来自胚胎GFP-表达小鼠的Ex Vivo Oculo运动切片培养,用于对Oculo运动神经外生长进行时移成像

Neuroscience

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Summary

前体切片测定允许实时成像奥库运动神经外生。切片通过嵌入E10.5 Isl MN:GFP胚胎在生长中,在振动体上切片,并在一个顶的培养箱中生长。斧子引导通路的作用是通过向培养培养物添加抑制剂来评估的。

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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Abstract

精确的眼动对视力至关重要,但眼动系统的发展,特别是控制斧突引导的分子通路,尚未得到充分阐明。这部分是由于传统斧子制导测定的技术限制。为了识别影响奥库运动神经的其他斧子引导线索,开发了一种前体切片测定,以实时图像向眼睛生长的奥孔运动神经。E10.5 IslMN-GFP胚胎用于生成体外切片,将其嵌入到胶质中,在振动体上切片,然后在显微镜级顶培养箱中生长,用延时显微显微镜进行 24-72 h。从原子核到轨道的斧子生长的体内时间。小分子抑制剂或重组蛋白可以添加到培养培养物中,以评估不同斧头引导途径的作用。该方法的优点是维护轴子遍历的更多局部微环境,而不是对生长的轴子进行轴向,并沿其轨迹的多个点评估轴子。它还可以识别对斧子特定子集的影响。例如,对 CXCR4 的抑制会导致仍在中脑内的斧头生长,而不是口向生长,但已经退出的斧头不受影响。

Introduction

目视电机系统为研究斧子导向机构提供了一个优雅的系统。它相对简单,包括三个颅神经内侧六个移动眼睛的眼外肌肉(EOMs),以及抬起眼睑的悬浮肌(LPS)。oculo运动神经内枢LPS和四个EOMs - 下等斜和中,下等,和优越的直肠肌肉。其他两种神经, 三角和腹肌, 每个只有内瓦特一个肌肉, 优越的斜和侧直肠肌肉, 分别.眼动提供了一个简单的读出,显示内侧是否适当、缺失或异常。此外,还有由于神经元发育或斧突指导的不足而导致的人眼运动障碍,统称为先天性颅内疾病(CCDDs)1。

尽管有这些优点,目状电机系统很少用于斧子制导研究2,3,4,5,6,7,8, 9,10,由于技术缺陷。体外斧子制导测定有许多缺点11。共培养性测定,其中神经元外植与目标组织12或转染细胞13的外植一起培养,取决于外植的对称性和外植与目标组织之间的精确定位。条纹测定14,15,其中两个线索被放置在交替条纹和斧子被评估为优先增长一个条纹,只表明一个基板优于另一个,而不是说两个是有吸引力的或排斥,或生理相关。微流体室可以形成精确的化学梯度,但受试者生长的斧子会剪切应力16,17,18,这会影响它们的生长。此外,在每种方法中,收集外植或分离的细胞需要对生长的轴虫进行轴状化,因此这些测定实际上检查轴子再生,而不是初始轴子生长。最后,这些体外方法消除了影响斧子的微环境及其对不同点的线索的反应,传统上只单独测试一个线索。使这些缺点更加复杂的是,眼部运动系统中每个原子核的体积小,使得解剖在技术上对植物外或分离的培养物都具有挑战性。此外,眼动神经元的主要培养物通常是异构的,有显著的细胞死亡,并且密度依赖,需要从多个胚胎中汇集细胞(藤井裕久,个人交流)。然而,由于需要时间和费用,体内方法(包括敲除小鼠模型)不适合用于筛选。

开发培养整个胚胎的方法19允许标记迁移细胞20或阻断特定分子21,但整个胚胎培养需要在滚筒瓶中孵育,从而排除了标记的实时成像结构。允许操纵胚胎,然后在子宫或母亲腹部(维持胎盘连接)22的外科技术,允许操纵胚胎,然后进一步发育22,但这些也不允许延时成像。

为了克服体外检测的障碍,允许快速筛选信号通路,23日开发了一种体外胚胎切片培养技术,该技术改编自先前公布的外周神经外生长方案24。使用该协议,在沿其轨迹的许多周围结构(包括EOM目标)存在的情况下,可以随时间而对发育中的oculo运动神经进行成像。通过在培养介质中添加小分子抑制剂、生长因子或引导提示,我们可以评估沿斧子轨迹的多个点的制导扰动,从而能够更快速地评估潜在的生长和指导因素。

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Protocol

此处描述的所有动物工作均符合波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议的批准和执行。

1. 分时配接

  1. 放置ISLMN:GFP (岛运动神经元绿色荧光蛋白;MGI: J:132726;Jax Tg (Isl-EGFP®)1Slp/J 库存号: 017952) 雄性小鼠和雌性小鼠一起过夜。在交配前称量雌性并记录重量。
    注:ISL MN:GFP专门标记运动神经元与无细胞毒性的远感GFP,局部到运动神经元及其斧子的细胞膜,并允许神经在发育25期间可视化。也可以使用其他荧光标记的线条。
  2. 清晨检查阴道塞。插头的识别日期被指定为 E0.5。
  3. 在 E10.5 使用体重增加和/或超声波确认怀孕。怀孕的水坝应该至少获得1克。胚胎可以在E10.5的超声波上看到。

2. 为切片培养制备试剂和振动剂

  1. 准备500 mL的切片缓冲液:在汉克平衡盐溶液(HBSS)中加入5 mL的HEPES和5 mL的青霉素/链霉素,而不加Ca2+和Mg2+。 冷却至4°C。
    注:额外的切片缓冲液应储存在4°C,并可用于未来的切片培养实验。
  2. 制备50 mL培养素:在无菌罩中,加入12.5 mL的HBSS、12.5 mL的胎儿牛血清、250 μL的葡萄糖、250 μL的L-谷氨酰胺、125 μL的HEPES至24.4 mL的氟布赖特DMEM。(最终浓度:氟布赖特DMEM,HBSS25%,25%FBS,0.5%葡萄糖,1 mM谷氨酰胺和2.5 mM HEPES。 在无菌水浴中加热培养基至37°C。
    注:培养介质可在 4°C 下存储长达 3 周。
    1. 在无菌罩中,在 6 孔板的每个孔中添加 1.5 mL 的培养介质。 在每个孔中添加细胞培养插件 (材料表) . 放置在无菌的 37 °C 和 5%CO2培养箱中。
  3. 制备4%低熔融温度甘蔗:在50 mL无菌PBS中溶解2克低熔温甘蔗。以 30-60 秒的间隔微波,直到完全溶解。放入40°C的水浴中,以保持液体。
    注:额外的甘蔗可以储存在室温(RT)和熔化,以备将来切片培养实验。
  4. 设置振动器:在振动器上放置新刀片。检查设置:厚度 400-450 μm. 预冷振动阶段。在外室放置一些冰块。使用专用于活切片的造型室和舞台。不要对固定组织使用相同的振动室,因为残留固定剂可能对切片造成损害。
  5. 将显微镜阶段顶部培养箱制备至37°C和5%CO2。
  6. 准备解剖:清洁手术器械,用70%乙醇喷雾。用哈佛商学院填充两个培养皿,放在冰上。打开12孔组织培养板,将盖子放在冰上,底面朝上。打开6孔组织培养板,将细胞培养膜插入和1.5 mL细胞培养基放在每个孔中。在 37°C 和 5% CO2培养箱中预加热板。

3. 收获E10.5胚胎和准备切片

注:此时的所有步骤都应尽快完成。时刻把胚胎放在冰上。

  1. 在 CO2室中对怀孕的水坝 (E10.5) 实施安乐死。进行宫颈脱位。
  2. 用70%乙醇喷洒腹部。用剪刀切开腹部,取出子宫,并将其放入装有冰冷的HBSS的培养皿中,以迅速洗去血液。将洗过的子宫移到充满盘冰冷 HBSS 的第二个培养皿中。
  3. 在解剖范围内,从子宫角和单个羊水囊中取出胚胎。将胚胎放在12孔板盖的底面。保持冰上。
  4. 在解剖范围内,使用过滤纸去除每个胚胎周围的任何液体。
    注:如果触摸,胚胎会粘在滤纸上。
  5. 将胚胎嵌入到甘蔗中。将融化的甘蔗倒在每个胚胎上以覆盖它。保持冰上。一旦甘蔗变硬,翻转每个胚胎,并在另一侧倒额外的甘蔗。保持冰上。
  6. 使用荧光解剖范围,修剪每个胚胎周围的角胶,使其在粘附到振动镜阶段时正确定向。电运动核和早期斧头生长是荧光的。对齐胚胎,使细胞核,生长的斧头,和眼睛形成一条线,并修剪与这条线平行的剃刀刀切的角质的角质(背到胚胎,参见图1A)。
    注:这将是侧粘附到振动器阶段(胚胎将放置在其背部,头部最接近振动器刀片)。运动核和眼睛之间的一条线应该平行于振动叶片。
  7. 用冰冷的切片缓冲液填充振动室。将胚胎超级粘附到振动器阶段,使刀片与卵子细胞核和眼睛平行。一旦超级胶水干燥,淹没振动体阶段,使胚胎朝向远离刀片。
  8. 切片 400-450 μm 切片。 用无菌转移移液器收集每个切片。放入冷切片缓冲液中。
  9. 在解剖范围下,选择含有电运动核和眼睛的切片。使用无菌转移移液器,将其放在 6 孔板的细胞培养插件上。将板返回到 37°C 培养箱。或者,让一个人切片,另一个人放置切片。将切片和放入培养箱之间的时间降至最低。
    注:切片的定向方式应使从原子核和斧子发射的最大荧光最接近成像显微镜目标。在倒置显微镜上,切片应放置在膜上,其核和斧子最接近板下方的物镜。
  10. 从振动器阶段取出残留的甘蔗,将下一个胚胎超级粘附到该阶段,并重复步骤3.7-3.9,直到所有胚胎都切片和镀层。
  11. 在每个孔中的介质中添加选择的抑制剂或重组分子,以创建剂量-响应曲线。 以适当的溶剂稀释。
    注:如果使用 DMSO,则仅使用组织培养等级 DMSO。或者,蛋白质脱脂珠子可以放置在切片上的特定位置。
  12. 放置在 37°C 和 5% CO2腔室的显微镜上。 设置显微镜,每 30 分钟拍摄一次相位对比度和每片荧光照片(如果需要,更频繁地拍摄)。切片可维持48-72小时。

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Representative Results

正常结果:图1提供了实验的原理图。早在E9.5在小鼠,第一个斧头开始从oculmotor核26出现。通过E10.5,一种包含早期先驱神经元的迷法性神经,可以在中枢可见。E10.5的胚胎(即使在同一垃圾内)在神经向轨道前进的步数上存在显著差异,这可能是由于几个小时的发育差异。在正常子宫发育期间,第一个GFP阳性oculmotoraxons在接下来的18-24小时(E11.5)到达轨道/眼睛,然后开始分支到其最终目标27。在切片区域性中,此计时被重述 (2,视频 1)。切片生长和膨胀(在所有方向)长达72小时,并可以看到斧子从细胞核向眼睛延伸。我们发现第一个36-48小时最有用的评估oculomotor斧头生长。运动神经元有时可以看到在细胞核内移动(未显示)。在某些切片中,根据方向,也存在三毛核。刺耳斧在切片内横向延伸,并经常停滞,因为它们的正常过程是横向退出锥形核,然后转动多毛和胆小,这将从切片中退出。有时,龙骨阳极似乎与耳子运动斧头连接,并转向眼睛,这使得切片难以解释,因为这些斧头可能对oculmotor斧头的制导有次要影响。

抑制重要斧头引导通路的示例:抑制 CXCR4 信令会导致 oculmotor 阳极的背, 而不是腹腔生长。我们评估了CXCR4信号在电介质发育中的作用,在切片培养物制备后立即将1μg/mL(1.26μM)的AMD3100(CXCR428的水溶性小分子抑制剂)直接添加到培养物中。然后可以看到奥库运动斧子从oculo电机核的背离,并远离轨道("向后")(图2,视频2)。那些已经离开中脑并在E10.5轨道前进的斧子继续着。CXCR4 的抑制也会影响切片的整体生长。

切片的方向至关重要。如果切片的方向不正确,则无法解释。图 3显示了一些方向不正确的切片示例。如果胚胎倾斜到其侧面,则切片中只有一个运动核(图3A)。 如果嵌入的胚胎向其背部倾斜太远,眼睛不在切片中,相反,上肢和后脑或脊髓可能位于切片中(图3B)。 在这种情况下,奥库运动斧子的正常轨迹不存在,它们倾向于随机生长。在将切片放置在培养膜上时,它可以折叠(图3C)。

溶剂可能是有毒的。溶解有机溶剂中的抑制剂或生长因子时应小心。图 4显示了在介质中添加乙醇后死亡的切片示例。118 μL被添加到1.5 mL的介质中(最终浓度为7.8%),这种高浓度证明是有毒的。为了防止这种情况,尽可能以尽可能少量的溶剂溶解溶质(至溶解度极限)。只要有可能,溶于水。如果使用 DMSO,请确保它是无菌的,组织培养等级 DMSO。

Figure 1
图 1: 原理。E10.5 Isl MN-GFP胚胎(A:照片,B:原理图)被切片在振动体(400-450 μm厚)上,以便各部分包括电图原子核和轨道。A 和 B 中的平行虚线表示振动器切口的位置。A 中的下虚线显示,应修剪和粘附到振动器阶段。(C) 部分平放在组织培养膜上,允许营养和气体的交换,并放置在一个垫段顶部培养箱中进行延时显微镜。在此阶段,抑制剂可以添加到生长介质中。(D) 培养物可以维持24-72小时,并且可以看到眼动性斧子生长。经惠特曼许可改编al. 201823.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:CXCR4 的抑制会导致 CN3 路由错误。E10.5 Isl-GFP胚胎的切片培养,在培养基为0、12、24和36小时。顶部面板显示野生型控制胚胎和CN3(绿色)在36小时的过程中广泛生长对眼睛和树枝。另请参阅视频 1。底部面板显示添加 1 μg/mL AMD3100(CXCR4 特异性抑制剂)的切片,阳极退出 oculomotor 细胞核。那些已经发泄的离开继续朝眼睛。另请参阅视频 2。D: 背, V: 腹腔, E: 眼睛, N: 耳动核, SMN: 脊髓运动神经元, 箭头: 耳鸣运动斧子 (白色: 野生型投影, 黄色: 异常投影).刻度条等于 200 μm。另请参阅视频 1视频 2。 惠特曼等人也提供了一个类似的数字,显示了其他例子。al. 201823.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:切片的方向至关重要。代表性错误方向切片的初始图像(时间 0 h)。A显示一个切片,其中胚胎被倾斜到一侧,使投影的 CN3 轴xons 被轴化。投影斧头仅存在于切片的右侧(箭头)。 B显示胚胎向后倾斜的切片,因此具有投影斧头(箭头)的 CN3 核是双边可见的,但切片中不存在眼睛。相反,脊柱运动神经元(SMN)和运动神经元投影到四肢可以看到。C显示在膜上放置期间折叠的切片。应丢弃此处所示的切片。刻度条表示每个面板中的 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:溶剂可能是有毒的。E10.5 Isl-GFP胚胎在培养基为0和12小时时分的切片培养物的延时成像。在无添加剂(A-B)培养的介质中培养的切片正常生长 12 小时,CN3 斧子向眼睛投射。在高浓度乙醇培养的介质中培养的切片(7.8%)(C-D)不会正常生长。在12小时,CN3没有生长,几乎看不到,组织已经开始分解。刻度条表示每个面板中的 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Video 1
视频 1:CN3 在切片文化中的成长。E10.5 Isl-GFP胚胎控制切片培养的延时成像。在 18 h 以上的文化中每 30 分钟拍摄一次图像。CN3(绿色)从细胞核(顶部)向眼睛生长,并开始分枝。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

Video 2
视频 2:由于 CXCR4 信令的抑制,CN3 定位错误。E10.5 Isl-GFP胚胎在培养基中超过48h的切片培养物的延时成像。当 1 μg/mL AMD3100(CXCR4 的特定抑制剂)直接添加到介质中时,尚未在外围的 CN3 阳极退出 oculomotor 核阴极(左),而不是通风(右)。经惠特曼等许可转载al. 201823.请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

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Discussion

这种外生切片培养方案与传统的斧子导样测定23相比具有显著优势。每个颅骨运动核的大小不是一个限制因素,不需要任何困难的解剖。维持斧子传播的内源微环境,允许修改一个信令通路,同时保持其他信令通路。此外,可以在沿斧子轨迹的不同点评估效果。由于斧子制导需要多个线索和线索的组合,沿着路径29,这提供了一个显著的优势。与分离或外植培养不同,这种制剂中不会切割生长的斧子,因此可以评估初始斧子生长,而不是斧子再生。在大多数其他指导测定中,斧子再生实际上是在评估,而不是初始的斧子外生长。避免轴切除术也避免了重大的潜在混淆因素,因为神经元没有损坏或处于压力之下。

两个最关键的步骤是胚胎的定位,用于切片,并尽量减少母体安乐死和切片在孵化器中放置之间的时间。胚胎必须始终保持在冰上。对于定向,我们尝试了几种不同的模具,但由于这个年龄的胚胎之间的变异性,我们发现,在解剖显微镜下基于荧光的手工定向是最有效的。然而,用手的方向限制了可以研究的胚胎时间窗口。早于 E10.0,正确定位切片具有挑战性,因为眼睛很难看到,而且很少可以看到 CN3 斧子。然而,这确实意味着我们不能用这种方法来研究最早的先驱斧头生长,因为我们需要让那些斧头生长出部分,以便能够定向切片。

运动切片培养制剂有几个限制。它对于研究早期和中间指导决策最有用,而不是终端分支决策。在 E10.5 中,EAM 仅作为肌肉绞索出现。即使在后期,使用当前的成像技术,单个目标 EOEM 也无法在切片中区分。因此,不能根据当前条件评估 oculomotor xxon 的特定端子分支决策。由于切片生长在多孔组织培养膜上,培养后与膜分离是困难的,并且经常导致组织损伤,使抗体染色和重新安装,以进行额外的成像不成功。虽然斧子不被切割,从而最大限度地减少神经元损伤,但周围的组织被切割,因此受损,这可能会影响信令提示表达或释放。理想的时间窗口也是有限的。如上所述,在E10.0之前,切片的方向是困难的,在E11.5之后,许多斧子已经到达轨道,因此已经做出了中间制导决定。

制备需要具有舞台顶孵化器、自动级和延时能力的显微镜。目标和摄像机需要优化,以便对没有清除的厚标本进行成像。在当前成像设置中,无法像某些培养制剂那样在单个生长锥的水平上进行分辨率。然而,成像参数可以进行调整,以允许更高的分辨率,通过共聚焦或双光子显微镜,聚焦于每个切片的一小块区域(可能随着斧子的生长而调整切片)。使用目前的表观显微镜和成像每30分钟,我们没有看到光漂白;可使用共聚焦显微镜和更频繁的成像,但光漂白将成为一个潜在的问题。

由于小分子抑制剂可能具有脱靶效果,包括切片的整体生长和健康,因此此测定作为筛选工具最有用。结果需要通过其他方法(如挖空鼠标模型)进行验证。例如,在 CXCR4 抑制下,切片的整体增长略有下降(参见2),与 CXCR4 的多种功能一致。然而,在小鼠模型中,切片中看到的斧子表型被重述为23。

该协议可以修改,以研究其他颅神经种群,虽然对于每个,切片的正确方向和时间将不得不由经验确定。此外,可以使用具有不同荧光标签的小鼠来标记神经元的不同子集和/或在早期或较晚的胚胎年龄。

切片区域性可以通过多种方式进行操作。我们在这里展示了一个用小分子抑制剂阻断受体信号的例子。或者,抗体(受体阻塞或受体激活)或重组蛋白,如斧头引导线索或生长因子,可以添加到介质中。为了评估对斧头导向的方向影响,可以在特定位置的切片上放置配体分泌珠子。使用这些方法中的任何一种,可以在眼部运动系统中识别和研究许多其他斧子引导路径。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

资金由国家眼科研究所 [5K08EY027850], 国家儿童健康与发展研究所 [U54HD090255], 哈佛-视觉临床科学家发展计划 [5K12EY016335], 圣殿骑士眼科基金会 [职业入门者]格兰特*和儿童医院眼科基金会[教师发现奖]。欧洲经委会是霍华德·休斯医学研究所的调查员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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