Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doğru göz hareketleri görme için çok önemlidir, ancak özellikle Akon rehberliğini kontrol eden moleküler yollar olan oküler motor sisteminin gelişimi tamamen elükidated değildir. Bu kısmen geleneksel Akon rehberlik özellikleri teknik sınırlamaları kaynaklanmaktadır. Okülomotor sinirini etkileyen ek Akon rehberlik ipuçlarını belirlemek için, bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak okülomotor sinir görüntü için göz doğru büyüdükçe gelişti. E 10.5 ISLMN-Gfp embriyoları agarose içine katıştırarak ex vivo dilimleri oluşturmak için kullanılır, bir vibratome üzerinde dilimleme, daha sonra 24-72 h için zaman atlamalı photomikroskopisi ile bir mikroskop sahne-üst inküdosu onları büyüyen. kontrol dilimleri yeniden apitüle çekirdeğden yörüngeye kadar akonların gelişiminin in vivo zamanlaması. Farklı Akon rehberlik yollarının rolünü değerlendirmek için kültür medyasında küçük molekül inhibitörleri veya rekombinant proteinler eklenebilir. Bu yöntem, akons geçiş, büyüyen akons axotomizing değil, ve onların yörünge boyunca birden fazla puan içinde akons değerlendirmek yerel mikroçevre daha fazla bakımını avantajları vardır. Ayrıca, akons belirli alt kümeleri üzerindeki efektleri belirleyebilir. Örneğin, CXCR4 inhibisyonu orta beyin içinde hala dorsal yerine ventriketten büyümek için aksonlar neden olur, ama zaten ventriketden çıkıldı akons etkilenmez.

Introduction

Oküler motor sistemi, Akon rehberlik mekanizmalarını araştırmak için zarif bir sistem sağlar. Bu nispeten karmaşık değildir, üç kraniyal sinirler altı olağanüstü kasları innerve oluşan (eoms) hangi göz hareket, ve levator palpebrae Superioris (LPS) hangi göz kapağı kaldırır. Okülomotor sinir LPS ve dört EOMs innervates-inferior eğik ve medial, inferior, ve üstün rekus kasları. Diğer iki sinirler, trochleer ve kaçırır, her biri sadece bir kas, üstün eğik ve lateral rekus kası, sırasıyla inler. Göz hareketleri, innervasyon uygun, eksik veya aberrant olup olmadığını gösteren, kolay bir okuma sağlar. Ayrıca, nöronal gelişim veya Akon rehberliğinde eksiklikleri sonucu insan gözü hareket bozuklukları vardır, topluca konjenital kranial disinnervasyon bozuklukları (CCDDs)1olarak adlandırılır.

Bu avantajları rağmen, oküler motor sistemi nadiren Axon rehberlik çalışmaları kullanılır2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, teknik dezavantajları nedeniyle. In vitro Axon rehberlik birçok dezavantajları11olduğunu gösteriyor. Co-kültür, hangi nöronal Method birlikte hedef doku (12 veya transfekte hücreler13, eksplant hem simetri ve eksplant ve hedef doku arasında kesin konumlandırma bağlı olarak kültürsüz olduğunu gösteriyor. Stripe,14,15, hangi iki ipuçlarını değişen çizgili ve akons bir şerit üzerinde Tercihli büyüme için değerlendirilir, sadece bir substrat diğer için tercih edilir, ya da çekici olduğunu gösterir veya fizyolojik olarak ilgilidir. Microfluidics Chambers kesin kimyasal degradeler oluşturabilir, ama konu büyüyen akons kesme stres16,17,18, hangi büyümesini etkileyebilir. Dahası, bu yaklaşımların her birinde, Method veya ayrışmış hücrelerin toplanması, büyüyen akbitlerin axotomize edilmesi ve bu nedenle, ilk Aksiyon büyümesi yerine Axon rejenerasyonunu incelemenizi gerektirir. Son olarak, bu in vitro yaklaşımlar akons ve onların ders farklı noktalar boyunca ipuçlarına tepkiler etkiler mikroçevre kaldırmak ve geleneksel olarak sadece yalıtım bir işaret test. Bu dezavantajları compounding, oküler motor sisteminde her çekirdeğin küçük boyutu diseksiyon teknik ya Method veya Disosiye kültürler için zorlu yapar. Ayrıca, oküler motor nöronların primer kültürler genellikle heterojen, önemli hücre ölümü var, ve yoğunluk bağımlıdır, birden fazla embriyodan hücrelerin havuzu gerektiren (Ryosuki Fujiki, kişisel iletişim). In vivo yöntemleri, ancak, nakavt fare modelleri de dahil olmak üzere, tarama için kullanmak için uygunsuz, zaman ve masraf gerekli verilen.

