배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

Neuroscience

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Summary

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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Abstract

정확한 눈 움직임은 시력에 매우 중요하지만, 안구 모터 시스템, 특히 축사 지도를 제어하는 분자 경로의 개발은 완전히 해명되지 않았습니다. 이것은 부분적으로 전통적인 축색 지도 방법의 기술적인 한계 때문이. 오큘로모터 신경에 영향을 미치는 추가적인 축삭 유도 신호를 식별하기 위해, 눈쪽으로 성장함에 따라 실시간으로 오큘로모터 신경을 이미지화하는 생체내 슬라이스 분석법이 개발되었다. E10.5 IslMN-GFP 배아는 아가로오스에 포함시키고, 진동체에 슬라이스한 다음, 24-72시간 동안 타임랩스 광현미경으로 현미경 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시켜 생체 내 조각을 생성하는 데 사용됩니다. 핵에서 궤도에 축산의 성장의 생체 내 타이밍. 소분자 억제제 또는 재조합 단백질은 배양 배지에 첨가되어 상이한 축세포 유도 경로의 역할을 평가할 수 있다. 이 방법은 축슨이 통과하는 국소 미세 환경을 더 많이 유지하고 성장하는 축축을 축축화하지 않고 궤적을 따라 여러 지점에서 축을 평가하는 장점이 있습니다. 또한 축색의 특정 하위 집합에 미치는 영향을 식별할 수 있습니다. 예를 들면, CXCR4의 억제는 통풍구보다는 오히려 등등 성장하는 중뇌 안에 아직도 축을 일으키는 원인이 됩니다, 그러나 이미 통풍구로 종료한 축산은 영향을 받지 않습니다.

Introduction

안구 모터 시스템은 축색 가이던스 메커니즘을 조사하기 위한 우아한 시스템을 제공합니다. 그것은 눈을 움직이는 6개의 외눈 근육 (EOMs)를 심두는 3개의 두개골 신경 및 눈꺼풀을 들어 올리는 levator palpebrae 우월증 (LPS)로 이루어져 있는 상대적으로 복잡하지 않습니다. oculomotor 신경은 LPS와 4개의 EOMs를 내심합니다 - 열등한 경사및 내측, 열등한, 및 우수한 직류 근육. 다른 두 신경, trochlear 및 abducens, 각각 하나의 근육을 내면, 우수한 경사 및 측면 직사각형 근육, 각각. 눈의 움직임은 쉽게 판독할 수 있으며, 내면이 적절한지, 누락되었는지, 또는 비정상적인지를 보여 줄 수 있습니다. 추가적으로, 선천적인 두개골 배화 무질서 (CCDDs)를 집합적으로 불리는 신경 발달 또는 축세포 지도에 있는 적자에서 유래하는 인간 눈 운동 무질서가있습니다1.

이러한 장점에도 불구하고, 안구 모터 시스템은 거의 축사 유도 연구2,3,4,5,6,7,8에사용되지않습니다. 9개 , 10, 기술적 인 단점으로 인해. 시험관 내 축색안내는 많은 단점을 가지고11. 공동 배양 분석, 있는 뉴런 이식 대상 조직12 또는 형질 감염 세포13의이종과 함께 배양되는, 이식의 대칭 과 이식 과 표적 조직 사이의 정확한 위치 모두에 의존한다. 스트라이프 어세이14,15, 두 개의 큐가 교대로 줄무늬에 배치되고 축사가 하나의 스트라이프에 우선 성장을 위해 평가되는 경우, 하나의 기판이 다른 기판보다 바람직하다는 것을 나타냅니다. 또는 반발, 또는 생리학적으로 관련이 있습니다. 미세 유체 챔버는 정확한 화학 구배를 형성 할 수 있지만, 대상 성장 축은 응력16,17,18을전단, 이는 자신의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 이 접근의 각각에서, 이식 또는 해리세포를 수집하는 것은 성장하는 축삭이 축삭을 축삭화하고 따라서 이 계산이 실제로 초기 축삭 자성장 보다는 오히려 축삭 재생을 검토한다는 것을 요구합니다. 마지막으로, 이러한 시험관 내 접근법은 축축한 축세포에 영향을 미치는 미세 환경을 제거하고 코스의 다른 지점을 따라 큐에 대한 반응, 전통적으로 격리된 하나의 큐만 테스트합니다. 이러한 단점을 복합화, 안구 모터 시스템에서 각 핵의 작은 크기는 해부 기술적으로 이식 또는 해리 된 문화에 대한 도전한다. 추가적으로, 안구 운동 뉴런의 1 차적인 배양은 일반적으로 이질적이고, 중요한 세포 죽음이 있고, 다중 태아에게서 세포의 풀링을 요구하는 밀도 의존적입니다 (료스키 후지키, 개인적인 커뮤니케이션). 그러나 녹아웃 마우스 모델을 포함한 생체 내 방법은 필요한 시간과 비용을 감안할 때 스크리닝에 사용하기에 적합하지 않습니다.

배양 전체 배아19에 개발된 방법은 이동 세포20의 라벨링 또는 특정 분자21의봉쇄를 허용하지만, 전체 배아 배양은 라벨의 실시간 이미징을 배제하는 롤러 병에서 배양을 필요로 합니다. 구조. 태아의 조작을 허용하고 그 후에 추가 발달을 허용하는 외과 기술은 자궁에서 또는 어머니의 복부에 있는 (태반 연결을 유지함)22또한 가능합니다, 그러나 이들은 또한 시간 경과를 허용하지 않습니다 이미징.

시험관내 분석의 장애물을 극복하고 신호 경로의 신속한 스크리닝을 허용하기 위해, 생체내 배아 슬라이스 배양 기법은23,말초 신경 발생에 대한 이전에 발표된 프로토콜로부터 적응된24. 이 프로토콜을 사용하여, 개발 oculomotor 신경은 EOM 표적을 포함하여 그것의 궤도를 따라 그것의 궤도의 많은 의 존재에서 시간이 지남에 따라 영상화될 수 있습니다. 배양 배지에 소분자 억제제, 성장 인자 또는 안내 신호를 추가함으로써 축색 궤적을 따라 여러 지점에서 지침 교란을 평가하여 잠재적 인 성장 및 지침 요인을 보다 신속하게 평가할 수 있습니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 동물 작업은 보스턴 아동 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜을 준수하여 승인및 수행되었습니다.

1. 시간 적시 짝짓기

  1. 장소 ISLMN:GFP (아일렛 모터 뉴런 녹색 형광 단백질; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP*)1Slp/J 스톡 번호: 017952)수컷 및 암컷 마우스를 하룻밤 동안 함께. 짝짓기 전에 암컷의 무게와 기록 가중치를 측정합니다.
    참고: ISLMN:GFP는 특히 세포독성이 없는 원거리 GFP로 운동 뉴런을 분류하고, 운동 뉴런과 축삭의 세포막을 국소화하고, 개발25동안 신경을 시각화할 수 있게 한다. 다른 형광 표지 된 라인도 사용할 수 있습니다.
  2. 이른 아침에 질 플러그를 확인합니다. 플러그가 식별된 날짜는 E0.5로 지정됩니다.
  3. E10.5에서 체중 증가 및 / 또는 초음파를 사용하여 임신을 확인하십시오. 임신 한 댐은 적어도 1 g을 얻었어야합니다.

2. 슬라이스 배양시 시약 및 진동 준비

  1. 슬라이스 버퍼 500 mL 준비: Ca 2+ 및 Mg2+없이 500 mL의 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS)에 500 mL에 HEPES 5 mL과 페니실린/스트렙토마이신 5 mL를 추가하십시오.  4 °C로 냉각.
    참고: 추가 슬라이스 버퍼는 4°C에 저장해야 하며 향후 슬라이스 배양 실험에 사용할 수 있습니다.
  2. 배양 배지 50 mL 준비: 멸균 후드에 HBSS 12.5 mL, 태아 소 세럼 12.5 mL, 포도당 250 μL, L-글루타민 250 μL, HEPES 125 μL을 Fluorobright DMEM 의 24.4 mL에 추가하십시오. (최종 농도: 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% 포도당, 1 mM 글루타민, 및 2.5 mM HEPES를 가진 FlouroBright DMEM.).  멸균 수조에서 배양 배지를 37°C로 데운다.
    참고: 배양 배지는 최대 3주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    1. 멸균 후드에 6웰 플레이트의 각 웰에 1.5 mL의 배양 배지를 추가합니다.  각 웰에 세포배양 삽입(재료 표)을 추가합니다.  멸균 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.
  3. 4% 저용융 온도 아가로즈 준비: 멸균 PBS 50 mL에 저용융 온도 아가로즈 2 g을 용해시다. 완전히 녹을 때까지 30-60s 간격으로 전자레인지에 돌리자. 액체를 유지하기 위해 40 °C 의 수조에 놓습니다.
    참고: 여분의 아가로즈는 실온(RT)에 보관하고 향후 슬라이스 배양 실험을 위해 용융될 수 있습니다.
  4. 비브라토메 설정: 비브라토메에 새 블레이드를 놓습니다. 설정 확인: 두께 400-450 μm. 진동 스테이지를 미리 냉각시. 바깥 챔버에 얼음을 놓습니다. 라이브 슬라이스 전용 챔버와 무대를 사용합니다. 잔류 고정제는 슬라이스에 손상을 줄 수 있기 때문에 고정 된 조직에 동일한 진동 챔버를 사용하지 마십시오.
  5. 37°C 및 5% CO2로 현미경 스테이지 상부인큐베이터를 준비한다.
  6. 해부 준비: 외과 용 기구를 청소하고 70 % 에탄올로 스프레이하십시오. HBSS로 페트리 요리 두 개를 채우고 얼음 위에 놓습니다. 12 개의 잘 조직 배양 판을 열고 아래쪽을 위로 향하여 얼음 위에 뚜껑을 놓습니다. 6개의 웰 조직 배양판을 열고 세포배양막 삽입체와 1.5 mL 세포배양배지를 각각 잘 배치한다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2 인큐베이터로 예온시.

3. E10.5 배아 수확 및 슬라이스 준비

참고: 이 시점의 모든 단계는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 배아를 항상 얼음 위에 두십시오.

  1. CO2 챔버에서 임신 한 댐 (E10.5)을 안락사시하십시오. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  2. 복부에 70 % 에탄올을 뿌린다. 가위로 복부를 열고 자궁을 제거하고 얼음 차가운 HBSS가있는 페트리 접시에 놓아 혈액을 빨리 씻어 냅니다. 씻은 자궁을 차가운 HBSS 접시얼음으로 채워진 두 번째 페트리로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮기다.
  3. 해부 범위에서 자궁 경적과 개별 양수 낭에서 배아를 제거하십시오. 배아를 12개의 우물 판의 뚜껑 밑면에 놓습니다. 얼음에 보관하십시오.
  4. 해부 범위에서 필터 페이퍼를 사용하여 각 배아를 둘러싼 액체를 제거합니다.
    참고: 배아는 만지면 필터 용지에 달라붙습니다.
  5. 아가로즈에 배아를 포함시다. 녹은 아가로스를 각 배아에 부어 덮습니다. 얼음에 보관하십시오. 아가로즈가 굳어지자마자, 각 배아를 뒤집어서 다른 쪽에 아가로스를 부었다. 얼음에 보관하십시오.
  6. 형광 해부 범위를 사용하여 각 배아 주위의 아가로스를 다듬어 진동 단계에 접착할 때 제대로 방향을 잡을 수 있도록 합니다. 오큘로 운동 핵과 초기 축슨 자성장은 형광입니다. 배아를 정렬하여 핵, 자라나는 축사 및 눈이 선을 형성하도록 하고, 이 선과 평행하게 절단된 면도날로 아가로즈를 다듬습니다(배아에 등쪽, 그림 1A참조).
    참고 : 이것은 진동 단계에 붙어있는 측면이 될 것입니다 (배아는 뒤쪽에 위치하며 진동 블레이드에 가장 가까운 머리). 오큘로모터 핵과 눈 사이의 선은 진동 블레이드와 평행해야 합니다.
  7. 얼음 차가운 슬라이스 버퍼로 비브라토메 챔버를 채웁니다. 블레이드가 oculomotor 핵 및 눈과 평행하게 되도록 비브라토메 단계에 배아를 초접착제. 수퍼글루가 마르면 진동 기를 잠수하여 배아가 칼날에서 멀어지도록 합니다.
  8. 슬라이스 400-450 μm 슬라이스.  멸균 전사 파이펫으로 각 슬라이스를 수집합니다. 차가운 슬라이스 버퍼에 넣습니다.
  9. 해부 범위에서, oculomotor 핵과 눈을 포함하는 슬라이스를 선택합니다. 멸균 전사 파이펫을 사용하여, 6웰 플레이트에 세포 배양 인서트 위에 놓는다. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 또는 한 사람이 슬라이스하고 다른 사람이 슬라이스를 배치하게 합니다. 슬라이스와 인큐베이터에 배치하는 사이의 시간을 최소화합니다.
    참고: 핵과 축세포에서 방출되는 최대 형광이 이미징 현미경 목표에 가장 가까운 방식으로 슬라이스를 지향해야 합니다. 거꾸로 된 현미경에서, 조각은 플레이트 아래의 목표에 가장 가까운 핵과 축색과 멤브레인에 배치해야합니다.
  10. 진비암 단계에서 잔류 아가로스를 제거하고, 다음 배아를 단계로 슈퍼 접착제로 만들고 모든 배아가 슬라이스되고 도금될 때까지 3.7-3.9 단계를 반복합니다.
  11. 억제제 또는 재조합 분자를 각각의 웰에 매개체에 첨가하여 투여-반응 곡선을 생성한다.  적절한 용매로 희석하십시오.
    참고: DMSO를 사용하는 경우 조직 배양 등급 DMSO만 사용하십시오. 대안적으로, 단백질 용출 비드는 슬라이스의 특정 위치에 배치될 수 있다.
  12. 37°C 및 5% CO2 챔버에 현미경을 놓습니다.  현미경을 설정하여 각 조각의 위상 대비 및 형광 사진을 30 분마다 (또는 원하는 경우 더 자주) 촬영하십시오. 슬라이스는 48-72 시간 동안 유지 될 수있다.

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Representative Results

일반 결과: 그림 1은 실험의 개략적 을 제공합니다. 마우스에서 E9.5부터 시작하여, 첫 번째 축색은 oculomotor 핵26에서나오기 시작합니다. E10.5에 의해, 초기 개척자 뉴런을 포함하는 매혹적인 oculomotor 신경은, 중간엽에서 볼 수 있습니다. E10.5에서 배아 사이의 상당한 가변성이 있다 (심지어 같은 쓰레기 내에서) 얼마나 멀리 신경 궤도쪽으로 진행 되었습니다., 몇 시간의 발달 차이 때문일 가능성이. 자궁 발달에서 정상 동안, 첫번째 GFP 양성 oculomotor 축치는 다음 18-24 시간 (E11.5에 의하여) 궤도/눈에 도달하고, 그 후 그들의 최종 표적27에분기를 시작합니다. 슬라이스 문화에서 이 타이밍은 다시 요약됩니다(그림 2,비디오1). 슬라이스는 최대 72 시간 동안 (모든 방향으로) 성장하고 확장되며 축산은 핵에서 눈으로 확장되는 것을 볼 수 있습니다. 우리는 oculomotor 축슨 의 성장을 평가하기 위한 첫번째 36-48 시간 가장 유용했다는 것을 것을을 발견했습니다. 운동 뉴런은 때때로 핵 내에서 움직이는 것을 볼 수 있습니다 (도시되지 않음). 일부 슬라이스에서는 방향에 따라 트로클로르 핵도 존재합니다. Trochlear 축삭은 슬라이스 내에서 측면으로 확장하고 종종 실속, 그들의 정상적인 과정은 횡선과 캐들 회전하기 전에, 측면으로 trochlear 핵을 종료하는 것입니다 때문에, 슬라이스에서 될 것입니다. 때때로, trochlear 축색은 oculomotor 축색에 결합하고 그 축색이 oculomotor 축색의 지도에 부차적인 효력이 있을 수 있기 때문에, 조각을 해석하기 어렵게 만드는 눈을 향해 돌리는 것처럼 보입니다.

중요한 축색 유도 경로를 억제하는 예: CXCR4 신호 억제는 오큘로모터 축색의 복부 성장보다는 등쪽을 유발합니다. 우리는 CXCR428의수용성 소분자 억제제인 AMD3100의 1 μg/mL(1.26 μM)을 추가하여 오큘로모터 개발에 대한 CXCR4 신호의 역할을 평가하였습니다. 오큘로모터 축색은 oculomotor 핵을 등쪽으로 빠져나와 궤도에서 멀어지는 것을 볼 수 있습니다("뒤로") (그림 2,비디오2). 이미 중뇌를 떠나 E10.5 궤도에 진입한 축산들은 계속 길을 걷고 있었다. CXCR4의 억제는 또한 슬라이스의 전반적인 성장에 영향을 미칩니다.

슬라이스의 방향은 매우 중요합니다. 슬라이스가 제대로 지향되지 않으면 해석할 수 없습니다. 잘못 방향이 지향하는 슬라이스의 몇 가지 예는 그림3에 나와 있습니다. 배아가 옆으로 기울어지면 하나의 oculomotor 핵만 슬라이스에 있습니다 (그림3A).  내장된 배아가 뒤쪽으로 너무 멀리 기울어져 있으면 눈은 슬라이스에 있지 않고 대신 상지와 뒷뇌 또는 척수는 슬라이스에 있을 수 있습니다(그림3B).  이 경우, 오큘로 모터 축색의 정상 궤적은 존재하지 않으며 무작위로 성장하는 경향이 있습니다. 배양 막 에 슬라이스를 배치하는 동안 접히게 될 수 있습니다 (도3C).

용매는 독성이 있을 수 있습니다. 유기 용매에서 억제제 또는 성장 인자를 용해 할 때주의를 기울여야합니다. 4는 미디어에 에탄올을 첨가한 후 사망한 슬라이스의 예를 나타낸다. 118 μL을 1.5 mL의 미디어(최종 농도 7.8%)에 첨가하였고, 이 고농도는 독성이 입증되었다. 이를 방지하기 위해 용매를 가능한 최소 량으로 용해하십시오 (용해도한계까지). 가능하면 물에 녹여드시고 드시면 됩니다. DMSO를 사용하는 경우, 멸균, 조직 배양 등급 DMSO있는지 확인하십시오.

Figure 1
그림 1 : 회로도. E10.5 Isl MN-GFP 배아 (A:사진, B:회로도)는 진동체(400-450 μm 두께)에 슬라이스되어 단면에 오큘로모터 핵과 궤도를 모두 포함합니다. A와 B의 평행 파선은 진동 컷의 위치를 나타냅니다. A의 하부 파선은 아가로스를 트리밍하고 진동 스테이지에 접착해야 하는 위치를 보여줍니다. (C) 섹션은 영양분과 가스의 교환을 허용, 조직 배양 막에 평평하게 배치하고, 시간 경과 현미경 검사법에 대한 무대 상단 인큐베이터에 배치됩니다. 이 단계에서, 억제제는 성장 매체에 첨가될 수 있다. (D) 배양은 24-72시간 동안 유지될 수 있으며, 오큘로모터 축색은 눈에 자라는 것을 볼 수 있다. 휘트먼의 허락하에 적응. al. 201823. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : CXCR4의 억제로 인해 CN3가 잘못 라우팅됩니다. E10.5 Isl-GFP 배아로부터의 슬라이스 배양체는 배양에서 0, 12, 24, 및 36h에서 이미지화된다. 상부 패널은 야생형 대조군 배아를 나타내고 CN3(녹색)은 36시간 동안 눈과 가지를 향해 광범위하게 자랍니다. 또한 비디오 1을 참조하십시오. 하단 패널은 1 μg/mL AMD3100(CXCR4에 대한 특정 억제제)이 첨가된 슬라이스를 나타내고 축세포는 오큘로모터 핵을 등쪽으로 빠져나옵니다. 이미 빠져나온 사람들은 눈을 향해 계속 나아간다. 또한 비디오 2를 참조하십시오. D: 등쪽, V: 복부, E: 눈, N: oculomotor 핵, SMN: 척추 운동 뉴런, 화살표: oculomotor 축색 (흰색: 야생형 프로젝션, 노란색: 비정상적인 프로젝션). 배율 막대는 200 μm와 같습니다. 또한 비디오 1비디오 2를참조하십시오.  다른 예를 보여주는 유사한 그림은 휘트먼, 등에서 발표되었다. al. 201823. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 슬라이스의 방향이 매우 중요합니다. 대표적인 잘못된 방향 조각의 초기 이미지(시간 0시간). A는 CN3 축을 투사하는 것이 축색화되도록 배아가 옆으로 기울어진 슬라이스를 보여줍니다. 투영 축은 슬라이스(화살표)의 오른쪽에만 존재합니다.  B는 배아가 축축(화살표)을 투사하는 CN3 핵이 양측으로 보이지만 눈은 슬라이스에 존재하지 않도록 배아가 뒤로 기울어진 슬라이스를 보여줍니다. 대신 척추 운동 뉴런 (SMN) 및 사지에 모터 뉴런 돌기를 볼 수 있습니다. C는 멤브레인 에 배치되는 동안 접힌 슬라이스를 나타낸다. 여기에 표시된 조각과 같은 조각은 폐기해야 합니다. 축척 막대는 각 패널에서 500 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : 용매는 독성이 있을 수 있습니다. 배양시 0 및 12시간에서 E10.5 Isl-GFP 배아로부터의 슬라이스 배양의 시간 경과 이미징. 첨가제 (A-B)가없는 미디어에서 배양 된 슬라이스는 CN3 축슨이 눈을 향해 투사하면서 12 시간 동안 정상적으로 자랍니다. 에탄올 농도가 높은 배지에서 배양된 슬라이스(7.8%) (C-D)는 정상적으로 성장하지 않습니다. 12 시간에서, CN3는 성장하지 않고 거의 보이지 않으며, 조직은 붕괴하기 시작했습니다. 축척 막대는 각 패널에서 500 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Video 1
비디오 1: 슬라이스 문화에서 CN3 의 성장. E10.5 Isl-GFP 배아로부터의 대조군 슬라이스 배양의 타임랩스 이미징. 문화에서 18 시간 이상 30 분마다 찍은 이미지. CN3 (녹색)는 핵 (상단)에서 눈을 향해 성장하고 분기를 시작합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

Video 2
비디오 2: CXCR4 신호 의 억제와 CN3의 잘못된 타겟팅. E10.5 Isl-GFP 배아에서 슬라이스 배양의 시간 경과 이미징 48 시간 이상 배양. 1 μg/mL AMD3100(CXCR4에 대한 특이적 억제제)이 미디어에 직접 첨가되면, 주변에 아직 없는 CN3 축삭은 통풍구(오른쪽)가 아닌 오큘로모터 핵등(왼쪽)을 빠져나오게 된다. 휘트먼의 허락을 받아 전재. al. 201823. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

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Discussion

이러한 생체내 슬라이스 배양 프로토콜은 전통적인 축삭유도 분석(23)에 비해 상당한 이점을 제공한다. 각 두개골 운동 핵의 크기는 제한 요인이 아니며 어려운 해부가 필요하지 않습니다. 축사 이동을 통해 내인성 미세 환경은 다른 신호 경로를 유지하면서 하나의 신호 통로의 수정을 허용. 또한 축색 궤적을 따라 다른 지점에서 효과를 평가할 수 있습니다. 축색 안내는 경로29를따라 여러 개의 큐 및 큐의 조합을 필요로 하기 때문에, 이것은 상당한 이점을 제공한다. 해리되거나 배양하는 배양과는 달리, 성장하는 축삭은 이 준비에서 절단되지 않으므로 초기 축삭 자생은 축삭 재생이 아니라 평가될 수 있습니다. 대부분의 다른 지침 평가에서, 축사 재생은 실제로 평가되고, 오히려 초기 축산 자성장보다는. 축색을 피하는 것은 또한 뉴런이 손상되지 않거나 스트레스를 받고 있지 않기 때문에 중요한 잠재적 인 혼란 요인을 피할 수 있습니다.

가장 중요한 두 단계는 어머니의 안락사와 인큐베이터에서 슬라이스의 배치 사이의 시간을 슬라이스하고 최소화하기위한 배아의 방향입니다. 배아는 항상 얼음 위에 보관되어야 합니다. 방향, 우리는 여러 가지 다른 금형을 시도했지만,이 나이에 배아 사이의 가변성 때문에, 우리는 해부 현미경의 형광에 따라 손으로 방향이 가장 효과적이라는 것을 발견했다. 그러나 손으로 방향을 사용하면 연구할 수 있는 배아 시간 창이 제한됩니다. E10.0 보다 일찍, 제대로 슬라이스 를 방향을 지정 하는 것은 눈을 보기 어렵고 거의 CN3 축 색을 볼 수 있기 때문에 도전. 이것은, 그러나, 우리가 그 축새가 조각을 방향을 지향하는 것을 할 수 있는 부분적인 쪽으로 성장할 수 있도록 하기 위하여 필요로 하기 때문에, 초기 개척자 축산 outgrowth를 공부하기 위하여 이 방법을 사용할 수 없다는 것을 의미합니다.

오큘로모터 슬라이스 배양 제제에는 몇 가지 제한사항이 있다. 터미널 분기 결정보다는 초기 및 중간 지도 결정을 공부하는 데 가장 유용합니다. E10.5에서, EOMs는 근육 말단으로만 존재합니다. 현재 이미징 기술로는 나중에 도래할 때에도 개별 대상 EOM은 슬라이스 내에서 구별할 수 없습니다. 따라서 오큘로모터 축색의 특정 단말 분기 결정은 현재 조건으로 평가할 수 없습니다. 조각은 다공성 조직 배양 막에 성장하기 때문에, 막에서 포스트 배양 분리는 어렵고 수시로 조직 손상을 일으키는 원인이 되고, 항체 염색및 추가 화상 진찰을 위한 재장착을 실패합니다. 축색이 절단되지 는 않지만 신경 손상을 최소화하면 주변 조직이 절단되어 손상되어 신호 큐 발현 또는 방출에 영향을 줄 수 있습니다. 이상적인 시간 창도 제한되어 있습니다. 위에서 언급했듯이, 슬라이스의 E10.0 방향보다 일찍, 그리고 E11.5 후, 많은 축새가 이미 궤도에 도달했기 때문에 중간 지침 결정이 이미 내려졌습니다.

준비에는 스테이지 탑 인큐베이터, 자동 스테이지 및 타임랩스 기능이 있는 현미경이 필요합니다. 목적과 카메라는 지우기 없이 두꺼운 시편을 이미징하기 위해 최적화되어야 합니다. 일부 배양 제제에서 가능한 바와 같이 단일 성장 원뿔 수준에서의 분해능은 현재 이미징 설정으로는 불가능합니다. 그러나 이미징 매개 변수는 공초점 또는 2 광자 현미경으로 각 슬라이스의 작은 영역에 초점을 맞추고 더 높은 해상도를 허용하도록 잠재적으로 적응 될 수 있습니다 (축산이 성장함에 따라 잠재적으로 조정). 현재 상피성 현미경을 사용하고 30 분마다 화상 진찰을 사용하여, 우리는 광표백을 본 적이 없습니다; 공초점 현미경 검사법과 더 빈번한 화상 진찰은 이용될 수 있었습니다, 그러나 광표백은 잠재적인 문제가 될 것입니다.

작은 분자 억제제는 조각의 전반적인 성장 및 건강에 포함하여 오프 표적 효력이 있을 수 있기 때문에, 이 분석제는 검열 공구로 가장 유용합니다. 녹아웃 마우스 모델과 같은 다른 방법으로 결과를 확인해야 합니다. 예를 들어, CXCR4 억제와 함께, CXCR4의 다중 기능과 일치하는 슬라이스의 전반적인 성장이 경미하게 감소된다(도 2참조). 그러나 마우스 모델에서, 슬라이스에서 보이는 축슨 표현형은23을재량화시켰다.

이 프로토콜은 다른 두개골 신경 집단을 연구하기 위해 수정 될 수 있지만, 각각의 경우, 슬라이스와 타이밍의 적절한 방향은 경험적으로 결정되어야 할 것입니다. 추가적으로, 다른 형광 성 레이블을 가진 마우스는 뉴런의 다른 subset를 표시하는 것을 이용될 수 있고/또는 그 초기 또는 나중에 배아 나이에 켜집니다.

슬라이스 문화는 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다. 우리는 여기에서 작은 분자 억제물로 수용체 신호 차단의 예를 보여줍니다. 대안적으로, 항체(수용체 차단 또는 수용체 활성화) 또는 재조합 단백질, 예컨대 축세포 유도 큐 또는 성장 인자, 미디어에 첨가될 수 있다. 축색 안내에 대한 방향 효과를 평가하기 위해 리간드 분비슬은 특정 위치에 슬라이스에 배치할 수 있습니다. 이러한 방법 중 어느 것을 사용하여, 다른 많은 축슨 유도 경로는 안구 모터 시스템에서 확인되고 연구될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

국립안과 학회 [5K08EY027850], 국립아동보건개발원 [U54HD090255], 하버드-비전 임상과학자 개발 프로그램 [5K12EY016335], 기사단 원안재단 [커리어 스타터] [교수 발견상], 어린이 병원 안과 재단 ECE는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

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References

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