手动复用荧光免疫学的优化、设计和避免陷阱

Cancer Research

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Summary

多路荧光免疫组织化学是一项新兴技术,能够可视化完整形式固定的石蜡嵌入(FFPE)组织内的多种细胞类型。介绍了确保成功7色多路复用的指南,其中包含优化抗体和试剂、准备幻灯片、设计和避免常见问题的技巧的说明。

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

对完整组织进行微环境评估,用于分析细胞渗透和空间组织,对于了解疾病过程的复杂性至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光 (IF),这些技术能够使用 1 到 4 个标记将细胞可视化为快照。这两种技术都有缺点,包括难以染色不良的抗原靶点和与跨物种反应相关的局限性。IHC 是可靠和可重现的,但化学性质和对可见光光谱的依赖只允许使用几个标记,使共同本地化具有挑战性。使用IF拓宽了潜在的标记,但通常依赖于冷冻组织,由于形式固定后广泛的组织自荧光。流式细胞学,一种能够同时标记多个表位的技术,可消除IF和IHC的许多缺陷,然而,需要将细胞作为单个细胞悬浮液检查,从而失去了放弃重要生物的细胞的空间环境关系。多路复用荧光免疫组织化学 (mfIHC) 桥接这些技术,允许在形式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织中进行多表细胞表型,同时保留整体微环境架构和空间完整未破坏组织内细胞的关系。高荧光强度荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光 , 共价结合组织表位 , 使初级抗体的多种应用 , 而不必担心二次抗体的物种特异叉反应。尽管该技术已被证明能够产生可靠和准确的疾病研究图像,但由于广泛的优化和设计,创建有用的 mfIHC 染色策略的过程可能非常耗时且耗时。为了制作能够准确定位的细胞交互的可靠图像,并减轻手动分析的优化周期,这里介绍了用于幻灯片准备、优化抗体、多路复用设计以及错误的方法在染色过程中经常遇到。

Introduction

完整的肿瘤微环境(TME)的可视化对于评估固体恶性肿瘤中的细胞渗透以及细胞与细胞的相互作用至关重要。多路荧光免疫组织化学(mfIHC)已成为研究癌症和相关疾病1、2、3、4, 5,6,7.这与设计用于分析大型数据集的新型软件和程序相结合,能够观察单元1、2、4之间的复杂相互作用。数据采集中的速率限制因子通常是分析前染色组织的质量。

以前用于 TME 中表型细胞的技术包括免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF) 和流式细胞学,所有这些都存在重大限制。IHC使用形式固定石蜡嵌入(FFPE)组织部分,在被最常见的一种抗体染色之前,这些组织部分是去蜡化和再水化的。使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合二级抗体和化学反应允许可视化单个抗原表位8。虽然IHC是可靠的,并在FFPE组织上执行,这是容易使用,对可见光光谱的限制意味着只有一个或两个标记可以可靠地区分和共定位抗原相当困难8。扩展可用标记物,因此可在单个部分探测抗原的一种方法是更改为荧光,从而允许使用更广泛的视觉光谱。对于IF,冷冻或FFPE组织被转移到幻灯片上,并结合各种荧光团使用的抗体。虽然这会增加可以探测的抗原的数量,但有几个重要的局限性。首先,由于每个抗体通常只有一个荧光团,亮度通常不足以克服组织自荧光。正因如此,大多数IF是在冷冻组织上执行的,这种组织储存成本高昂,难以使用。由于光谱重叠和跨物种反应,可以使用数量有限的荧光标记,特别是在使用非结合抗体时。流动细胞学,包括新鲜组织加工成单个细胞悬浮液和荧光抗体标签,是免疫吸血功能的几十年9,10的黄金标准。流式细胞学的一个好处是能够标记多个抗体,而不必担心物种交叉反应,因为大多数是结合的。因为细胞是由机器而不是人眼"可视化"的,因此有更多的荧光道可用,但这样做是有代价的。补偿必须手动进行,这能显著改变产生假阳性和阴性群体的结果。流动细胞学的最大限制是组织架构和随后的所有空间信息因单细胞悬浮的必要性而丢失。

使用自动荧光显微镜与新型软件相结合的多路荧光免疫组织化学 (mfIHC) 结合了 IHC、IF 和流式细胞学的优点,允许多抗原组织染色,并实现信号扩增和无需补偿即可保留空间关系。FFPE组织被放置在带电的幻灯片上,在抗原检索后,对目标抗原进行一轮初级抗体应用,然后使用具有HRP化学标记的次级抗体,类似于IHC。放置二级抗体后,HRP特异性反应导致荧光团与兴趣表位11共价结合。一旦组织被标记,另一轮加热幻灯片完成删除先前应用的初级和二级抗体复合物只留下荧光标记绑定到组织表位11。这允许任何物种的多种抗体重新应用,而不必担心交叉反应11,12。为了尽量减少对多种荧光染料的人工补偿的需要,使用一组光谱重叠小(包括核计数器染色)的荧光光道来完成 mfIHC。为了考虑 FFPE 组织遇到的自荧光,软件使用空白幻灯片中的图像从最终图像中减去自荧光,这可能是由于荧光后抗原特异性荧光的强度信号放大。使用专为大型数据集设计的新型程序,可以识别和分析空间上下文1、2、4 的单元位置。该技术最大的限制是优化时间。此处提供了包含实验设计和染色和成像策略说明的详细方法。mfIHC 将可用于目前尚未优化的自动染色系统的实验室,该系统希望使用手动技术更好地了解完整 FFPE 组织中细胞与细胞间相互作用的空间环境。

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Protocol

所有工作都已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。

1. 优化初级抗体和滑动制备

  1. 使用常规 IHC 确定多路复用抗体的理想浓度。
    1. 通过手动常规免疫组织化学(IHC)13测试多路复用抗体。
    2. 使用具有丰富细胞类型的特定组织,用于测试的每个抗体,例如使用扁桃体组织进行CD3抗体测试。
    3. 使用公司推荐的IHC参考浓度,然后以推荐浓度的抗体浓度完成IHC,以及高于和低于推荐浓度的浓度。
  2. 在幻灯片上准备正式固定石蜡嵌入组织。
    1. 使用微体,在厚度在4至6μm之间切割FFPE组织块,并应用于带电的幻灯片。
      注:使用蒸馏水可确保在整个多路复用过程中正确安装和粘附。
    2. 将幻灯片平放,组织侧朝上,并在 37°C 下过夜干燥。
    3. 将幻灯片存放在远离极端温度的幻灯片盒中,直到准备好完成多路复用。

2. 一般染色方法

  1. 洗涤和抗原检索溶液的制备
    1. 通过混合9 L的去离子水、1 L的三分缓冲盐水(TBS)和10 mL的聚山梨酸20,制备0.1%TBST的洗涤溶液。
    2. 准备两种抗原检索溶液(pH 6和pH9;材料表)用去离子水稀释到1倍。
  2. 脱蜡和补液
    1. 在杂交炉1中,在60°C下烘烤幻灯片,平放,组织侧向向上1小时。从烤箱中取出滑轨,冷却至少 5~10 分钟,然后放入垂直滑动机架中。
    2. 按顺序处理以下溶液中的幻灯片:三联苯中的二甲苯,然后单次处理 100% 乙醇、95% 乙醇,最后使用幻灯片染色集1进行 70% 乙醇处理,每次 10 分钟。
    3. 将去离子水浸入塑料滑动盒中,然后浸入装有中性缓冲形式塑料的滑动盒中,将水浸在30分钟13分钟,然后浸入塑料滑盒中,将滑架清洗2分钟。在去离子水中清洗幻灯片2分钟,然后继续抗原回收。
  3. 抗原检索
    1. 将滑片架放入一个耐热盒中,内部管(约 300 mL),使用 pH 6 或 pH 9 抗原检索缓冲液。
      注:抗原检索缓冲液可以是pH 6或pH 9,可能需要根据表位进行优化。然而,首先使用pH9来结合核表位的抗体和pH6的所有其他抗体。
    2. 用塑料包装盖住盒子,用橡皮筋固定。将盒子放入旋转板边缘的微波炉中(微波炉必须配备逆变器技术,以便均匀加热)。以 100% 的功率加热幻灯片 45 秒,然后以 20%的功率加热 15 分钟。
      注:微波处理可能需要根据所使用的微波进行优化。
    3. 让幻灯片冷却约 15-20 分钟。
  4. 在滑凉时准备抗体和荧光道的工作溶液。
    1. 通过将 0.5 克牛血清白蛋白颗粒溶解成 50 mL 的 TBST,制备原抗体稀释剂。或者,使用50 mL的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解颗粒。
    2. 使每个初级抗体的溶液工作到第 1 节中确定的优化浓度,即初级抗体稀释剂中。估计每张幻灯片约 200 μL。
    3. 在浓度为1:100的荧光稀释剂中稀释每个荧光酸溶液,制备荧光酸液。
      注:这可能需要根据抗体进行优化。估计每张幻灯片约 100 μL。
    4. 在染色的最后一天,通过在TBST的1mL中加入3滴DAPI,制备4+,6-二酰胺-2-苯胺醇(DAPI)工作溶液。
  5. 滑动染色(洗涤和堵塞)
    1. 冷却后从微波炉中取出盒子,取下塑料包装,用去离子水清洗幻灯片2分钟,然后用填充TBST13的塑料滑动盒洗2分钟。
    2. 干燥后,每个幻灯片周围的组织用微妙的任务擦拭小心不要让组织干燥,跟踪周围的组织使用疏水屏障笔。请勿用细腻的任务擦拭或笔触摸组织。
    3. 将每张幻灯片放入加湿室,并在组织中加入阻滞溶液(约 4 滴)。在室温 (RT) 下孵育 10 分钟。
  6. 滑动染色(初级抗体应用)
    1. 抓住每张幻灯片,通过点击纸巾上的幻灯片侧面,并使用精细的任务擦除去除组织周围的多余阻滞剂,取出阻滞溶液。
    2. 将滑轨放回加湿室,并添加约 200 μL 的工作原抗体。在 RT 处在加湿室中孵育 1 小时。
    3. 用TBST洗涤2分钟,在三重体13中浸没。
      注:每次洗涤步骤后,更改 TBST 将有助于确保图像更干净。
  7. 滑动染色(二次抗体应用)
    1. 从每张幻灯片上清除剩余的TBST,并涂抹大约3至4滴的二次抗体(兔子和小鼠二次HRP结合抗体的混合物)。在RT13的加湿室中孵育10分钟。
      注:如果计划使用需要小鼠或兔子以外的二级抗体的初级抗体,或选择使用替代二级抗体,则对幻灯片应用适当的HRP共聚二次抗体,并在RT孵育45分钟。替代二级14可能需要孵育时间。
    2. 孵育后,用TBST在三联体13中洗涤2分钟。
  8. 滑动染色(荧光剂应用)
    1. 应用约100μL的荧光酸工作溶液,在RT的加湿室中孵育10分钟13。
    2. 用TBST洗涤2分钟,在三联体13。
  9. 抗体的去除
    1. 微波幻灯片(45 秒,100% 时,15 分钟,20%)在耐热盒(见步骤2.3.2)中去除抗体13,14。
      注:这将完成一轮多路复用。这是可以暂停协议的唯一点。要暂停协议,请让幻灯片在室温下在抗原检索缓冲液中过夜。
  10. 继续额外的污渍。对于抗体-荧光团的其余部分,重复步骤 2.5.1_2.9.1。一旦使用了所有抗体和荧光光道,继续执行第2.11节。
  11. DAPI 应用和安装
    1. 在多路复用中最后一轮染色后,用抗原检索溶液pH613去除最后一个抗体应用。用去离子水清洗,然后TBST每13分钟洗2分钟。
    2. 将大约 150 μL 的工作 DAPI 溶液涂抹到幻灯片上,并在加湿室中孵育 10 分钟,在 RT1
    3. 用 TBST 清洗约 30 s,并安装带防褪色安装器的盖玻片。安装介质干燥后,在盖玻片的四个角涂抹清晰的指甲油,以确保盖玻片(可选)。

3. 库、单体和多路复用的详细信息

  1. 选择用于构建荧光库的幻灯片。
    1. 对于 7 色多路复用收集 7 免疫细胞丰富的组织幻灯片 (即扁桃体, 脾脏等) 为库。
      注: 选择用于荧光库的控制幻灯片,每张幻灯片表示将在多路复用中使用的每个唯一荧光。控制幻灯片应具有丰富的表位选择,并且可以是每种荧光剂的相同类型的组织。
  2. 污点和图像库幻灯片,用于单体和多路复用。
    1. 使用所选择的控制幻灯片和控制组织幻灯片执行步骤 2.1_2.9.1。将不同的荧光酸放在每张幻灯片上,浓度为1:100;一张幻灯片应仅包含 DAPI。
    2. 继续第 2.11 节,除非省略 DAPI 染色,而是按照所述使用 TBST 和安装。
    3. 在让幻灯片在一夜之间干燥后,所有通道的影像 DAPI、CY3、CY5、CY7、得克萨斯红、半导体量子点和氟素等氰酸酯 (FITC) 设置曝光 250 ms,具有饱和保护功能1
      注:曝光时间可设置为50~250 ms13
    4. 将库图像上传到软件,用于分析单体和多路复用。
  3. 为单体选择幻灯片。
    1. 根据优化的抗体选择具有丰富表位的控制幻灯片(第 1 节)。对于在多路复用中要完成的每一轮染色,选择该数量的控制幻灯片以创建单体。
      注: 单体的目的是确定在多路复用中使用的每个抗体的最佳位置(顺序)。
  4. 染色单体。
    1. 按照第 2.1_2.11 节,对每个幻灯片使用不同的顺序(位置)使用主抗体。每张幻灯片应只应用一个主抗体,其顺序(位置)与其他幻灯片不同。
      注:对于每张圆形不需要原发抗体或荧光团的幻灯片,则使用原发抗体稀释剂和荧光稀释剂13。
  5. 图像幻灯片并分析单体。
    1. 使用显微镜,将曝光时间设置为 250 ms,所有通道利用 DAPI 捕捉每个图像进行聚焦。
      注:曝光时间可设置为50~250 ms14
    2. 使用分析软件通过查看染色标记的荧光强度来评估每个单体幻灯片。
    3. 将此强度与背景进行比较。如果该幻灯片至少比背景高 5-10 倍,则该幻灯片的位置是最终多路复用中的最佳位置。
  6. 选择多路复用的幻灯片。
    1. 选择感兴趣的幻灯片,并添加一张额外的幻灯片,用作染色和成像后自动荧光减法的空白幻灯片。
  7. 染色复用。
    1. 根据单体结果,根据步骤3.5.3为每个抗体选择适当的顺序(位置)。将每个荧光团分配给抗体。
      注意:这可能需要优化;然而,计划使用明亮的抗体对不太丰富的标记1,共定位抗体应匹配荧光道在遥远的光谱彼此13,和荧光540和570的荧光道不应该共同本地化,由于到光谱重叠问题1
    2. 继续第 2.1-2.11 节,确保空白滑块不会接收原抗体、荧光酸或 DAPI,而是分别使用抗体稀释剂、荧光稀释剂和 TBST 代替其。
  8. 图像多路复用和分析染色的完整性
    1. 使用显微镜并将所有通道的曝光时间设置为 250 毫秒,利用 DAPI 捕捉每个图像进行聚焦。
    2. 使用分析软件(材料表),用荧光假色评估每个多路复用。
      注:清晰的图像应清楚地显示每个标记。如果标记看起来漫反射和颗粒状或不存在,则标记可能不起作用,需要重新优化。
    3. 使用分析软件,通过病理学视图评估每个多路复用。病理学观点将确认每个标记的特异性。与先前优化的 IHC 相比(第 1 节)。

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Representative Results

获得 7 色多路测定的整个过程遵循重复模式。图 1以图表形式描述该过程。一旦幻灯片被切割和干燥,或从实验室收到,并在60°C的杂交炉中烘烤1小时,然后继续脱蜡和补液,修复幻灯片在形式再次,然后抗原检索。每一轮多路复用从抗原检索开始,在抗体去除时完成(图1)。

优化流程中的每个步骤对于实现清晰且可利用的图像至关重要。IHC 应首先使用具有 pH 6 和 pH 9 的抗原检索缓冲液对每种抗体进行测试,以直观地显示哪种抗原检索缓冲液对该特定抗体最有效。一般来说,核靶点对抗原检索有缓冲pH9。例如,FOXP3 在使用 pH 9 的抗原检索缓冲液时效果最佳,而 CD3 最适合 pH 6 的抗原检索缓冲液。从 IHC 过程获取的图像应用于验证多路分析的特异性。

需要单体来确定多路复用中每个抗体的顺序。当使用 4 色或 7 色试剂盒时,每个抗体在阵列中具有首选顺序。对于将使用的抗体数量,收集适当的控制幻灯片(即,对于一种颜色为 DAPI 的 7 色多路复用,为其他 6 种荧光光素选择 6 个组织特定代表性控制幻灯片)。图 2A-C是使用 3 张带 FFPE 结肠癌组织的幻灯片的单丛测定的示意图。每个幻灯片的 FOXP3 在阵列中具有不同的位置,使用荧光素 570 作为其标签。DAPI用作反染色,以充分可视化核。在图3中,显示了具有不同FOXP3位置的单体和多路复用的代表性图像。在图 3A、B中,FOXP3 位于第三位(对应于图 2C所示的顺序),FOXP3(红色)的具体和强健染色体现在明亮的核染色图 3A和共定位中与CD3图3B。荧光信号强度证实了FOXP3的特异性,在组织图3A的其他地方没有非特异性染色。在图3C中,FOXP3位于第一位置(对应于图2A中的顺序),FOXP3存在非特异性染色。红色颗粒扩散区域覆盖了大部分滑动区域,这些区域的荧光强度小于 1。尝试在不首先完成单体的情况下执行多路复用,以测试染色的顺序,结果类似,并且会浪费试剂。在多路复用过程中,另一个不容忽视的关键步骤是 DAPI 染色。工作 DAPI 计数器是使用分析软件进行细胞识别和进一步空间分析的基础。在图 3E中工作 DAPI(蓝色)的复合图像和图 3F中的非工作 DAPI 中可以看到重要的对比。图 3F中的图像无法用于识别分析软件中的单元。试图挽救多路复用和组织分析,盖玻片可能通过浸泡在TBST中的幻灯片去除,随后在pH 6抗原检索缓冲液中加入微摆动步骤,并附加DAPI应用。

一旦单体测定完成,最佳抗体顺序得到确认,即可构建多路复用策略图4。对于每个目标,必须选择不同的荧光。与每个荧光剂相关的数字大致表示激发后发出的光谱荧光波长,类似于流式细胞学。当将建议的抗体与荧光量相匹配时,应小心谨慎,以限制光谱重叠和标记物的潜在出血。一个好的策略是选择彼此远离的波长,以共同本地化抗体,以减少多余的光谱重叠,提供清晰的图像和更可靠的表示型13。例如,在显示的多路复用策略(图4)中,CD8与荧光素570配对,CD3与荧光520配对。应避免在共定位靶中使用荧光540和570,因为这些指标往往是最不区分的,并可能损害结果。荧光620往往非常明亮,应该用于组织中不丰富的抗体。最近用作每种荧光光的参考库也有助于减少荧光道的光谱重叠。需要一张经过所有轮抗原检索的空白幻灯片,以确保从合成图像中提取自荧光。这种空白幻灯片将经历与多路滑道相同的处理,除了代替工作原抗体和荧光剂外,抗体稀释剂和荧光稀释剂将分别使用图4B。

为了确保多路复用设计正常工作,并且合成图像中看到的标记是具体的,请使用"病理图像"与"亮场"设置选项结合使用显微镜软件,创建一个假 IHC 图像,然后可以与第 1 节中讨论的前 IHC 测定法相比。不幸的是,美丽的合成图像不一定能反映准确的污渍,这是质量控制过程和防止误报结果的重要一步。图 5A演示了一个复合图像,没有初始问题。CD3是可视化的,显示特定的染色(绿色),并在图5B中的病理明场图像中得到确认。CD163(橙色)在合成图像中可见(图5A);然而,在评价CD163的病理明场观点(图5C)时,抗体是非特异性的。合成图像(图5D)演示了具有特定染色的最佳多路复用图像示例(图5D)。CD3和CD163特异性使用病理明场视图(图5E图5F分别确认),与以前使用这些抗体进行的IHC检测相比(未显示)。

Figure 1
图 1:染色工作流图。
请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:单体开发。
(A) 结肠癌滑动与FOXP3在位置1。(B) 结肠癌滑动与FOXP3在位置2。(C) 结肠癌滑动与FOXP3在位置3。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:单体和多路复用的成功和陷阱。
(A) 在位置 3 处使用 FOXP3 对原发性结肠癌的单体测定,显示荧光强度标签。(B) 在位置 3 处使用 FOXP3 进行原发性结肠癌的多路测定,在位置 2 处进行 CD3。(C) 在位置 1 处使用 FOXP3 对原发性结肠癌的单体测定,显示荧光强度标签。(D) 在位置 1 处使用 FOXP3 进行原发性结肠癌的多路测定,在位置 2 处进行 CD3。(E) 原发性结肠癌的多路测定,抗体顺序如下:CD8(黄色)、CD3(绿色)、CD163(橙色)、泛细胞角蛋白(白色)、PD-L1(品红色)、FOXP3(红色)、工作DAPI(蓝色)。(F) 原发性结肠癌的多路测定,抗体顺序如下:CD8(黄色)、CD3(绿色)、CD163(橙色)、泛细胞角蛋白(白色)、PD-L1(品红色)、FOXP3(红色)、非工作DAPI(蓝色)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:多路复用开发。
(A) 7色多路复用结肠癌的多路滑。(B) 使用结肠癌组织在 7 色多路复用中的空白幻灯片。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:分析 7 色多路复用的特异性。
(A) 具有抗体的多路复用复合图像如下:CD8(黄色)、CD3(绿色)、CD163(橙色)、泛细胞角蛋白(白色)、Ki67(红色)、DAPI(蓝色)。(B) CD3面板A中图像的病理学明场视图。(C) CD163面板A中图像的病理学明场视图。(D) 具有抗体的多路复用复合图像如下:CD8(黄色)、CD3(绿色)、CD163(橙色)、泛细胞角蛋白(白色)、PD-L1(洋红色)、FOXP3(红色)、DAPI(蓝色)。(E) CD3面板D中图像的病理学明场视图。(F) CD163面板D中图像的病理学明场视图。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

固体肿瘤活检和手术切除的结块组织标本仍然是疾病分析和患者预后的重要诊断和预测工具。多路复用荧光免疫组织化学(mfIHC)是一种将免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和流式细胞学的优点相结合的新技术。以前在原位探测细胞的方法允许评估细胞与细胞在组织环境中的排列8,然而,可探测的表位数量少限制了复杂的分析。流式细胞测定,虽然在分析标本中的许多细胞类型时很有用,但由于将样品制备为单个细胞悬浮液9,10而失去空间环境。mfIHC通过保留细胞微环境的空间环境,增加可标记的表位数量,同时放大每个标记的表位11的信号来桥接这些技术。以前的研究已经使用mfIHC对细胞渗透在癌症和非癌症组织标本1,2,3,4,5,15的细胞。图像后分析还用于分析组织微环境1、2、4细胞和结构的空间关系。为了进行可靠的分析,必须首先生成具体而准确的图像。与自动化染色系统相比,手动染色技术使更小且注重成本的实验室能够使用该技术。优化时间和染色时间是实现可靠图像以进一步空间分析的最大障碍之一。

几个常规规则提高了成功生成可靠的复合多路复用映像的可能性,并将节省时间和资源。在多路复用中使用的抗体应根据手动常规 IHC 的成功选择。PH 6 和 pH 9 的抗原检索缓冲液应用于 IHC,以便研究在多路复用中使用的适当抗原检索。单体开发是必要的,以确定抗体在多路复用协议中的位置。其原理很复杂,在组织标本和表位之间也有所不同。在某些情况下,表位可能会随着多个微摆动步骤而退化,并且标记可视化会丢失,CD3 通常就是这种情况。FOXP3, 然而, 变得更加明亮与更多的微摆动步骤,并几乎看不到,如果放置在第一或第二轮的多路复用13,14

染色过程从 FFPE 组织切割到带电的幻灯片上开始。可能遇到的第一个问题是微摆动后从滑道上脱落的组织。不使用带电的幻灯片时,组织对玻璃表面的依从性有限,组织会过度折叠或可能完全滑落。为了进一步确保组织在染色过程中粘附在幻灯片上,执行了几种技术。首先,在将方块切割到滑梯上时,最纯净的水形式效果最好。对于一些实验室,去离子水可能就足够了,但蒸馏水效果最好。在37°C切割过夜后,应立即将滑片干燥平整。为了进一步确保粘附,将幻灯片放入杂交炉中,在使用前在 60°C 下平放一小时。虽然在初始组织制备过程中已经发生形式固定,但在脱蜡和补液过程后,将幻灯片置于中性缓冲形式中 30 分钟可增强安装物的结构完整性组织1,13.

手动染色过程可能需要长达小时的一天 , 具体取决于使用的抗体数量。避免陷阱对于节省时间和节约试剂至关重要。第一个常见错误通常发生在试剂制备中。水因实验室而异,在结果上可能是一个实验室对下一个实验室的单一差异。对所有反应和试剂使用相同和清洁的水源可确保一致的结果。抗体、阻断溶液和荧光道在室温下工作最全。为了避免试剂和工作溶液制备中的陷阱,对所有试剂使用相同的水。在室温下,也使用所有工作溶液和试剂。

mfIHC 的故障排除非常重要,并遵守严格的实验室准则,这对限制部件污染和/或操作员错误至关重要。制作次优图像会扭曲结果,导致假阳性和负数细胞群,从而对数据产生负面影响。由于最终分析通常包括基于机器学习的计算机生成的表型,因此染色中的小错误可能会放大以影响整个数据集。例如,虽然所有的污渍可能工作完美,但DAPI的错误或遗漏将阻止未来的细胞分割和计数使实验变得毫无用处。分析软件使用 DAPI 染色不仅用于识别细胞,还为每个单元分配 x 和 y 坐标,如果多路复用具有模糊、限制不良或漫反射的 DAPI 染色,则无法进一步使用图像,并且必须重新进行或尝试复用抢救和重新染色的DAPI。使用软件组件(如病理学和明场视图)将增强优化过程早期对灵敏度和特异性的信心,并在多路复用过程的早期防止错误。

成像过程的修改方面也有助于图像优化。例如,使用 DAPI 作为对焦的视觉辅助图像有助于避免图像模糊。将新制作的荧光库添加到软件中将确保在分析阶段每个荧光区的图像干净,光谱重叠更少,并使用空白幻灯片提取自荧光增强标记并增强图像质量。

使用组织标本已经并将继续作为研究疾病病理生理学的重要工具。新兴技术加深了我们对细胞对细胞交互的理解,mfIHC是一个有前途的新参与者。该技术在染色过程中的优化和准确性对于正确利用和进一步分析细胞与细胞之间的相互作用至关重要。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢EdStack,以前来自珀金埃尔默,他协助设置和优化原始多路复用染色。作者还希望感谢来自阿科亚生物科学的克里斯汀·施密特使用分析软件的提示。本出版物中报道的研究得到了国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592, K08CA201581(tlf),K08CA234222(js),R01CA15158807(mpm),RSG1417301CSM(mpm),R01CA19807403(mpm),U01CA22414501(mpm,hc),CA170568 (hc)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。杰弗瑞·科尔比结肠癌和汤姆·刘纪念研究基金提供了额外的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

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