Tüm embriyolar kültür için geliştirilen yöntemleri19 göç hücrelerin etiketleme izin20 veya belirli moleküllerin blokajı21, ancak tüm embriyo kültürler etiketli gerçek zamanlı görüntüleme engelleyen silindir şişeleri kuluçlan gerektirir Yapı. Embriyonun manipülasyonuna izin veren cerrahi teknikler ve sonra da uterusa veya annenin karında (plasental bağlantının korunması)22 de mümkündür, ancak bu da zaman atlamalı izin vermez Görüntüleme.

İn vitro asdların engelleri aşmak ve sinyalizasyon yollarının hızlı taramasına izin vermek için, bir ex vivo Embriyonik dilim kültürü tekniği geliştirilen23, periferik sinir gelişimi için daha önce yayımlanan bir protokol adapte24. Bu protokolü kullanarak, gelişmekte olan okülomotor siniri, EOM hedefleri de dahil olmak üzere yörüngesi boyunca çevreleyen yapıların çoğunun varlığında zamanla görüntülenmiş olabilir. Kültür ortamına küçük molekül inhibitörleri, büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları ekleyerek, Aksiyon yörünge boyunca birden fazla noktadan rehberlik perturbations değerlendirebiliriz, potansiyel büyüme ve rehberlik faktörleri daha hızlı değerlendirilmesi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada anlatılan tüm hayvan çalışmaları Boston Çocuk Hastanesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıanuc) protokollerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. zamanlanmış matings

  1. Yer ISLMN: Gfp (Islet motor neuron yeşil floresan protein; MGı: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J stok No: 017952) erkek ve kadın fareler birlikte bir gecede. Kadın ve kayıt ağırlıkları çiftleşme önce tartmak.
    Not: ISLMN: Gfp özellikle bir farnesylated Gfp ile motor nöronları Etiketler sitotoksisik değil, motor nöronlar ve akons hücre membranı yerelleştirir, ve sinirler geliştirme sırasında görselleştirilmesini sağlar25. Diğer Floresan etiketli çizgiler de kullanılabilir.
  2. Sabah erken saatlerde vajinal fişleri kontrol edin. Bir fiş tanımlandığında Tarih E 0.5 olarak belirlenir.
  3. Gebelik kilo artışı ve/veya ultrason E 10.5 kullanarak onaylayın. Hamile barajlar en az 1 g elde edilmelidir. embriyolar E 10.5 ultrasonda görülebilir.

2. dilim kültürü için reaktiflerin ve vibratomun hazırlanması

  1. Hazırlamak 500 mL Dilimleme tampon: 5 ml HEPES ve 5 mL penisilin/streptomisin-500 mL Hank 'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) olmadan CA2 + ve mg2 +ekleyin.  Chill 4 °C ' ye kadar.
    Not: ekstra Dilimleme tamponu 4 °C ' de depolanmalı ve gelecekteki dilim kültürü deneyleri için kullanılabilir.
  2. Hazırlamak 50 mL Kültür Medya: steril bir kaput, eklemek 12,5 mL HBSS, 12,5 mL fetal sığır serumu, 250 μL glikoz, 250 μL-glutamin, 125 μL HEPES için 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Final konsantrasyonları:% 25 HBSS,% 25 FBS, 0,5% glikoz, 1 mM glutamin ve 2,5 mM HEPES ile FlouroBright DMEM.).  Steril su banyosunda 37 °C ' ye kadar kültür medyasını ısıtın.
    Not: kültür ortamı 3 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
    1. Steril bir kaput, eklemek 1,5 mL Kültür medya her iyi bir 6-kuyu plaka.  Her iyi bir hücre kültürü eklemek (malzeme tablosu) ekleyin.  Steril 37 °C ve% 5 CO2 inküvatör yerleştirin.
  3. Hazırlamak 4% düşük erime sıcaklık agaroz: çözünür 2 g düşük erime sıcaklık agaroz 50 ml steril PBS. Tam olarak çözülene kadar 30-60 s aralıklarla mikrodalga. Sıvı tutmak için 40 °C ' lik su banyosuna yerleştirin.
    Not: ekstra agaroz oda sıcaklığında (RT) saklanabilir ve gelecekteki dilim kültürü deneyleri için eritilebilir.
  4. Vibratome ayarlayın: vibratome üzerinde yeni bir bıçak yerleştirin. Kontrol ayarları: kalınlık 400-450 μm. vibratome aşamasını ön Chill. Dış odaya biraz buz koyun. Canlı dilimlere adanmış bir oda ve sahne kullanın. Kalan fiktatif dilimlere zarar verebilir gibi sabit doku için aynı vibratome odası kullanmayın.
  5. Mikroskop sahne üst kuluçta 37 °C ve 5% CO2hazırlayın.
  6. Diseksiyon için hazırlanın:% 70 etanol ile temiz cerrahi aletler ve sprey. HBSS ile iki Petri yemekleri doldurun, buzun üzerine yerleştirin. 12 iyi doku kültürü plakası açın ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde buzun üzerine kapağı yerleştirin. Açık bir 6 iyi doku kültürü plaka ve yer hücre kültürü membran ekler ve 1,5 mL hücre kültürü medya her iyi. 37 °C ve% 5 CO2 kuluçte plakayı önceden ısıtın.

3. E 10.5 embriyo toplama ve dilim hazırlama

Not: Bu noktadan gelen tüm adımlar mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Embriyoları her zaman buzda tutun.

  1. Bir CO2 odasında hamile Barajı (e 10.5) ötenize. Servikal dislocation gerçekleştirin.
  2. % 70 etanol ile karın sprey. Makas ile karın açık kes, rahim kaldırmak ve hızlı bir şekilde kan yıkamak için buz soğuk HBSS ile bir petri çanak yerleştirin. Yıkanabilir rahim, çanak buz soğuk HBSS ile dolu ikinci bir petri taşıyın.
  3. Bir diseksiyon kapsamı altında, uterus boynuz ve bireysel amonoz saclar embriyoları çıkarın. Embriyoları 12 kuyu plakasının kapağının alt tarafına yerleştirin. Buzdan devam et.
  4. Bir diseksiyon kapsamı altında, her embriyo çevreleyen herhangi bir sıvı kaldırmak için filtre kağıdı kullanın.
    Not: embriyolar dokunulduğunda filtre kağıdına yapışacaktır.
  5. Agarose 'de embriyo ekleyin. Onu kapsayacak şekilde her embriyo üzerinde eritilmiş agaroz dökün. Buzdan devam et. Agaroz sertleşmiş olarak, her embriyo çevirmek ve diğer tarafta ek agaroz dökün. Buzdan devam et.
  6. Floresan diseksiyon kapsamı kullanarak, her bir embriyo etrafında agaroz trim böylece düzgün vibratome aşamaya yapıştırılmış olarak yönlendirilmiş olacak. Okülomotor çekirdeği ve erken Aksiyon büyüme floresan vardır. Embriyo, çekirdek, büyüyen akons ve göz bir çizgi şeklinde hizalayın ve bu satıra paralel bir jilet kesme ile agaroz Trim (embriyo için dorsal, bkz: Şekil 1a).
    Not: Bu, vibratome aşamasına yapıştırılan yan olacaktır (embriyo sırtına yerleştirilecektir, vibratome bıçağına en yakın kafa). Okülomotor çekirdeği ile göz arasındaki bir çizgi, vibratom bıçağının paralel olması gerekir.
  7. Vibratome odasını buz soğuk dilim tampon ile doldurun. Vibratome aşamaya embriyo superglue böylece bıçak okülomotor çekirdeği ve gözleri ile paralel olacaktır. Süper Tutkal kuru olduktan sonra, vibratome aşamasını daldırın, böylece embriyo bıçağdan uzağa dönük olarak yönlendirilir.
  8. Dilim 400-450 μm dilim.  Her dilimi steril bir transfer pipet ile toplayın. Soğuk Dilimleme tamponunun içine yerleştirin.
  9. Diseksiyon kapsamı altında, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilim seçin. Steril bir transfer pipet kullanarak, 6 kuyu plakası hücre kültürü eklemek üzerine yerleştirin. Plakayı 37 °C ' lik kuluçağa geri dönün. Alternatif olarak, bir kişi Dilimleme ve başka bir dilim yerleştirerek var. Dilimleme ve kuluçt içine yerleştirme arasındaki süreyi minimize.
    Not: dilimler, çekirdekten ve akonlardan yayılan maksimum floresan görüntü mikroskop hedefe en yakın şekilde yönlendirilmelidir. Ters bir mikroskop üzerinde, dilim plakanın altındaki amaca en yakın çekirdekler ve akonlar ile membran üzerine yerleştirilmelidir.
  10. Vibratome aşamasından kalan agaroz çıkarın, sonraki embriyo sahneye yapıştırıcı ve tüm embriyolar dilimlenmiş ve kaplama kadar 3.7-3.9 adımları tekrarlayın.
  11. Her iyi bir doz-yanıt eğrisi oluşturmak için medya tercih inhibitörü veya rekombinant molekül ekleyin.  Uygun solvent içinde seyreltmeli.
    Not: DMSO kullanıyorsanız, yalnızca doku kültürü Grade DMSO kullanın. Alternatif olarak, protein-eluting boncuklar dilim üzerinde belirli yerlerde yerleştirilebilir.
  12. 37 °C ve% 5 CO2 odasına mikroskop üzerine yerleştirin.  Her dilim her dilimin faz kontrast ve floresan fotoğraf almak için mikroskop ayarlayın her 30 dakika (veya daha sık istenirse). Dilim 48-72 h için muhafaza edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal sonuçlar: Şekil 1 denemenin şematiği sağlar. Fare E 9.5 kadar erken başlayarak, ilk akons okülomotor çekirdeği26ortaya çıkmaya başlar. E 10.5, erken öncü nöronlar içeren bir fascikulated okülomotor sinir, mezenyme görülebilir. Orada E 10.5 embriyolar arasında önemli değişkenlik vardır (hatta aynı çöp içinde) ne kadar sinir yörüngeye doğru ilerlemiştir, birkaç saat gelişimsel farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla. Utero gelişiminde normal sırasında, Ilk Gfp-pozitif okülomotor akons yörünge/göz sonraki 18-24 h (tarafından e 11.5) ulaşmak ve sonra nihai hedefleri27dallanma başlar. Dilim kültüründe, bu zamanlama reapitulated (Şekil 2, video 1). Dilim büyür ve en fazla 72 h için (tüm yönlerde) genişletir ve akons göz doğru çekirdeğinden uzanan görülebilir. Biz bulduk ilk 36-48 h en yararlı okülomotor Akon büyüme değerlendirmek için. Motor nöronlar bazen çekirdeğin içinde hareket görülebilir (gösterilmez). Bazı dilimleri, oryantasyona bağlı olarak, trochleer çekirdeği de mevcut. Trochleer akons dilim içinde yanal uzatmak ve genellikle stand, çünkü onların normal ders yanal trochleer çekirdeği çıkmak için, dorsal ve caudally, hangi dilim dışında olacağını dönmeden önce. Bazen, trochleer akons okülomotor akons ile katılmak ve göz doğru çevirmek gibi görünüyor, hangi dilim yorumlamak zor kılan, bu akonlar okülomotor akons rehberlik üzerinde ikincil bir etkisi olabilir gibi.

Önemli bir aksiyon rehberlik yolu inhibe örneği: Inhibe CXCR4 sinyalizasyon yerine dorsal neden okülomotor akons ventral büyüme. Dilim kültürü hazırlanacak şekilde doğrudan kültür medyasında, su ile çözünen küçük bir molekül inhibitörü olan CXCR428' in 1 μg/mL (1,26 ΜM) AMD3100 ekleyerek okülomotor GELIŞIMI üzerinde CXCR4 sinyalizasyon rolünü değerlendirdik. Okülomotor akons daha sonra okülomotor çekirdeği dorsal çıkarken görülebilir ve yörünge ("geri") uzakta büyüyen (Şekil 2, video 2). Zaten orta beyin bırakmış ve E 10.5 yörüngesine yol oldu bu akonlar onların yolda devam etti. CXCR4 inhibisyonu da dilim genel büyümesini etkiler.

Dilimin yönü çok önemlidir. Dilimler doğru şekilde yönlendirilmiş değilse yorumlanabilir değildir. Şekil 3' te yanlış yönlendirilmiş dilimlerin bazı örnekleri gösterilir. Embriyo tarafına eğilmiş ise, dilimde sadece bir okülomotor çekirdeği vardır (Şekil 3A).  Gömülü embriyo sırtını doğru çok uzağa eğilmiş ise, gözler dilim değil, ve bunun yerine üst ekstremite ve arka beyin veya omurilik dilim olabilir (Şekil 3B).  Bu durumda, okülomotor akonlarının normal yörüngesi mevcut değildir ve rasgele büyümeye eğilimlidir. Dilim kültür membranı üzerine yerleştirilirken, katlanmış hale gelebilir (Şekil 3C).

Çözücüler toksik olabilir. Organik çözücüler önleyici inhibitörler veya büyüme faktörleri sırasında bakım alınmalıdır. Şekil 4 medyaya etanol eklendikten sonra ölen bir dilim örneği gösterir. 118 μL 1,5 mL medyaya (son konsantrasyon% 7,8) eklendi ve bu yüksek konsantrasyon zehirli olduğunu kanıtladı. Bunu önlemek için, mümkün olan en az solvent miktarını (çözünürlük sınırına kadar) çözün. Mümkün olduğunda, suda çözülür. DMSO kullanılırsa, steril, doku kültürü Grade DMSO olduğundan emin olun.

Figure 1
Şekil 1 : Şematik. E 10.5 ISLMN-Gfp embriyolar (A: fotoğraf, B: şematik) bir vibratome dilimlenir (400-450 μm kalınlığında) böylece bölümler okülomotor çekirdeği ve yörünge içerir. A ve B 'deki paralel kesikli çizgiler, vibratome kesimlerin konumunu gösterir. A 'daki alt kesikli çizgi, agarin kesilmiş ve vibratome aşamasına yapıştırılan yeri gösterir. (C) bölümler, besin maddeleri ve gazların değişimi sağlayan ve zaman aşımı mikroskopisi için bir aşama-üst inküdosa yerleştirilen bir doku-kültür membranına düz yerleştirilir. Bu aşamada, büyüme medyasına inhibitörler eklenebilir. (D) kültürler 24-72 h için muhafaza edilebilir ve okülomotor akons göz büyüyen görülebilir. Whitman 'ın izniyle adapte edildim, et. Al. 201823. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Inhibisyonu CXCR4 nedenlerı CN3 yanlış yönlendirme. E 10.5 ISL-GFP embriyoları arasındaki dilim kültürler 0, 12, 24 ve 36 h kültüründe görüntülenmiş. Üst panel bir vahşi tip kontrol embriyo ve CN3 (yeşil) göz ve şubeleri yoğun 36 h ders üzerinde doğru büyür gösterir. Ayrıca bkz: video 1. Alt panel 1 μg/mL AMD3100 (CXCR4 için spesifik inhibitör) eklenmiş bir dilim gösterir ve akkıslar okülomotor çekirdeğini dorsally 'den çıkar. Zaten ventrikuşdan çıkanlar gözlere doğru devam ettiler. Ayrıca bkz: video 2. D: dorsal, V: ventral, E: göz, N: okülomotor çekirdeği, SMN: Spinal motor nöronlar, oklar: okülomotor akons (beyaz: wildtype projeksiyon, sarı: anormal projeksiyonlar). Ölçek çubuğu 200 μm eşittir. Ayrıca bkz: video 1 ve video 2.  Diğer örnekleri gösteren benzer bir rakam Whitman, et sunuldu. Al. 201823. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Dilimlerin oryantasyonu çok önemlidir. Temsili yanlış yönelimli dilimlerin ilk görüntüleri (saat 0 h). A , embriyonun yan tarafa eğilmiş olduğu bir dilim gösterır, CN3 akons projelendirilmesi akotomize edildi. Akons projelendirilmesi sadece dilim (ok) sağ tarafında bulunur.  B , embriyonun geri eğilmiş olduğu bir dilim gösterir, böylece CN3 çekirdekleri, akons (ok) projelendirilmiş olarak görülebilir, ancak gözler dilimde mevcut değildir. Bunun yerine spinal motor nöronlar (SMN) ve ekstremite motor nöron projeksiyonları görülebilir. C membran üzerinde yerleştirme sırasında katlanmış bir dilim gösterir. Burada gösterildiği gibi dilimler atılmalıdır. Ölçek çubukları her panelde 500 μm temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Çözücüler toksik olabilir. E 10.5 ISL-GFP embriyoları 0 ve 12 saat kültüründe dilim kültürlerinin zaman aşımı görüntüleme. Hiçbir katkı maddesi (a-B) ile medyada kültürlü bir dılım, CN3 akons göz doğru projeksiyon ile 12 saat normal büyür. Bir dilim etanol yüksek konsantrasyonlu medyada kültürlü (% 7,8) (C-D) normal olarak büyüymez. 12 saat de, CN3 büyümüş değil ve zar zor görünür, ve doku parçalanır başladı. Ölçek çubukları her panelde 500 μm temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Video 1
Video 1: dilim kültüründe CN3 büyüme. Bir E 10.5 ISL-GFP embriyo bir kontrol dilim kültürü zaman atlamalı görüntüleme. Her 30 dakikada bir çekilen görüntüler 18 kültür h. CN3 (yeşil) çekirdeğinden (üst) gözlere doğru büyür ve dallanma başlar. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Video 2
Video 2: CXCR4 sinyalizasyon Inhibisyonu Ile CN3 Mistargeting. E 10.5 ISL-GFP embriyoları, kültür 48 h üzerinden dilim kültürlerinin zaman aşımı görüntüleme. 1 μg/ml AMD3100 (CXCR4 için spesifik inhibitör) doğrudan ortama eklendiğinde, henüz çevre çıkışında olmayan CN3 akonlar, ventrikül (sağda) yerine dorsal (sol) olarak okülomotor çekirdeğini çıkar. Whitman 'ın izniyle yeniden basıldı, et. Al. 201823. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu ex vivo dilim kültür Protokolü geleneksel Akon rehberlik üzerinde önemli avantajlar sağlar23diyor. Her kranial motor çekirdeğin büyüklüğü sınırlayıcı bir faktör değildir ve zor bir diseksiyon gereklidir. Akons seyahat korunur endojen mikroçevre, diğer sinyalizasyon yolları korurken bir sinyal yolu modifikasyonu sağlar. Ayrıca, efektler Akon yörünge boyunca farklı noktalarda değerlendirilebilir. Axon rehberlik birden fazla ipuçları ve ipuçları kombinasyonları, yol29boyunca gerektirdiğinden, bu önemli bir avantaj sağlar. Dışlanmış veya eksplant kültürlerinde aksine, büyüyen akons Bu preparat kesilmez, bu nedenle ilk Aksiyon büyüme, Akon rejenerasyon yerine değerlendirilebilir. Diğer birçok rehberlik konusunda, Axon rejenerasyonu aslında ilk Aksiyon büyümesi yerine değerlendirilmektedir. Akotominin önlenmesi, nöronların zarar görmediği veya stres altında olmadığı için önemli potansiyel karıştırıcı faktörleri de önler.

En kritik iki adım, embriyoların Dilimleme ve anne ötenazi arasındaki süreyi en aza indirmek ve kuluçken dilimlerin yerleştirilmesi için yönlendiriyor. Embriyo her zaman buzda tutulmalıdır. Oryantasyon için, birkaç farklı kalıplar denedik, ama bu yaşta embriyolar arasındaki değişkenlik nedeniyle, biz el ile oryantasyon, diseksiyon mikroskop altında floresans dayalı bulduk, en etkilidir. Elle oryantasyon, ancak incelenebilir embriyonik zaman penceresini sınırlar. E 10.0 daha erken, göz görmek zordur ve çok az CN3 akons görülebilir çünkü dilim doğru yönlendirilmesi zordur. Bu, ancak, biz bu aksonlar dilimi yönlendirmek edebilmek için kısmen yol büyümek için izin vermek gerekir, en erken öncü Axon büyüme çalışması için bu yöntemi kullanamazsınız anlamına gelir.

Okülomotor dilim kültürü hazırlığı için birkaç sınırlama vardır. Bu, Terminal dallanma kararları yerine erken ve ara rehberlik kararları okumak için yararlıdır. E 10.5, EOMs sadece bir kas Anlage olarak mevcut. Hatta daha sonra zaman noktalarında, geçerli görüntüleme teknolojisi ile, bireysel hedef EOMs dilim içinde ayırt edilemez. Okülomotor akonlarının belirli Terminal dallanma kararları, bu nedenle geçerli koşullar ile değerlendirilemez. Dilim gözenekli doku kültürü membranlarında yetiştirilen çünkü, membrandan sonrası kültür ayrımı zordur ve genellikle doku hasarına neden olur, antikor boyama ve ek görüntüleme başarısız yeniden montajı yapma. Akons kesilmiş olmasa da, böylece nöronal hasarı minimize, çevreleyen dokularda kesilmiş ve bu nedenle hasar, hangi sinyalizasyon işaret ifadesi veya serbest etkileyebilir. İdeal zaman penceresi de sınırlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, dilim E 10.0 yönünü daha erken zor ve E 11.5 sonra, birçok akons zaten yörünge ulaştı, bu yüzden ara rehberlik kararları zaten yapılmıştır.

Hazırlık, sahne üstü kuluçta, otomatik aşama ve zaman atlamalı özelliği olan bir mikroskop gerektirir. Hedefler ve kamera hiçbir temizleme ile kalın numunelerin görüntülenmesi için optimize edilmesi gerekir. Tek bir büyüme koni düzeyinde çözünürlük, bazı kültür preparatları ile mümkün olduğu gibi, mevcut görüntüleme ayarlama ile mümkün değildir. Ancak görüntüleme parametreleri, her dilimdeki küçük bir alana odaklanan Konfokal veya 2-foton mikroskobu ile daha yüksek çözünürlüğe izin vermek için adapte edilebilir (muhtemelen akons büyüdükçe dilim olarak ayarlanabilir). Mevcut epifloresan mikroskop ve görüntüleme her 30 dakika kullanarak, biz fotobleaching görmedik; konfoksel mikroskopi ve daha sık görüntüleme kullanılabilir, ancak fotobleaching potansiyel bir sorun haline gelir.

Küçük molekül inhibitörleri diliminin genel büyüme ve sağlık dahil olmak üzere, off-Target etkileri olabilir çünkü, bu tahlil en bir tarama aracı olarak yararlıdır. Sonuçların, nakavt fare modelleri gibi diğer yöntemler tarafından doğrulanması gerekir. Örneğin, CXCR4 inhibisyonu ile, dilim hafif azalmış genel büyüme (bkz. Şekil 2), CXCR4 Çoklu fonksiyonları ile tutarlı. Fare modellerinde, ancak, dilimde görülen Akon fenotipi23reapitüle edildi.

Bu protokol, diğer kraniyal sinir popülasyonlarının incelenmesi için değiştirilebilir, ancak her biri için, dilimler ve zamanlamanın uygun yönü ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, farklı floresan etiketlere sahip fareler, nöronların farklı alt kümelerini işaretleyebilir ve/veya daha önce veya daha sonra embriyonik çağlarda açmak için kullanılabilir.

Dilim kültürü birden çok şekilde manipüle edilebilir. Burada küçük bir molekül inhibitörü ile reseptör sinyalizasyon engelleme bir örnek gösteriyoruz. Alternatif olarak, antikorlar (reseptör engelleme veya reseptör aktive) veya Akon rehberlik ipuçları veya büyüme faktörleri gibi rekombinant proteinler, medyada eklenebilir. Aksiyon rehberliğinde yön efektleri için değerlendirmek için, ligand-salgılanan boncuk belirli konumlarda dilim yerleştirilebilir. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak, diğer birçok Axon rehberlik yolları tespit ve oküler motor sisteminde incelenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Finansman Ulusal göz Enstitüsü tarafından sağlanan [5K08EY027850], çocuk sağlığı ve gelişimi Ulusal Enstitüsü [U54HD090255], Harvard-Vision klinik bilim adamı geliştirme programı [5K12EY016335], şövalyeler göz Vakfı [kariyer Starter Grant] ve Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı [Fakülte keşif Ödülü]. ECE, Howard Hughes Tıp Enstitüsü müfettişi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25, (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25, (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70, (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82, (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140, (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399, (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105, (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177, (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101, (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81, (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8, (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144, (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8, (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244, (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59, (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13, (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58, (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200, (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145, (10), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics