السابق فيفو أوكولوموتور شريحة الثقافة من الفئران الجنينية GFP التعبير عن التصوير الفاصل الزمني من نمو الأعصاب أوكولوموتور

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يسمح فحص شريحة الجسم الحي السابق بالتصوير في الوقت الحقيقي. يتم إنشاء شرائح عن طريق تضمين E10.5 IslMN: GFP الأجنة في agarose، وتقطيع على الاهتزاز، وتنمو في حاضنة المرحلة العليا. يتم تقييم دور مسارات توجيه axon عن طريق إضافة مثبطات إلى وسائل الإعلام الثقافية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

حركات العين دقيقة حاسمة للرؤية، ولكن تطوير نظام المحرك العين، وخاصة المسارات الجزيئية التي تسيطر على توجيه محور عصبي، لم يتم توضيحها بشكل كامل. ويرجع ذلك جزئياً إلى القيود التقنية على الاختبارات التقليدية لتوجيهات المحاور. لتحديد إشارات توجيه axon إضافية تؤثر على العصب oculomotor، تم تطوير اختبار شريحة الجسم الحي السابق لتصوير العصب الحركي في الوقت الحقيقي كما ينمو نحو العين. E10.5 يتم استخدام الأجنة Isl MN-GFP لتوليد شرائح الجسم الحي السابق عن طريق تضمينها في أغاروز، وتقطيعها على الاهتزاز، ثم زراعتها في حاضنة مجهر المرحلة أعلى مع التصوير المجهري الفاصل الزمني لمدة 24-72 ح. في توقيت الجسم الحي من نمو المحاور من النواة إلى المدار. يمكن إضافة مثبطات الجزيئات الصغيرة أو البروتينات المؤتلفة إلى وسائل الإعلام الثقافية لتقييم دور مسارات توجيه المحاور المختلفة. هذه الطريقة لديها مزايا الحفاظ على المزيد من البيئة الدقيقة المحلية التي من خلالها المحاور اجتياز، وليس الساكسوتوميس المحاور المتنامية، وتقييم المحاور في نقاط متعددة على طول مسارها. كما يمكن أن تحدد الآثار على مجموعات فرعية محددة من المحاور. على سبيل المثال، تثبيط CXCR4 يسبب المحاور لا تزال داخل الدماغ المتوسط لتنمو الظهرية بدلا من فينرالي، ولكن لا تتأثر المحاور التي خرجت بالفعل ventrally.

Introduction

يوفر نظام المحرك العيني نظام أنيق للتحقيق في آليات توجيه أكسون. وهو غير معقد نسبيا، ويتألف من ثلاثة أعصاب الجمجمة innervating ستة عضلات خارج العين (EOMs) التي تحرك العين، وlevator palpebrae superioris (LPS) الذي يرفع الجفن. العصب الحركي الداخلي LPS وأربعة EOMs - المائل السفلي والعضلات الوسيطة، السفلي، والمستقيمة متفوقة. أما الأعصاب الأخرى، وهي التروكلير وعبدهسين، فكل منهما يُعد عضلة واحدة فقط، وعضلة مستقيمة مائلة وجانبية متفوقة، على التوالي. توفر حركات العين قراءة سهلة، تظهر ما إذا كان التداخلي مناسبًا أو مفقودًا أو شاذًا. بالإضافة إلى ذلك، هناك اضطرابات حركة العين البشرية التي تنتج عن العجز في تطوير الخلايا العصبية أو توجيه axon، ويطلق عليها مجتمعة اضطرابات التأذيب القحفي الخلقية (CCDDs)1.

على الرغم من هذه المزايا، ونادرا ما يستخدم نظام السيارات العين في الدراسات التوجيهية axon2،3،4،5،6،7،8، 9 , 10، وذلك بسبب العيوب التقنية. في المختبر axon التوجيه الاختبارات لديها العديد من العيوب11. اختبار الثقافة المشتركة، التي يتم فيها زراعة explants الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع explants من الأنسجة المستهدفة12 أو الخلايا المنقولة13، تعتمد على كل من التماثل من explant وتحديد المواقع دقيقة بين explant والأنسجة المستهدفة. شريط الاختبارات14،15، التي يتم وضع اثنين من العظة في المشارب بالتناوب ويتم تقييم المحاور للنمو التفضيلي على شريط واحد، تشير فقط إلى أن الركيزة واحدة هي الأفضل من الأخرى، وليس أن أي منهما جذابة أو مثير للاشمئزاز، أو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. غرف Microfluidics يمكن أن تشكل التدرجات الكيميائية الدقيقة، ولكن موضوع المحاور المتنامية لالقص الإجهاد16،17،18، والتي يمكن أن تؤثر على نموها. وعلاوة على ذلك، في كل من هذه النهج، يتطلب جمع النباتات الخارجية أو الخلايا المفككة أن تكون المحاور المتناجة، وبالتالي فإن هذه الاختبارات تدرس في الواقع تجديد أكسون، بدلاً من نمو المحاور الأولي. وأخيراً، فإن هذه النُهُج في المختبر تزيل البيئة الدقيقة التي تؤثر على المحاور واستجاباتها للإشارات على امتداد نقاط مختلفة من مسارها، وتختبر عادة إشارة واحدة فقط في عزلة. ومما يضاعف من هذه العيوب، أن صغر حجم كل نواة في نظام المحرك العيني يجعل التشريح صعباً من الناحية التقنية إما بالنسبة للنباتات المنقطعة أو الثقافات المفككة. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحركية العينية عادة ما تكون غير متجانسة، لديها موت خلايا كبير، وتعتمد على الكثافة، مما يتطلب تجميع الخلايا من أجنة متعددة (Ryosuki Fujiki، الاتصال الشخصي). في طرق الجسم الحي، ومع ذلك، بما في ذلك نماذج الماوس خروج المغلوب، غير مناسبة للاستخدام للفحص، نظرا للوقت والنفقات المطلوبة.

الطرق التي تم تطويرها لثقافة الأجنة الكاملة19 تسمح بوسم الخلايا المهاجرة20 أو حصار جزيئات محددة21، ولكن الثقافات الجنينية كلها تتطلب الحضانة في زجاجات الأسطوانة التي تحول دون التصوير في الوقت الحقيقي من المسمى الهياكل. التقنيات الجراحية التي تسمح بالتلاعب في الجنين ومن ثم مزيد من التطور اللاحق إما في الرحم أو في بطن الأم (الحفاظ على اتصال المشيمة)22 ممكنة أيضا، ولكن هذه أيضا لا تسمح بفاصل زمني التصوير.

للتغلب على العقبات من الاختبارات في المختبر والسماح بالفحص السريع لمسارات الإشارات، تم تطوير تقنية ثقافة الشريحة الجنينية من الجسم الحي السابق23، مقتبسة من بروتوكول نشر سابقا لنمو الأعصاب المحيطية24. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تصوير العصب الحركي النامي مع مرور الوقت في وجود العديد من الهياكل المحيطة على طول مساره، بما في ذلك أهداف EOM. من خلال إضافة مثبطات جزيء صغير، وعوامل النمو، أو العظة التوجيه إلى وسائل الإعلام الثقافة، يمكننا تقييم الاضطرابات التوجيه في نقاط متعددة على طول مسار محور محور محور، مما يسمح بتقييم أسرع للنمو المحتمل ة وعوامل التوجيه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وتنفيذها وفقا لبروتوكولات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال.

1. التزاوج في الوقت المناسب

  1. مكان ISLMN:GFP (جزيرة الخلايا العصبية الحركية بروتين الفلورسنت الأخضر; MGI: J:132726; جاكس Tg (Isl-EGFP *) 1Slp / J الأسهم رقم: 017952) الذكور والإناث الفئران معا بين عشية وضحاها. وزن الإناث والأوزان القياسية قبل التزاوج.
    ملاحظة: ISLMN:GFP تسميات على وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مع GFP farnesylated التي ليست سامة للخلايا، وتوطين غشاء الخلية من الخلايا العصبية الحركية ومحاورها، ويسمح للأعصاب أن تصور خلال التنمية25. ويمكن أيضا استخدام خطوط أخرى تحمل علامة الفلورسنت.
  2. تحقق من وجود سدادات مهبلية في الصباح الباكر. يتم تعيين تاريخ تحديد المكونات على أنه E0.5.
  3. تأكد من الحمل باستخدام زيادة الوزن و/أو الموجات فوق الصوتية في E10.5. السدود الحامل يجب أن اكتسبت ما لا يقل عن 1 غرام يمكن رؤية الأجنة على الموجات فوق الصوتية في E10.5.

2. إعداد الكواشف والاهتزاز لثقافة شريحة

  1. إعداد 500 مل من العازلة التقطيع: إضافة 5 مل من HEPES و 5 مل من البنسلين / العقديات إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) دون Ca2 + و Mg2+.  البرد إلى 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تخزين المخزن المؤقت تشريح إضافية في 4 °C ويمكن استخدامها لتجارب ثقافة الشريحة في المستقبل.
  2. إعداد 50 مل من وسائل الإعلام الثقافة: في غطاء محرك السيارة المعقمة، إضافة 12.5 مل من HBSS، 12.5 مل من مصل البقر الجنيني، 250 ميكرولتر من الجلوكوز، 250 ميكرولتر من L-الجلوتامين، 125 ميكرولتر من HEPES إلى 24.4 مل من DMEM فلوروبرايت. (التركيزات النهائية: FlouroBright DMEM مع 25٪ HBSS، 25٪ FBS، 0.5٪ الجلوكوز، 1 MM الجلوتامين، و 2.5 مليون متر HEPES.).  تُسخّن وسائل الإعلام الثقافية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي معقم.
    ملاحظة: يمكن تخزين وسائط الثقافة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
    1. في غطاء محرك السيارة العقيم، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا.  إضافة إدراج ثقافةالخلية (جدول المواد) إلى كل بئر.  توضع في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية و 5% من ثاني أكسيد الكربون.
  3. إعداد 4٪ درجة حرارة منخفضة ذوبان أغاروز: حل 2 غرام من درجة الحرارة منخفضة ذوبان أجاروز في 50 مل من PBS المعقمة. الميكروويف في فترات 30-60 s حتى يذوب بالكامل. توضع في حمام مائي 40 درجة مئوية للحفاظ على السائل.
    ملاحظة: يمكن تخزين أغاروز إضافية في درجة حرارة الغرفة (RT) وذاب لتجارب ثقافة شريحة في المستقبل.
  4. إعداد الاهتزاز: وضع شفرة جديدة على الاهتزاز. التحقق من الإعدادات: سمك 400-450 درجة مئوية. ضع بعض الثلج في الغرفة الخارجية استخدام غرفة ومرحلة مخصصة للشرائح الحية. لا تستخدم نفس غرفة الاهتزاز للأنسجة الثابتة كما المثبت المتبقية يمكن أن تكون ضارة للشرائح.
  5. إعداد مرحلة المجهر أعلى حاضنة إلى 37درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  6. الاستعداد للتشريح: أدوات جراحية نظيفة ورذاذ مع الإيثانول 70٪. ملء اثنين من أطباق بيتري مع HBSS، ووضع على الجليد. فتح 12 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا ووضع الغطاء على الجليد مع الجانب السفلي التي تواجه ما يصل. فتح 6 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا ووضع إدراج غشاء ثقافة الخلية و 1.5 مل وسائل الإعلام ثقافة الخلية في كل بئر. قبل تسخين لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. حصاد E10.5 الأجنة وإعداد شرائح

ملاحظة: يجب أن يتم إجراء كافة الخطوات من هذه النقطة في أسرع وقت ممكن. إبقاء الأجنة على الجليد في جميع الأوقات.

  1. قتل الرجل في السد الحامل (E10.5) في غرفة CO2. إجراء خلع عنق الرحم.
  2. رش البطن مع الإيثانول 70٪. قطع فتح البطن مع مقص، وإزالة الرحم ووضعها في طبق بيتري مع HBSS الجليد الباردة لغسل الدم بسرعة. نقل الرحم غسلها إلى بيتري الثانية مليئة طبق الجليد HBSS.
  3. تحت نطاق تشريح، إزالة الأجنة من قرن الرحم والحصاق السلوي الفردية. ضع الأجنة على الجانب السفلي من غطاء طبق 12 بئر. حافظ على الثلج
  4. تحت نطاق تشريح، استخدم ورقة التصفية لإزالة أي سائل يحيط بكل جنين.
    ملاحظة: سوف تلتصق الأجنة بورقة التصفية إذا تم لمسها.
  5. تضمين الأجنة في أغاروز. صب الأغروز المذاب على كل جنين لتغطية ذلك. حافظ على الثلج بمجرد أن تصلب الأجاروز، الوجه كل جنين وصب أجاروز إضافية على الجانب الآخر. حافظ على الثلج
  6. باستخدام نطاق تشريح الفلورسنت، تقليم الأجاروز حول كل جنين لذلك سيتم توجيهها بشكل صحيح عند لصقها على مرحلة الاهتزاز. النواة الحركية وفرط الأكسون المبكر هي الفلورسنت. محاذاة الجنين بحيث تشكل النواة، والمحاور التي تنمو، والعين خطًا، وتقليم الأجاروز بشفرة حلاقة مقطوعة بالتوازي مع هذا الخط (الظهرية للجنين، انظر الشكل 1A).
    ملاحظة: هذا سيكون الجانب لصقها على مرحلة الاهتزاز (سيتم وضع الجنين على ظهره، رئيس أقرب إلى شفرة الاهتزاز). يجب أن يكون الخط بين النواة الحركية والعين موازية لشفرة الاهتزاز.
  7. ملء غرفة الاهتزاز مع الجليد الباردة شريحة العازلة. Superglue الجنين إلى مرحلة الاهتزاز بحيث شفرة سوف تكون موازية مع نواة oculomotor والعينين. بمجرد أن يجف الغراء الفائق، غمر مرحلة الاهتزاز حتى يتم توجيه الجنين التي تواجه بعيدا عن شفرة.
  8. شريحة 400-450 شرائح ميكرومتر.  جمع كل شريحة مع الأنابيب نقل معقمة. توضع في مخزن مؤقت للتقطيع البارد.
  9. تحت نطاق تشريح، واختيار شريحة تحتوي على النوى oculomotor والعينين. باستخدام أنبوب نقل معقمة، وضعه على ثقافة الخلية إدراج في لوحة الآبار 6. العودة لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يكون شخص واحد تشريح وآخر وضع الشرائح. تقليل الوقت بين التقطيع ووضعها في الحاضنة.
    ملاحظة: يجب توجيه الشرائح بطريقة تكون فيها الفلورة القصوى المنبعثة من النوى والمحاور الأقرب إلى هدف مجهر التصوير. على المجهر المقلوب ، يجب وضع الشرائح على الغشاء مع النوى والمحاور الأقرب إلى الهدف تحت اللوحة.
  10. إزالة أغاروز المتبقية من مرحلة الاهتزاز، superglue الجنين التالي إلى المرحلة وتكرار الخطوات 3.7-3.9 حتى يتم تقطيع جميع الأجنة ومطلي.
  11. إضافة مثبط أو جزيء المؤتلف من الاختيار إلى وسائل الإعلام في كل بئر لخلق منحنى الجرعة استجابة.  تمييع في المذيبات المناسبة.
    ملاحظة: في حالة استخدام DMSO، استخدم درجة زراعة الأنسجة فقط DMSO. بدلا من ذلك، يمكن وضع حبات البروتين eluting في مواقع محددة على شريحة.
  12. ضععلى المجهر في غرفة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.  تعيين المجهر لاتخاذ التباين المرحلة والصور الفلورية من كل شريحة كل 30 دقيقة (أو في كثير من الأحيان إذا رغبت في ذلك). يمكن الحفاظ على شرائح لمدة 48-72 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج العادية: يوفر الشكل 1 مخططًا للتجربة. بدءا من وقت مبكر من E9.5 في الماوس، تبدأ المحاور الأولى في الخروج من نواة oculomotor26. بواسطة E10.5، يمكن رؤية العصب الحركي اللفاف، الذي يحتوي على الخلايا العصبية الرائدة في وقت مبكر، في mesenchyme. هناك تباين كبير بين الأجنة في E10.5 (حتى داخل نفس القمامة) في مدى تقدم العصب نحو المدار، على الأرجح بسبب الاختلافات في النمو لبضع ساعات. خلال تطور الرحم العادي، تصل أول محاور أوسولوموتور إيجابية من GFP إلى المدار/العين خلال الـ 18-24 ساعة التالية (بواسطة E11.5)، ثم تبدأ في التفرع إلى أهدافها النهائية27. في ثقافة الشريحة، يتم تلخيص هذا التوقيت (الشكل 2،فيديو 1). تنمو الشريحة وتتوسع (في جميع الاتجاهات) لمدة تصل إلى 72 ساعة، ويمكن رؤية المحاور التي تمتد من النواة نحو العين. لقد وجدنا أول 36-48 ح الأكثر فائدة لتقييم نمو أكسون oculomotor. ويمكن في بعض الأحيان أن ينظر إلى الخلايا العصبية الحركية تتحرك داخل النواة (لا تظهر). في بعض الشرائح، اعتمادا على التوجه، نواة trochlear موجودة أيضا. تمتد محاور Trochlear أفقياً داخل الشريحة وغالباً ما تتوقف، لأن مسارها الطبيعي هو الخروج من نواة trochlear أفقياً، قبل أن تتحول إلى دورسالي وcaudally، والتي من شأنها أن تكون خارج الشريحة. في بعض الأحيان، يبدو أن المحاور التروكلير للانضمام مع محاور oculomotor وتتحول نحو العين، مما يجعل من الصعب تفسير شريحة، كما أن تلك المحاور قد يكون لها تأثير ثانوي على توجيه محاور oculomotor.

مثال على تثبيط مسار توجيه محور محور مهم: تثبيط CXCR4 الإشارات يسبب الظهربدلاً من النمو البطني للمحاور الحركية. قمنا بتقييم دور CXCR4 الإشارات على تطوير oculomotor عن طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل (1.26 درجة مئوية) من AMD3100، وهو مثبط جزيء صغير قابل للذوبان في الماء من CXCR428، مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة بمجرد إعداد ثقافة شريحة. ويمكن بعد ذلك رؤية محاور oculomotor الخروج من نواة oculomotor dorsally وتنموبعيدا عن المدار ("إلى الوراء") (الشكل 2،فيديو 2). تلك المحاور التي كانت قد غادرت بالفعل منتصف الدماغ وكانت في طريقها إلى المدار في E10.5 لا تزال على طريقها. تثبيط CXCR4 يؤثر أيضا على النمو العام للشريحة.

توجيه شريحة أمر بالغ الأهمية. الشرائح غير قابلة للتفسير إذا لم تكن موجهة بشكل صحيح. وترد بعض الأمثلة على الشرائح الموجهة بشكل غير صحيح في الشكل 3. إذا كان الجنين يميل إلى جانبه، فقط نواة oculomotor واحدة في شريحة (الشكل3A).  إذا كان الجنين جزءا لا يتجزأ يميل بعيدا جدا نحو ظهره، والعينين ليست في شريحة، وبدلا من ذلك الطرف العلوي والدماغ الخلفي أو الحبل الشوكي قد يكون في شريحة (الشكل3B).  في هذه الحالة ، لا يوجد المسار الطبيعي للمحاور الحركي، وهي تميل إلى النمو بشكل عشوائي. أثناء وضع شريحة على غشاء الثقافة، فإنه يمكن أن تصبح مطوية (الشكل3C).

المذيبات يمكن أن تكون سامة. وينبغي توخي الحذر عند حل مثبطات أو عوامل النمو في المذيبات العضوية. ويبين الشكل 4 مثالاً على شريحة ماتت بعد إضافة الإيثانول إلى وسائط الإعلام. وأضيف 118 ميكرولتر إلى 1.5 مل من الوسائط (التركيز النهائي 7.8 في المائة)، وثبت أن هذا التركيز العالي سام. لمنع هذا، حل solutes في الحد الأدنى من المذيبات ممكن (إلى حد الذوبان). كلما كان ذلك ممكنا، تذوب في الماء. إذا تم استخدام DMSO، تأكد من أنه معقمة، والأنسجة ثقافة الصف DMSO.

Figure 1
الشكل 1 التخطيطية: E10.5 Isl MN-GFP الأجنة (A:الصورة، B:التخطيطية) يتم شرائح على الاهتزاز (400-450 ميكرومتر سميكة) بحيث تشمل أقسام كل من نواة oculomotor والمدار. خطوط متقطعة موازية في A و B تدل على موقع التخفيضات الاهتزاز. يظهر الخط المتقطع السفلي في A حيث ينبغي اقتطاع الأجاروز ولصقها على مرحلة الاهتزاز. (C) يتم وضع أقسام مسطحة على غشاء زراعة الأنسجة، مما يسمح بتبادل المواد الغذائية والغازات، ووضعها في حاضنة المرحلة العليا للميكروسكوب الفاصل الزمني. في هذه المرحلة, يمكن إضافة مثبطات إلى وسائل الإعلام النمو. (د) يمكن الحفاظ على الثقافات لمدة 24-72 ساعة، ويمكن رؤية محاور oculomotor تنمو إلى العين. تم تكييفها بإذن من ويتمان، وآخرون. al. 201823. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 يؤدي تثبيط CXCR4 CN3 خطأ التوجيه. شرائح الثقافات من E10.5 Isl-GFP الأجنة المصورة في 0، 12، 24، و 36 ساعة في الثقافة. تُظهر اللوحة العلوية جنينًا للتحكم من النوع البري وينمو النفثالينات 3 (الأخضر) نحو العينين والفروع على نطاق واسع على مدى 36 ساعة. انظر أيضا الفيديو 1. لوحة أسفل يظهر شريحة مع 1 ميكروغرام / مل AMD3100 (مثبط محدد لCXCR4) وأضاف وaxons الخروج من نواة oculomotor dorsally. تلك التي كانت قد خرجت بالفعل فينرالي تستمر نحو العين. انظر أيضا الفيديو 2. D: dorsal, V: ventral, E: eye, N: نواة oculomotor, SMN: الخلايا العصبية الحركية الشوكية, الأسهم: محاور oculomotor (أبيض: إسقاط النمط البري, أصفر: التوقعات الشاذة). شريط مقياس يساوي 200 ميكرومتر. انظر أيضا الفيديو 1 والفيديو 2.  وقدم رقم مماثل يبين أمثلة أخرى في ويتمان، وآخرون. al. 201823. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 توجيه الشرائح أمر بالغ الأهمية. الصور الأولية (الوقت 0 ساعة) من شرائح ممثل غير موجهة. يظهر شريحة حيث كان يميل الجنين إلى الجانب بحيث إسقاط محاور CN3 تم الاكستومات. إسقاط المحاور موجودة فقط على الجانب الأيمن من الشريحة (السهم).  B يظهر شريحة فيها كان يميل الجنين إلى الوراء حتى النوى CN3 مع إسقاط المحاور (السهم) مرئية ثنائيا، ولكن العينين ليست موجودة في شريحة. بدلا من ذلك يمكن رؤية الخلايا العصبية الحركية الشوكية (SMN) وتوقعات الخلايا العصبية الحركية إلى الأطراف. C يظهر شريحة التي مطوية أثناء وضع على الغشاء. يجب التخلص من الشرائح مثل تلك المعروضة هنا. تمثل أشرطة المقياس 500 ميكرومتر في كل لوحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 المذيبات يمكن أن تكون سامة. التصوير بالفاصل الزمني لثقافات الشرائح من أجنة E10.5 Isl-GFP في 0 و 12 ساعة في الثقافة. شريحة مثقفة في وسائل الإعلام مع عدم وجود إضافات (A-B) ينمو عادة لمدة 12 ساعة مع محاور CN3 إسقاط نحو العين. شريحة مستتزرعة في وسائل الإعلام مع تركيز عال من الإيثانول (7.8٪) (C-D) لا ينمو بشكل طبيعي. في 12 ح، CN3 لم تنمو وبالكاد مرئية، والأنسجة قد بدأت في التفكك. تمثل أشرطة المقياس 500 ميكرومتر في كل لوحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Video 1
فيديو 1: نمو CN3 في ثقافة الشريحة. تصوير بفاصل زمني لثقافة شريحة التحكم من جنين E10.5 Isl-GFP. الصور التي تم التقاطها كل 30 دقيقة على مدى 18 ساعة في الثقافة. CN3 (الأخضر) ينمو من النواة (أعلى) نحو العينين ويبدأ المتفرعة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video 2
فيديو 2: سوء استهداف CN3 مع تثبيط إشارات CXCR4. تصوير الشرائح من أجنة E10.5 Isl-GFP التي تزيد عن 48 ساعة في الثقافة. عندما يتم إضافة 1 ميكروغرام / مل AMD3100 (مثبط محدد لCXCR4) مباشرة إلى وسائل الإعلام، ومحاور CN3 التي ليست بعد في محيط الخروج من نواة oculomotor dorsally (يسار) بدلا من فينرالي (يمين). أعيد طبعها بإذن من ويتمان، وآخرون. al. 201823. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول ثقافة شريحة الجسم الحي السابق مزايا كبيرة على الاختبارات التوجيه axon التقليدية23. حجم كل نواة المحرك القحفي ليس عاملا ً مقيداً، وليس من الضروري إجراء تشريح صعب. البيئة الدقيقة الذاتية التي يتم من خلالها الحفاظ على مسارات المحاور، مما يسمح بتعديل مسار إشارة واحد مع الحفاظ على مسارات الإشارات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم الآثار في نقاط مختلفة على طول مسار محور محور الإبط. منذ توجيه محور عصبي يتطلب إشارات متعددة، وتركيبات من العظة، على طول المسار29، وهذا يوفر ميزة كبيرة. على عكس الثقافات المنفصلة أو المستنبتة، لا يتم قطع المحاور المتنامية في هذا الإعداد، لذلك يمكن تقييم نمو المحاور الأولي، بدلاً من تجديد المحاور. في معظم الاختبارات الإرشادية الأخرى، يتم في الواقع تقييم تجديد أكسون، بدلاً من نمو المحاور الأولي. تجنب استئصال الساكسوائي أيضا تجنب العوامل المربكة المحتملة كبيرة لأن الخلايا العصبية ليست معطوبة أو تحت الضغط.

الخطوتان الأكثر أهمية هما توجه الأجنة إلى تقطيع وتقليل الوقت بين القتل الرحيم للأم ووضع الشرائح في الحاضنة. يجب أن تبقى الأجنة على الجليد في جميع الأوقات. للتوجيه، لقد حاولنا عدة قوالب مختلفة، ولكن بسبب التباين بين الأجنة في هذا العمر، وجدنا أن التوجه باليد، على أساس الفلورة تحت المجهر تشريح، هو الأكثر فعالية. ومع ذلك، يحد التوجه باليد من النافذة الزمنية الجنينية التي يمكن دراستها. في وقت سابق من E10.0، توجيه شريحة بشكل صحيح هو التحدي لأن العين من الصعب أن نرى وعدد قليل جدا من محاور CN3 يمكن رؤيتها. وهذا يعني، مع ذلك، أننا لا نستطيع استخدام هذه الطريقة لدراسة أول نمو أكسون الرائد، كما أننا بحاجة إلى السماح لتلك المحاور أن تنمو بطريقة جزء لتكون قادرة على توجيه شريحة.

هناك العديد من القيود على إعداد ثقافة شريحة oculomotor. وهو مفيد للغاية لدراسة القرارات التوجيهية المبكرة والمتوسطة، بدلاً من قرارات التفريع النهائي. في E10.5، وEOMs موجودة فقط كما anlage العضلات. حتى في نقاط وقت لاحق، مع تكنولوجيا التصوير الحالية، لا يمكن تمييز التدابير الخاصة بالهدف الفردي داخل الشريحة. ولذلك لا يمكن تقييم القرارات المحددة المتعلقة بفروع المحطات الطرفية لمحاور الأوروموموتور بالظروف الراهنة. لأن الشرائح تزرع على أغشية زراعة الأنسجة المسامية، فصل ما بعد الثقافة من الغشاء من الصعب وغالبا ما يسبب تلف الأنسجة، مما يجعل تلطيخ الأجسام المضادة وإعادة تركيب لتصوير إضافي غير ناجحة. على الرغم من أن المحاور لا يتم قطع، وبالتالي تقليل الضرر العصبي، يتم قطع الأنسجة المحيطة بها وبالتالي التالفة، والتي يمكن أن تؤثر على التعبير إشارة أو الإفراج. كما أن الإطار الزمني المثالي محدود. وكما ذُكر أعلاه، فإن توجيه الشريحة في وقت أبكر من E10.0 صعب، وبعد E11.5، وصل العديد من المحاور بالفعل إلى المدار، ولذلك فقد اتخذت بالفعل قرارات توجيهية وسيطة.

التحضير يتطلب المجهر مع حاضنة المرحلة الأعلى، مرحلة التلقائي، والقدرة على الفاصل الزمني. الأهداف والكاميرا تحتاج إلى تحسين لتصوير عينات سميكة مع عدم وجود المقاصة. القرار على مستوى مخروط نمو واحد، كما هو ممكن مع بعض الاستعدادات الثقافية، غير ممكن مع إعداد التصوير الحالي. ومع ذلك، يمكن تكييف معلمات التصوير للسماح بدقة أعلى، مع التنظير المجهري البؤري أو الفوتون الثاني، مع التركيز على مساحة صغيرة من كل شريحة (يحتمل أن يتم تعديلها مع نمو الشرائح مع نمو المحاور). باستخدام المجهر الفلورسنت الحالي والتصوير كل 30 دقيقة، ونحن لم نر تبييض الصور. يمكن استخدام الفحص المجهري البؤري والتصوير الأكثر تواترا، ولكن تبييض الصور سيصبح مشكلة محتملة.

لأن مثبطات جزيء صغير قد يكون لها آثار خارج الهدف, بما في ذلك على النمو العام وصحة الشريحة, هذا الفحص هو الأكثر فائدة كأداة الفحص. يجب التحقق من النتائج بطرق أخرى، مثل نماذج الماوس بالضربة القاضية. على سبيل المثال، مع تثبيط CXCR4، هناك انخفاض معتدل النمو العام للشريحة (انظر الشكل2)، بما يتفق مع وظائف متعددة من CXCR4. في نماذج الماوس، ومع ذلك، تم تلخيص النمط الظاهري axon ينظر في شريحة23.

ويمكن تعديل هذا البروتوكول لدراسة مجموعات الأعصاب القحفية الأخرى، على الرغم من أنه يتعين تحديد التوجه السليم للشرائح والتوقيت من الناحية التجريبية بالنسبة لكل منها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الفئران ذات التسميات الفلورية المختلفة التي تميز مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا العصبية و/أو التي تتحول إلى في العصور الجنينية المبكرة أو اللاحقة.

يمكن التلاعب بثقافة الشريحة بطرق متعددة. نعرض هنا مثالا ً على حجب مستقبلات الإشارات مع مثبط جزيء صغير. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة الأجسام المضادة (إما حجب مستقبلات أو تنشيط مستقبلات) أو البروتينات المؤتلفة، مثل العظة توجيه axon أو عوامل النمو، إلى وسائل الإعلام. لتقييم الآثار الاتجاهية على توجيه axon، يمكن وضع حبات إفراز الرباط على شريحة في مواقع محددة. باستخدام أي من هذه الطرق، يمكن تحديد العديد من مسارات توجيه axon الأخرى ودراستها في نظام المحرك العيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

التمويل المقدم من المعهد الوطني للعيون [5K08EY027850]، المعهد الوطني لصحة الطفل ونمائه [U54HD090255]، برنامج هارفارد فيجن لتطوير العلماء السريريين [5K12EY016335]، مؤسسة فرسان تمبلر للعيون [بداية مهنية] منحة] ومؤسسة طب العيون في مستشفى الأطفال [جائزة اكتشاف الكلية]. اللجنة الاقتصادية لأوروبا هو محقق معهد هوارد هيوز الطبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25, (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25, (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70, (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82, (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140, (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399, (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105, (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177, (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101, (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81, (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8, (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144, (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8, (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244, (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59, (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13, (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58, (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200, (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145, (10), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics