית היא לפעמים לא כל כך נקי עבור תרבות עצבית וציפוי אחיד עם PLL. בפרוטוקול זה, בתחילה, שמיכות זכוכית ומנות בתחתית הזכוכית הם ספוגים ניקוי נייטרלי ללא זרחן עבור 1-3 לילה, ולאחר מכן שטף 8 פעמים עם מים באולטרטהורים. אנו משתמשים PLL אשר משקל מולקולרי > 300,000 כדי להפחית את הריכוז שלה (15 μg/mL) לרקע בלתי רצוי נמוך. אם משקל מולקולרי נמוך של PLL (למשל, 30000-70000) משמש, ריכוז גבוה יותר (100 μg/mL) יש צורך להרחיב axons.

הגבלת שיטה זו היא כי תרבות כדור העצב לא יכול לשמור על > DIV15 16. אקסונים של כדורי תא העצב מפוצלים אחרי DIV15-16. אקסונים מפוצל לא לייצר כל preסינפסה לאחר LRRTM2 היישום חרוזים. לפיכך, שיטה זו אינה ישימה לניתוח נוירונים בוגרים (> DIV21). עם זאת, ברוב המקרים11,12,21,22, שיטת היווצרות טרום-סינפסה משתמשת בנוירונים צעירים שאינם מתורבתים עד DIV14. מגבלה נוספת היא כי אקסונים ללא גוף תאים לא יכול לשרוד מעל 4 שעות. ניתחנו את ההצטברות של 5 חלבונים סינפטיות עד כה, הצטברות של כל החלבונים שבדקנו הגיעו כמעט לרמה בתוך 4 h (התבוננות שלא פורסמה). הוא נחשב כי חלבונים סינפטית לצבור מספיק ב 4 כדי לנתח איפה חלבונים סינפטיות נגזרות (גוף התא או axon).

שילוב של תרבות כדור העצב עם LRRTM2-חרוזים היא פשוטה יחסית גמיש כדי להתאים פלטפורמות ניסיוני רבים. כבר החלתי שיטה זו כדי למדוד פעילות פרסינפטית מראש באמצעות AM1-43 צבע (התבוננות שלא פורסמה). שיטה זו נחשבת לישימה עבור הקרנת תפוקה גבוהה. שיטת היווצרות preסינפסה ניתן להחיל הקרנת תוכן גבוה על ידי צביעת חלבונים סינפטיות ב טרום סינפסות נוצר תחת LRRTM2-חרוזים. שיטה זו תתרום למצוא תרכובות חדשות לריפוי מחלות נוירולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי JSPS גרנט-in-סיוע עבור מחקר מדעי (KAKENHI) (C) (מס ' 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). אנו מודים לד ר טרוקקאזא נוג'י ולגב מקקיקו ניוזאקי (אונ' יוקוהמה סיטי) באדיבות LRRTM2 חלבון biotinylated. אנו מודים גם לחונלי וואיצ'י ולרי אישיי לקבלת סיוע טכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28, (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5, (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203, (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455, (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53, (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27, (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30, (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74, (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61, (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1, (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286, (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60, (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16, (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16, (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20, (13), 3085-3098 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics