التحسين والتصميم وتجنب المزالق في الكيمياء المناعية الفلورية متعددة اليدوية

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تعدد الكيمياء المناعية الفلورية هي التكنولوجيا الناشئة التي تمكن التصور من أنواع الخلايا متعددة داخل سليمة شكلي الثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة. تقدم هي المبادئ التوجيهية لضمان متعددة 7 ألوان ناجحة مع تعليمات لتحسين الأجسام المضادة والكواشف، وإعداد الشرائح، والتصميم ونصائح لتجنب المشاكل الشائعة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تقييم البيئة الدقيقة للأنسجة السليمة لتحليل تسلل الخلايا والتنظيم المكاني أمر ضروري لفهم تعقيد عمليات المرض. وتشمل التقنيات الرئيسية المستخدمة في الماضي الكيمياء المناعية (IHC) والفلورة المناعية (IF) التي تمكن تصور الخلايا كلقطة في الوقت المناسب باستخدام ما بين 1 و 4 علامات. ولكل من التقنيات أوجه قصور، بما في ذلك صعوبة تلطيخ الأهداف غير المضادة للجينات والقيود المتصلة بالتفاعل بين الأنواع. IHC موثوق بها واستنساخها، ولكن طبيعة الكيمياء والاعتماد على الطيف الضوئي المرئي يسمح فقط لعدد قليل من العلامات لاستخدامها ويجعل التعريب المشترك تحديا. استخدام IF يوسع علامات المحتملة ولكن عادة ما يعتمد على الأنسجة المجمدة بسبب الفلورة الأنسجة واسعة النطاق بعد تثبيت رسمي. قياس التدفق الخلوي، وهي تقنية تمكن من وضع علامات متزامنة على الepitopes متعددة، يلغي العديد من أوجه القصور في IF وIHC، ومع ذلك، فإن الحاجة إلى فحص الخلايا كما تعليق خلية واحدة يفقد السياق المكاني للخلايا التخلص من البيولوجية الهامة العلاقات. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) الجسور هذه التكنولوجيات مما يسمح لمتعدد epitope الفينولات الخلوية في البارافين ثابت ة رسمية جزءا لا يتجزأ (FFPE) الأنسجة مع الحفاظ على الهندسة المعمارية البيئية الدقيقة الشاملة والمكانية علاقة الخلايا داخل الأنسجة غير المعطلة سليمة. عالية الكثافة الفلورسنت الفلوروفور التي ترتبط بشكل مشترك إلى epitope الأنسجة تمكن تطبيقات متعددة من الأجسام المضادة الأولية دون القلق من الأنواع محددة عبر التفاعل من قبل الأجسام المضادة الثانوية. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا قد ثبت لإنتاج صور موثوقة ودقيقة لدراسة المرض، فإن عملية إنشاء استراتيجية تلطيخ mfIHC مفيدة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وصارمة بسبب التحسين والتصميم واسعة النطاق. من أجل جعل الصور القوية التي تمثل التفاعلات الخلوية دقيقة في الموقع والتخفيف من فترة التحسين للتحليل اليدوي، المعروضة هنا هي طرق لإعداد الشريحة، وتحسين الأجسام المضادة، وتصميم متعددة، فضلا عن الأخطاء التي تواجهها عادة خلال عملية تلطيخ.

Introduction

التصور من البيئة الدقيقة الورم سليمة (TME) أمر ضروري في تقييم ليس فقط التسلل الخلوي في الأورام الخبيثة الصلبة ولكن الخلية إلى تفاعلات الخلية كذلك. وقد ظهرت متعددة الفلورسنت الكيمياء المناعية (mfIHC) كأداة فعالة لمتعددة مستضد الفينولمنت من الخلايا في دراسة السرطان والأمراض المرتبطةبها 1،2،3،4، 5و6و7. هذا، جنبا إلى جنب مع البرامج الجديدة والبرامج المصممة لتحليل مجموعاتالبيانات الكبيرة، تمكن من مراقبة التفاعلات المعقدة بين الخلايا 1،4. عامل الحد من معدل في الحصول على البيانات هو في كثير من الأحيان نوعية الأنسجة الملونة قبل التحليل.

وتشمل التقنيات السابقة المستخدمة في الخلايا الظاهرية في TME الكيمياء المناعية (IHC)، والفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي التي تشكل جميعها قيودا ً كبيرة. يستخدم IHC رسميًا أجزاء البارافين المدمجة (FFPE) التي يتم إزالة البارافين وترطيبها قبل أن تلطخت بجسم مضاد واحد في أغلب الأحيان. استخدام بيروكسيداز الفجل (HRP) ملزمة الأجسام المضادة الثانوية ورد الفعل الكيميائي يسمح التصور من epitope مضاد للجينات واحد8. في حين أن IHC موثوق بها وتنفيذها على أنسجة FFPE التي من السهل العمل مع، والقيود على الطيف الضوئي المرئي يعني واحد فقط أو اثنين من علامات يمكن أن تكون موثوقة متميزة والتوطين المشترك من المستضدات من الصعب جدا8. وهناك طريقة لتوسيع العلامات المتاحة وبالتالي المستضدات التي يمكن فحصها على مقطع واحد هو تغيير إلى الفلورة التي تسمح باستخدام مجموعة أوسع من الطيف البصري. بالنسبة للأنسجة المجمدة أو FFPE، يتم نقلها إلى الشرائح والأجسام المضادة المستخدمة التي يتم مترافقة مع مختلف الفلوروفور. في حين أن هذا يزيد من عدد المستضدات التي يمكن التحقيق فيها، هناك العديد من القيود الهامة. أولا، لأن كل الأجسام المضادة عادة ما يكون واحد فقط فلوروفور تعلق، وسطوع في كثير من الأحيان ليست قوية بما فيه الكفاية للتغلب على الفلورة الأنسجة. ولهذا السبب، يتم تنفيذ معظم IF على الأنسجة المجمدة التي هي مكلفة لتخزين ويصعب العمل مع. يتوفر عدد محدود من العلامات الفلورية للاستخدام بسبب التداخل الطيفي وتفاعل الأنواع المتقاطعة خاصة عند استخدام الأجسام المضادة غير المتقارنة. تدفق قياس الخلايا، والذي يتكون من معالجة الأنسجة الطازجة في تعليق خلية واحدة ووضع العلامات مع الأجسام المضادة الفلورسنت كان المعيار الذهبي للمناعة للنماذج المناعية لعقود9،10. فائدة قياس التدفق هو القدرة على تسمية الأجسام المضادة متعددة دون القلق على التفاعل عبر الأنواع كما يتم الجمع بين معظم. لأن الخلايا هي "تصور" من قبل آلة وليس عيون الإنسان، وهناك أكثر بكثير الفلوروفور المتاحة ولكن هذا يأتي مع تكلفة. ويجب أن يتم التعويض يدويا، الأمر الذي يمكن أن يغير إلى حد كبير النتائج التي تسفر عن مجموعات سكانية إيجابية وسلبية زائفة. أهم قيد على قياس التدفق هو أن بنية الأنسجة وبالتالي تفقد جميع المعلومات المكانية بسبب ضرورة تعليق الخلايا المفردة.

تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) باستخدام المجهر الفلورسنت الآلي في تركيبة مع برامج جديدة يجمع بين فوائد IHC، IF وقياس التدفق الخلوي من خلال السماح للأنسجة متعددة مستضد تلطيخ مع تضخيم إشارة و الاحتفاظ بالعلاقات المكانية دون الحاجة إلى التعويض. يتم وضع أنسجة FFPE على الشرائح المشحونة التي، بعد استرجاع مستضد، تخضع لجولة من تطبيق الأجسام المضادة الأولية إلى مستضد الهدف من الفائدة تليها الأجسام المضادة الثانوية مع علامة كيميائية HRP، على غرار IHC. بعد وضع الأجسام المضادة الثانوية، وHRP رد فعل محدد يؤدي إلى الفلوروفور ملزمة بشكل مشترك إلى epitope من الفائدة11. مرة واحدة يتم تسمية الأنسجة، يتم الانتهاء من جولة أخرى من التدفئة الشرائح إزالة مجمع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المطبقة سابقا ترك فقط علامة الفلورسنت ملزمة إلى epitope الأنسجة11. وهذا يسمح لإعادة تطبيق الأجسام المضادة المتعددة من أي نوع دون القلق من التفاعل المتبادل11،12. ولتقليل أي حاجة إلى تعويض يدوي لأصباغ فلورية متعددة، تُستخدم مجموعة من الفلوروفورات ذات التداخل الطيفي القليل بما في ذلك وصمة عار مضادة نووية لإكمال الـ MFIHC. لحساب الفلورة الذاتية التي تواجهها مع أنسجة FFPE، يطرح البرنامج الفلورة الذاتية من الصورة النهائية باستخدام صورة من شريحة فارغة وهو أمر ممكن بسبب قوة الفلورة مستضد محددة بعد فلوروفور تضخيم الإشارة. باستخدام برامج جديدة مصممة لمجموعات البيانات الكبيرة، يمكن تحديد مواقع الخلايا وتحليلها للسياق المكاني1و2و4. الحد الأكثر أهمية من هذه التقنية هو وقت التحسين. وجدت هنا منهجية مفصلة مع تعليمات للتصميم التجريبي واستراتيجية التلطيخ والتصوير. سوف تكون MFIHC مفيدة للمختبرات التي ليس لديها حاليا نظام تلطيخ الآلي الأمثل التي ترغب في فهم أفضل للسياق المكاني للتفاعلات من خلية إلى خلية في أنسجة FFPE سليمة باستخدام تقنية يدوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال من قبل مجلس المراجعة الداخلية في جامعة ميشيغان.

1. تحسين الأجسام المضادة الأولية وإعداد الشريحة

  1. تحديد التركيز المثالي للأجسام المضادة للمضاعفات باستخدام IHC التقليدية.
    1. اختبار الأجسام المضادة للمضاعفات عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية اليدوية (IHC)13.
    2. استخدام أنسجة محددة تحتوي على نوع خلية وفيرة لكل جسم مضاد تم اختباره مثل استخدام أنسجة اللوزتين لاختبار الأجسام المضادة CD3.
    3. استخدم التركيز المرجعي للIHC الموصى به من قبل الشركة ثم أكمل IHC مع تركيزات الأجسام المضادة في التركيزات الموصى بها وكذلك التركيزات أعلى وتحت التركيز الموصى به.
  2. إعداد رسمي البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من الأنسجة على الشرائح.
    1. باستخدام ميكروتومي، قطع كتل من أنسجة FFPE في سمك بين 4 و 6 م وتنطبق على الشرائح المشحونة.
      ملاحظة: استخدام الماء المقطر يضمن تركيب الأنسجة المناسبة والالتزام في جميع أنحاء متعددة.
    2. ضع الشرائح مسطحة، والأنسجة الجانب حتى، والسماح لتجف في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. تخزين الشرائح في مربع الشريحة بعيدا عن درجة الحرارة القصوى حتى جاهزة لإكمال متعددة.

2. طريقة تلطيخ العامة

  1. إعداد حلول الغسيل واسترجاع المستضد
    1. إعداد محلول غسل 0.1٪ TBST عن طريق خلط 9 لتر من الماء منزوع الأيونات، 1 لتر من التريس المخزنة المالحة (TBS) و 10 مل من بوليسوربات 20.
    2. إعداد كل من حلول استرجاع مستضد (الحموضة 6 و pH 9; جدول المواد) عن طريق تخفيف إلى 1X مع الماء منزوع الأيونات.
  2. إزالة البارافين والإماهة
    1. خبز الشرائح، والكذب شقة، والأنسجة الجانب حتى في60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في فرن التهجين 1. قم بإزالة الشرائح من الفرن والسماح بيبرد لمدة 5-10 دقائق على الأقل ثم ضعها في حامل شرائح عمودي.
    2. علاج الشرائح في الحلول التالية بالتتابع: xylene في triplicate، تليها معالجة واحدة من الإيثانول 100٪، 95٪ الإيثانول، وأخيرا70٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة لكل منها باستخدام مجموعة تلطيخ الشريحة 1.
    3. غسل رف من الشرائح لمدة 2 دقيقة مع الماء منزوع الأيونات عن طريق الغمر في مربع الشريحة البلاستيكية تليها التثبيت عن طريق الغمر في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة محايدة المخزنة الرسمية لمدة 30 دقيقة13. اغسل الشرائح في الماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين ثم انتقل إلى استرجاع المستضد.
  3. مستضد الاسترجاع
    1. ضع رف الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة مملوء بالخط الداخلي (حوالي 300 مل) مع المخزن المؤقت لاسترداد المستضد بالساعة 6 أو درجة الحموضة 9.
      ملاحظة: يمكن أن يكون المخزن المؤقت استرداد مستضد إما pH 6 أو pH 9 التي قد تحتاج إلى تحسين لكل epitope. ومع ذلك، ابدأ باستخدام درجة الحموضة 9 للأجسام المضادة التي تربط النعوت النووية ودرجة الحموضة 6 لجميع الأجسام المضادة الأخرى.
    2. تغطية مربع مع التفاف من البلاستيك واستخدام الفرقة المطاطية لتأمين. ضع الصندوق في الميكروويف على حافة اللوحة الدوارة (يجب أن يكون الميكروويف مجهزاً بتكنولوجيا العاكس للتدفئة حتى). تسخين الشرائح لمدة 45 s في 100٪ السلطة تليها 15 دقيقة في 20٪ السلطة13.
      ملاحظة: قد يحتاج العلاج بالموجات الدقيقة إلى تحسين الميكروويف المستخدم.
    3. دع الشرائح تبرد لمدة 15-20 دقيقة تقريبًا.
  4. إعداد حلول العمل من الأجسام المضادة والفلوروفورفية في حين الشرائح باردة.
    1. إعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية عن طريق حل 0.5 غرام من حبيبات الزلال المصل البقري في 50 مل من TBST. بدلا من ذلك، استخدم 50 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لإذابة حبيبات.
    2. جعل كل حل عمل الأجسام المضادة الأولية للتركيز الأمثل المحدد في القسم 1، في تخفيف الأجسام المضادة الأولية. تقدير حوالي 200 ميكرولتر لكل شريحة.
    3. إعداد حل العمل فلوروفور عن طريق تخفيف كل فلوروفور في مخفف الفلوروفوري بتركيز 1:100.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى تحسين هذا استناداً إلى الأجسام المضادة. تقدير حوالي 100 درجة مئوية لكل شريحة.
    4. في اليوم الأخير من تلطيخ, إعداد 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) حل العمل بإضافة 3 قطرات من DAPI في 1 مل من TBST.
  5. تلطيخ الشرائح (الغسيل والحظر)
    1. إزالة مربع من الميكروويف بعد التبريد وخلع التفاف البلاستيك، وغسل الشرائح مع الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة تليها غسل 2 دقيقة في مربع الشريحة البلاستيكية شغلTBST13.
    2. بعد تجفيف كل شريحة حول الأنسجة مع مهمة حساسة مسح الحرص على عدم السماح للأنسجة تجف، وتتبع حول الجزء الخارجي من الأنسجة باستخدام قلم حاجز الخوف من الماء. لا تلمس الأنسجة مع مسح المهمة الحساسة أو القلم.
    3. ضع كل شريحة في الغرفة المرطبة وأضف محلول حظر (حوالي 4 قطرات) إلى الأنسجة. حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. تلطيخ الشرائح (تطبيق الأجسام المضادة الأساسي)
    1. خذ كل شريحة وإزالة حل حظر عن طريق النقر على جانب الشريحة على كومة من المناشف الورقية واستخدام مهمة حساسة مسح لإزالة عامل حظر الزائدة من جميع أنحاء الأنسجة.
    2. وضع الشريحة مرة أخرى في غرفة رطبة وإضافة ما يقرب من 200 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية العاملة. الحضانة في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
    3. غسل مع TBST لمدة 2 دقيقة عن طريق الغمر في triplicate13.
      ملاحظة: بعد كل خطوة غسل تغيير TBST سيساعد على ضمان صورة أنظف.
  7. تلطيخ الشريحة (تطبيق الأجسام المضادة الثانوية)
    1. دبس قبالة TBST المتبقية من كل شريحة وتطبيق ما يقرب من 3 إلى 4 قطرات من الأجسام المضادة الثانوية (خليط من الأرانب والماوس الثانوي HRP المترافق الأجسام المضادة). حضانة لمدة 10 دقائق في غرفة مرطبة في RT13.
      ملاحظة: إذا كان التخطيط لاستخدام جسم مضاد أساسي يتطلب جسم ًا مضادًا ثانويًا غير الماوس أو الأرنب أو اختيار استخدام جسم مضاد ثانوي بديل، قم بتطبيق HRP الثانوي المترافق المناسب على الشرائح والحضانة في RT لمدة 45 دقيقة. قد تكون هناك حاجة إلى وقت الحضانة للثانوية البديلة14.
    2. بعد الحضانة، يغسل مع TBST لمدة 2دقيقة في 33.
  8. تلطيخ الشرائح (تطبيق فلوروفور)
    1. تطبيق ما يقرب من 100 درجة مئوية من حل العمل فلوروفور وحضانة في غرفة رطبة في RT لمدة 10 دقيقة13.
    2. غسل مع TBST لمدة 2 دقيقة في triplicate13.
  9. إزالة الأجسام المضادة
    1. الشرائح الميكروويف (45 ق في 100٪ ثم 15 دقيقة في 20٪) في مربع مقاومة للحرارة (انظر الخطوة 2.3.2) لإزالة الأجسام المضادة13،14.
      ملاحظة: هذا يكمل جولة واحدة من تعدد المضاعفات. هذه هي النقطة الوحيدة التي يمكن عندها إيقاف البروتوكول مؤقتاً. لإيقاف البروتوكول مؤقتًا، اترك الشرائح مغمورة في المخزن المؤقت لاسترداد المستضد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  10. مواصلة جولات إضافية من تلطيخ. كرر الخطوتين 2.5.1-2.9.1 لبقية أزواج الأجسام المضادة للفلورة. وبمجرد استخدام جميع الأجسام المضادة والفلوروفورية، انتقل إلى الفرع 2-11.
  11. DAPI التطبيق والتركيب
    1. بعد آخر جولة تلطيخ في متعددة، وإزالة آخر تطبيق الأجسام المضادة مع مستضد استرداد الحل pH 613. اغسل بالماء منزوع الأيونات متبوعاً بـ TBST لمدة دقيقتين لكل13دقيقة.
    2. تطبيق ما يقرب من 150 درجة مئوية من الحل DAPI العمل على الشرائحوالحضانة في غرفة مرطبة لمدة 10 دقيقة في RT 1.
    3. يغسل مع TBST لمدة 30 s تقريبا وجبل الأغطية مع جبل antifade. تطبيق طلاء الأظافر واضحة في الزوايا الأربعة من غطاء بمجرد أن جفت وسائل الإعلام المتصاعدة لتأمين غطاء (اختياري).

3. تفاصيل المكتبة، monoplexes، ومتعددة

  1. اختر الشرائح لبناء مكتبة فلوروفور.
    1. ل7 ألوان متعددة جمع 7 خلايا المناعة الشرائح الأنسجة الغنية (أي اللوزتين والطحال، الخ) للمكتبة.
      ملاحظة: اختر شرائح التحكم لاستخدامها في مكتبة فلوروفور مع كل شريحة تمثل كل فلوروفور فريدة من نوعها التي سيتم استخدامها في المضاعف. يجب أن يكون للشرائح التحكم epitope وفيرة من الاختيار، ويمكن أن يكون نفس النوع من الأنسجة لكل فلوروفور.
  2. شرائح مكتبة وصمة عار والصور للاستخدام مع monoplexes ومتعددة.
    1. اتبع الخطوتين 2.1-2.9.1 باستخدام شرائح التحكم والتحكم في شرائح الأنسجة المفضلة. وضع فلوروفور مختلف على كل شريحة بتركيز 1:100؛ يجب أن تحتوي شريحة واحدة على DAPI فقط.
    2. انتقل إلى القسم 2.11 باستثناء حذف تلطيخ DAPI وبدلاً من ذلك استخدام TBST وجبل كما هو موضح.
    3. بعد السماح الشرائح الجافة بين عشية وضحاها، صورة مع جميع القنوات DAPI، CY3، CY5، CY7، تكساس الأحمر، شبه الموصلات نقاط الكم، وfluorescein isothiocyanate (FITC) وضع التعرض ل 250 مللي ثانية مع ميزة حماية التشبع1.
      ملاحظة: يمكن تعيين أوقات التعرض عند 50−250 مللي ثانية13.
    4. تحميل صور المكتبة على البرنامج واستخدامها في تحليل monoplexes ومتعددة.
  3. اختر الشرائح للحيرات الأحادية.
    1. اختر شرائح التحكم التي تحتوي على epitope وفيرة من الاختيار على أساس الأجسام المضادة الأمثل (القسم 1). لكل جولة من تلطيخ ليتم القيام به في متعددة، حدد هذا العدد من الشرائح عنصر التحكم لإنشاء monoplexes.
      ملاحظة: الغرض من monoplex تحديد أفضل موضع (ترتيب) لكل جسم مضاد ليتم استخدامها في المضاعف.
  4. اللولب اللولب.
    1. اتبع الأقسام 2.1-2.11 باستخدام الأجسام المضادة الأساسية بترتيب مختلف (موضع) لكل شريحة من الشرائح. يجب أن يكون لكل شريحة جسم مضاد أساسي واحد فقط يتم تطبيقه بترتيب (موضع) مختلف عن الشرائح الأخرى.
      ملاحظة: لكل شريحة حيث تدعو الجولة إلى عدم وجود جسم مضاد أو فلوروفور أساسي، بدلاً من ذلك استخدام مخفف الأجسام المضادة الأولية ومخفف الفلوروفوري13.
  5. شرائح الصورة وتحليل monoplex.
    1. باستخدام المجهر وتعيين وقت التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات التقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
      ملاحظة: يمكن تعيين أوقات التعرض عند 50−250 مللي ثانية14.
    2. باستخدام برنامج التحليل تقييم كل شريحة monoplex من خلال النظر في كثافة الفلورسنت من علامة ملطخة.
    3. قارن هذه الكثافة بالخلفية. إذا كان أعلى 5-10 مرات على الأقل من الخلفية، فإن موضع تلك الشريحة هو الموضع الأمثل للاستخدام في المضاعف النهائي.
  6. اختر الشرائح للمضاعف.
    1. اختر شرائح الاهتمام وأضف شريحة إضافية لاستخدامها كشريحة فارغة للطرح من الفلورة الذاتية بعد تلطيخ والتصوير.
  7. وصمة عار متعددة.
    1. استناداً إلى نتائج monoplex، اختر الترتيب المناسب (المواضع) لكل جسم مضاد استناداً إلى الخطوة 3.5.3. تعيين كل فلوروفور إلى جسم مضاد.
      ملاحظة: قد يحتاج هذا إلى تحسين; ومع ذلك، خطة لاستخدام الأجسام المضادةمشرق لعلامات أقل وفرة 1، وينبغي أن تتطابق مع الأجسام المضادة المشاركة في توطين مع الفلوروفور في طيف بعيد من بعضها البعض13،وفلوروفورس مع الطيف 540 و 570 لا ينبغي أن تكون مترجمة مشتركة بسبب إلى قضايا التداخل الطيفي1.
    2. المضي قدما في الأقسام 2.1-2.11 ضمان الشريحة فارغة لا تتلقى الأجسام المضادة الأولية، فلوروفور، أو DAPI، بدلا من ذلك استخدام مخفف الأجسام المضادة، وثنائي الفلوروفوري، وTBST على التوالي بدلا من ذلك.
  8. تعدد الصور وتحليلها من أجل سلامة تلطيخ
    1. باستخدام المجهر وتحديد وقت التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات، والتقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
    2. باستخدام برنامج التحليل(جدول المواد)، وتقييم كل مضاعفات من قبل لون كاذبالفلورسنت.
      ملاحظة: صورة واضحة يجب أن توضح كل علامة بوضوح. إذا كانت العلامة تبدو منتشرة ومحببة أو غير موجودة، فمن المحتمل أن العلامة لم تنجح وتحتاج إلى إعادة تحسينها.
    3. باستخدام برنامج التحليل، قم بتقييم كل مضاعفات عن طريق عرض علم الأمراض. سوف عرض علم الأمراض تأكيد خصوصية كل علامة. مقارنة مع IHC الأمثل سابقا (القسم 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العملية الشاملة للحصول على اختبار متعدد الألوان 7 ألوان يتبع نمط متكرر. يصف الشكل 1 العملية في شكل رسم تخطيطي. مرة واحدة يتم قطع الشرائح وتجفيفها أو وردت من المختبر وخبز في فرن التهجين في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم المضي قدما في إزالة البارافينية والإماهة، وإصلاح الشرائح في formalin مرة أخرى تليها استرداد مستضد. تبدأ كل جولة من تعدد الإرسال في استرجاع المستضد وتنتهي عند إزالة الأجسام المضادة (الشكل1).

إن تحسين كل خطوة في العملية أمر بالغ الأهمية لتحقيق صورة واضحة وقابلة للاستخدام. يجب اختبار الأجسام المضادة من قبل IHC أولاً باستخدام المخازن المؤقتة استرداد مستضد مع درجة الحموضة 6 و درجة الحموضة 9 لكل الأجسام المضادة لتصور الذي مستضد استرجاع العازلة يعمل بشكل أفضل مع هذا الجسم المضاد معينة. بشكل عام، تستجيب الأهداف النووية لاسترجاع المستضد مع الرقم الهيدروجيني 9 العازل. على سبيل المثال، FOXP3 يعمل بشكل أفضل عند استخدام المخزن المؤقت استرداد مستضد من رقم الهيدروجيني 9 بدلاً من CD3 الذي يعمل بشكل أفضل مع المخزن المؤقت استرداد مستضد من الـ pH 6. يجب استخدام الصور المأخوذة من عملية IHC للتحقق من خصوصية تحليل المضاعف.

أحادية البليكس ضروري لتحديد ترتيب كل جسم مضاد في المضاعف. عند استخدام مجموعة أدوات 4 أو 7 ألوان، سيكون لكل جسم مضاد ترتيب مفضل في الصفيف. بالنسبة لعدد الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها، قم بجمع شرائح التحكم المناسبة (أي للمضاعف 7 ألوان حيث يكون لون واحد هو DAPI، حدد 6 شرائح تحكم تمثيلية محددة للأنسجة لـ 6 فلوروفورس أخرى). الشكل 2 A-C هو تمثيل تخطيطي لدراسة أحادية اللمعباستخدام 3 شرائح مع أنسجة سرطان القولون FFPE. كل شريحة FOXP3 في موقف مختلف في مجموعة باستخدام fluorophore 570 كعلامتها. يستخدم DAPI كوصمة عار مضادة لتصور النوى بشكل كاف. في الشكل 3، يتم عرض الصور التمثيلية لأحادي ة ومتعددة مع موضع FOXP3 متفاوتة. في الشكل 3A، B حيث FOXP3 هو في المركز الثالث (المقابلة للترتيب المبين في الشكل 2C)،وينظر تلطيخ محددة وقوية من FOXP3 (الأحمر) كما يتضح من البقع النووية مشرق الشكل 3A والتوطين المشترك مع CD3 الشكل 3B. كثافة إشارة الفلوروفور يؤكد خصوصية FOXP3 دون تلطيخ غير محدد في مكان آخر في الأنسجة الشكل 3A. في الشكل 3C، حيث FOXP3 هو في المركز الأول (المقابلة للترتيب في الشكل 2A)، وهناك تلطيخ غير محددة من FOXP3. المناطق المنتشرة محبب من الغطاء الأحمر معظم الشريحة وشدة الفلورسنت في هذه المناطق هي أقل من 1. محاولة القيام متعددة دون إكمال monoplex أولا لاختبار ترتيب النتائج تلطيخ في نتيجة مماثلة، وسوف تضيع الكواشف. خطوة هامة أخرى لا يمكن تجاهلها في عملية تعدد المضاعفات هو تلطيخ DAPI. ووصمة مضادة DAPI العاملة هي الأساس لتحديد الخلايا والمزيد من التحليل المكاني باستخدام برنامج التحليل. ويمكن رؤية تباين هام في الصورة المركبة مع DAPI العمل (الأزرق) في الشكل 3E وفي DAPI غير العاملة في الشكل 3F. لم تتمكن الصورة الواردة في الشكل 3F من استخدامها لتحديد الخلايا في برنامج التحليل. محاولة لإنقاذ متعددة وتحليل الأنسجة، وغطاء ربما إزالتها عن طريق نقع الشريحة في TBST تليها خطوة microwaving في المخزن المؤقت استرداد مستضد درجة الحموضة 6 مع تطبيق إضافي من DAPI.

بمجرد الانتهاء من الفحص أحادي ة وأكد النظام الأجسام المضادة الأمثل، يمكن بناء استراتيجية متعددة الشكل4. لكل هدف يجب اختيار فلوروفور مختلفة. ويمثل الرقم المرتبط بكل فلوروفور تقريبا الطول الموجي الفلورسنت الطيفي المنبعث بعد الإثارة، على غرار قياس التدفق. وينبغي توخي الحذر عند مطابقة الأجسام المضادة المقترحة مع الفلوروفوريس للحد من التداخل الطيفي والنزيف المحتمل للعلامات. استراتيجية جيدة هي اختيار الأطوال الموجية بعيدا عن بعضها البعض للمشاركة في توطين الأجسام المضادة للحد من التداخل الطيفي الزائد توفير صورة واضحة وأكثر موثوقية فينولت13. على سبيل المثال، في استراتيجيةتعدد المضاعفات المعروضة (الشكل 4)، يقترن CD8 بـ الفلوروفور 570 بينما يقترن CD3 بـ الفلوروفور 520. وينبغي للمرء أن يتجنب استخدام الفلوروفور 540 و570 في الأهداف المشتركة حيث أن هذه الأهداف تميل إلى أن تكون أكثر الأهداف غير التمييزية ويمكن أن تعوق النتائج. فلوروفور 620 يميل إلى أن تكون مشرقة جداوينبغي أن تستخدم للأجسام المضادة التي ليست وفيرة في الأنسجة. كما تساعد مكتبة حديثة تستخدم كمرجع لكل فلوروفور في الحد من التداخل الطيفي للفلوروفوري. الشريحة الفارغة التي تخضع لجميع جولات استرداد مستضد ضروري لضمان استخراج الفلورة الذاتية من الصورة المركبة. هذه الشريحة الفارغة سوف تخضع لنفس المعاملة مثل الشرائح متعددة إلا بدلا من الأجسام المضادة الأولية العاملة والفلوروفور، وسوف تستخدم مخفف الأجسام المضادة وثنائي فلوروفور على التوالي الشكل 4B.

لضمان تصميم multiplex عملت بشكل صحيح وعلامات ينظر في صورة مركبمحددة، واستخدام "صورة علم الأمراض" في تركيبة مع خيار الإعداد "brightfield" باستخدام برنامج المجهر الذي يخلق صورة IHC فو التي يمكن أن تكون بعد ذلك مقارنة بالاختبارات السابقة التي تمت مناقشتها في القسم 1. لسوء الحظ، قد لا تعكس الصور المركبة الجميلة بالضرورة وصمة عار دقيقة، وهذه خطوة هامة لمراقبة الجودة في العملية ومنع النتائج الإيجابية الكاذبة. ويبين الشكل 5 ألف صورة مركبة دون قلق أولي. يتم تصور CD3 ويظهر تلطيخ محددة (الأخضر) وأكد من قبل علم الأمراض صورة brightfield في الشكل 5B. وينظر CD163 (البرتقالي) في الصورة المركبة (الشكل 5A) ؛ ومع ذلك، في تقييم علم الأمراض عرض brightfield من CD163 (الشكل5C)،والأجسام المضادة غير محددة. يظهر مثال على صورة متعددة الأمثل مع تلطيخ محددة في صورة مركبة (الشكل5D). يتم تأكيد خصوصية CD3 و CD163 باستخدام عرض علم الأمراض brightfield (الشكل5E والشكل 5F،على التوالي) ويقارن بشكل إيجابي إلى الاختبارات IHC السابقة التي أجريت باستخدام هذه الأجسام المضادة (لم تظهر).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل.
الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تطوير أحادي ة.
(أ) سرطان القولون الشريحة مع FOXP3 في الموقف 1. (B) سرطان القولون الشريحة مع FOXP3 في الموقف 2. (C) سرطان القولون الشريحة مع FOXP3 في الموقف 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النجاحات والمزالق من أحادية ومتعددة.
(A) فحص Monoplex من سرطان القولون الأولي مع FOXP3 في الموقف 3، تسمية كثافة الفلورسنت هو مبين. (B) فحص متعددة من سرطان القولون الأولي مع FOXP3 في الموقف 3 وCD3 في الموقف 2. (C) فحص Monoplex من سرطان القولون الأولي مع FOXP3 في الموقف 1، تسمية كثافة الفلورسنت هو مبين. (D) فحص متعددة من سرطان القولون الأولي مع FOXP3 في الموقف 1 وCD3 في الموقف 2. (E) فحص متعددة من سرطان القولون الأولي مع ترتيب الأجسام المضادة على النحو التالي: CD8 (الأصفر)، CD3 (الأخضر)، CD163 (البرتقالي)، pancytokeratin (أبيض)، PD-L1 (أرجواني)، FOXP3 (الأحمر)، DAPI العمل (الأزرق). (F) فحص متعددة من سرطان القولون الأولي مع ترتيب الأجسام المضادة على النحو التالي: CD8 (الأصفر)، CD3 (الأخضر)، CD163 (البرتقالي)، pancytokeratin (أبيض)، PD-L1 (أرجواني)، FOXP3 (الأحمر)، DAPI غير العاملة (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تطوير تعدد المضاعفات.
(أ) شريحة متعددة من سرطان القولون في متعددة الألوان 7. (B) شريحة فارغة في متعددة 7 ألوان باستخدام أنسجة سرطان القولون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل خصوصية تعدد الألوان 7.
(أ) صورة مركبة متعددة مع الأجسام المضادة على النحو التالي: CD8 (أصفر)، CD3 (أخضر)، CD163 (برتقالي)، بينسيتوكيراتين (أبيض)، Ki67 (أحمر)، DAPI (أزرق). (B) علم الأمراض عرض برايتفيلد من الصورة في لوحة A على CD3 عرض فقط. (C) علم الأمراض عرض برايتفيلد من الصورة في لوحة A على CD163 عرض فقط. (D) صورة مركبة متعددة مع الأجسام المضادة على النحو التالي: CD8 (أصفر)، CD3 (الأخضر)، CD163 (البرتقالي)، pancytokeratin (أبيض)، PD-L1 (أرجواني)، FOXP3 (الأحمر)، DAPI (الأزرق). (E) علم الأمراض عرض brightfield من الصورة في لوحة D على CD3 عرض فقط. (F) علم الأمراض عرض برايتفيلد من الصورة في لوحة D على CD163 عرض فقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا تزال عينات الأنسجة السليمة من خزعة الورم الصلبة واستئصال الجراحة أدوات تشخيصية وتنبؤية هامة لتحليل المرض وكذلك تشخيص المريض. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) هو تقنية جديدة تجمع بين فوائد الكيمياء المناعية (IHC)، الفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي. وقد سمحت الأساليب السابقة للتحقيق في الخلايا في الموقع لتقييم ترتيبات الخلية إلى الخلية في بيئة الأنسجة8، ومع ذلك ، فإن انخفاض عدد الepitopes التي يمكن فحصها يحد من التحليل المعقد. تدفق قياس الخلايا، على الرغم من أن مفيدة في تحليل العديد من أنواع الخلايا فيعينة، يفقد السياق المكاني بحكم إعداد عينات كتعليق خلية واحدة 9،10. تقوم mfIHC بسد هذه التقنيات من خلال الاحتفاظ بالسياق المكاني للبيئة الدقيقة الخلوية وزيادة عدد الepitopes التي يمكن تسميتها أثناء تضخيم الإشارة لكل epitope11. وقد استخدمت البحوث السابقة mfIHC لفينولت التسلل الخلويفي السرطان وغير السرطان عينات الأنسجة 1،15. كما تم استخدام تحليل ما بعد الصورة لتحليل العلاقات المكانيةللخلايا والهياكل داخل الأنسجة الدقيقة 1،4. وللحصول على تحليل موثوق به، يجب أولاً إنتاج صورة محددة ودقيقة. تقنية تلطيخ اليدوي، بدلا من نظام تلطيخ الآلي، تمكن مختبرات أصغر وواعية من حيث التكلفة الوصول إلى هذه التكنولوجيا. وقت التحسين والوقت تلطيخ هي من بين أكبر العقبات التي تحول دون تحقيق صورة موثوقة لمزيد من التحليل المكاني.

العديد من القواعد العامة تعزز احتمال نجاح توليد صورة متعددة مركبة موثوق بها وسوف توفر الوقت والموارد. وينبغي اختيار الأجسام المضادة لاستخدامها في متعددة على أساس النجاح مع IHC التقليدية اليدوية. يجب استخدام المخازن المؤقتة استرداد مستضد مع درجة الحموضة 6 و pH 9 لIHC من أجل التحقيق في استرداد مستضد المناسبة للاستخدام في متعددة. تطوير Monoplex ضروري لتحديد موضع الأجسام المضادة ضمن بروتوكول تعدد الإرسال. والأساس المنطقي لذلك معقد ويختلف بين عينات الأنسجة والتصاميم. في بعض الحالات، يمكن أن تتحلل الظهارة مع خطوات microwaving متعددة ويتم فقدان التصور علامة، كما هو الحال في كثير من الأحيان مع CD3. FOXP3، ومع ذلك، يصبح أكثر إشراقا مع خطوات أكثر microwaving وبالكاد مرئية إذا وضعت في الجولة الأولى أو الثانية من متعددة13،14.

تبدأ عملية تلطيخ مع قطع الأنسجة FFPE على الشرائح المشحونة. المشكلة الأولى التي قد تواجه هي الأنسجة تسقط من الشريحة بعد microwaving. عندما لا يتم استخدام الشرائح المشحونة، فإن التزام الأنسجة بالسطح الزجاجي محدود وسيكون للأنسجة إما قابلة للطي بشكل مفرط أو قد تنزلق بالكامل. لمزيد من التأكد من أن الأنسجة تلتزم الشرائح أثناء عملية تلطيخ، يتم تنفيذ العديد من التقنيات. أولا في حين قطع كتل على الشرائح، أنقى شكل من أشكال المياه يعمل بشكل أفضل. بالنسبة لبعض المختبرات، قد تكون المياه منزوعة الأيونات كافية ولكن المياه المقطر عملت بشكل أفضل. وينبغي تجفيف الشرائح شقة مباشرة بعد قطع في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لضمان الالتزام، يتم وضع الشرائح بعد ذلك في فرن التهجين وخبز الكذب شقة في 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة فقط قبل الاستخدام. على الرغم من أن التثبيت الرسمي قد حدث بالفعل خلال عملية إعداد الأنسجة الأولية، ووضع الشرائح في رسمي محايد المخزنة مؤقتا لمدة 30 دقيقة بعد عملية إزالة البارافين والإماهة يعزز السلامة الهيكلية للشنت الأنسجة1،13.

يمكن أن تستغرق عملية تلطيخ يدوي ما يصل إلى ثلاثة، 8 ساعات أيام اعتمادا على عدد الأجسام المضادة المستخدمة. تجنب المزالق أمر ضروري في توفير الوقت وتوفير الكواشف. يحدث الخطأ الشائع الأول في كثير من الأحيان في إعداد الكاشف. المياه تختلف بين المختبرات ويمكن أن يكون الفرق الوحيد في النتائج من مختبر واحد إلى آخر. استخدام نفس وكذلك مصدر المياه النظيفة لجميع ردود الفعل والكواشف يضمن نتيجة متسقة. الأجسام المضادة، وسد الحل، والفلوروفوريس تعمل بشكل أفضل في درجة حرارة الغرفة. لتجنب المزالق في الكاشف والعمل إعداد الحل، واستخدام نفس الماء لجميع الكواشف. أيضا استخدام جميع حلول العمل والكواشف في درجة حرارة الغرفة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها من mfIHC مهم والالتزام بالمبادئ التوجيهية المختبرية الصارمة حاسمة للحد من تلوث المكونات و / أو خطأ المشغل. إنتاج الصور دون المستوى الأمثل سوف انحراف النتائج ويؤدي إلى مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية كاذبة التي يمكن أن تؤثر سلبا على البيانات. نظرًا لأن التحليل النهائي يتضمن عادةً الأنماط الظاهرية التي تم إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر استنادًا إلى التعلم الآلي، يمكن تضخيم الأخطاء الصغيرة في تلطيخ التلطيخ للتأثير على مجموعة البيانات بأكملها. على سبيل المثال، على الرغم من أن جميع البقع قد تعمل بشكل مثالي، فإن خطأ أو إغفال DAPI سيمنع تجزئة الخلايا في المستقبل والعد مما يجعل التجربة عديمة الفائدة. يستخدم برنامج التحليل تلطيخ DAPI ليس فقط لتحديد الخلايا ولكن يعين إحداثيات س وy لكل خلية وإذا كان المضاعف خافت، أو مقيد بشكل سيئ، أو منتشر DAPI تلطيخ، لا يمكن استخدام الصورة بشكل أكبر ويجب إعادة برمجة المعلومات أو محاولة إنقاذ وإعادة تلطيخ DAPI. استخدام مكونات البرمجيات مثل علم الأمراض ووجهات النظر brightfield سوف تعزز الثقة في الحساسية والخصوصية في وقت مبكر من عملية التحسين ومنع الأخطاء في وقت مبكر من عملية تعدد.

يمكن أن تساعد جوانب تعديل عملية التصوير أيضًا في تحسين الصورة. على سبيل المثال، يساعد التقاط صورة باستخدام DAPI كمساعدة مرئية للتركيز على تجنب الصور الضبابية. إضافة مكتبة فلوروفور المصنوعة حديثا إلى البرنامج سوف تضمن صورة نظيفة وتداخل أقل الطيفية من كل فلوروفور خلال مرحلة التحليل واستخدام الشريحة الفارغة لاستخراج autofluorescence يكثف علامات ويعزز الصورة نوعيه.

استخدام عينات الأنسجة وقد وستظل كأداة أساسية في التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض. وقد زادت التكنولوجيا الناشئة من فهمنا للتفاعلات من خلية إلى خلية وMFIHC هو لاعب جديد واعد. التحسين والدقة أثناء عملية تلطيخ في هذه التقنية أمر بالغ الأهمية للاستخدام السليم ومزيد من التحليل للتفاعلات من خلية إلى خلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا إد ستاك، الذي كان سابقاً من بيركين إلمر، على مساعدته في إعداد وتحسين تلطيخ المضاعفات الأصلية. كما يود المؤلفون أن يشكروا كريستين شميت من أكويا للعلوم الحيوية على نصائحها باستخدام برنامج التحليل. البحوث التي وردت في هذا المنشور بدعم من المعاهد الوطنية للسرطان والصحة تحت جائزة رقم P30CA046592، K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم صندوقي جيفري أ. كولبي لسرطان القولون وتوم ليو التذكاري دعما إضافيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3, (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
  3. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  4. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
  5. Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
  6. Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200, (1), 347-354 (2018).
  7. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
  9. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37, (2), 163-176 (2017).
  10. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, (6), 601-616 (2010).
  11. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  12. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97, (7), 873-885 (2017).
  13. Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. 32 (2016).
  14. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. Perkin Elmer Manual. (2014).
  15. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130, (22), 2420-2430 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics