Optimering, design og undgåelse af faldgruber i manuel multiplex fluorescerende immun histokemi

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Multiplex fluorescerende Immunhistokemi er en ny teknologi, der muliggør visualisering af flere celletyper inden for intakt formalin-fast, paraffinindlejret (FFPE) væv. Præsenteret er retningslinjer for at sikre en vellykket 7-farve multiplex med instruktioner til optimering af antistoffer og reagenser, forberede dias, design og tips til at undgå almindeligt problemer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikromiljø evaluering af intakt væv til analyse af celleinfiltration og rumlig organisation er afgørende for at forstå kompleksiteten af sygdomsprocesser. De tidligere anvendte teknikker omfatter immun histokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), som muliggør visualisering af celler som et øjebliksbillede i tid ved hjælp af mellem 1 og 4 markører. Begge teknikker har mangler, herunder problemer med farvning af dårligt antigene mål og begrænsninger i forbindelse med reaktivitet på tværs af arter. IHC er pålidelig og reproducerbar, men karakteren af kemi og afhængighed af det synlige lys spektrum giver mulighed for kun et par markører, der skal anvendes, og gør Co-lokalisering udfordrende. Brug af IF udvider potentielle markører, men er typisk afhængig af frosset væv på grund af den omfattende vævs autofluorescens efter formalin fiksering. Flow cytometry, en teknik, der muliggør samtidig mærkning af flere epitoper, ophæver mange af manglerne ved hvis og IHC, men behovet for at undersøge celler som en enkelt cellesuspension mister den rumlige sammenhæng af celler kassere vigtige biologiske Relationer. Multiplex fluorescerende Immunhistokemi (mfihc) broer disse teknologier giver mulighed for multi-epitope cellulære fænotypebestemmelse i formalin fast paraffinindlejret (FFPE) væv samtidig bevare den samlede mikromiljø arkitektur og rumlige forholdet mellem cellerne i intakt uforbrudt væv. Fluorophores med høj fluorescerende intensitet, der kovalent er bundet til vævs epitop, muliggør flere anvendelser af primære antistoffer uden at bekymre sig om artsspecifik kryds reaktivitet med sekundære antistoffer. Selv om denne teknologi har vist sig at producere pålidelige og præcise billeder til studiet af sygdom, processen med at skabe en nyttig mfIHC farvning strategi kan være tidskrævende og krævende på grund af omfattende optimering og design. For at gøre robuste billeder, der repræsenterer nøjagtige cellulære interaktioner in-situ og for at afbøde optimering periode for manuel analyse, præsenteret her er metoder til slide forberedelse, optimering af antistoffer, multiplex design samt fejl almindeligt forekommende under farvningsprocessen.

Introduction

Visualisering af en intakt tumor mikromiljø (TME) er afgørende for at evaluere ikke kun cellulære infiltration i solide maligniteter, men celle til celle interaktioner samt. Multiplex fluorescerende immun histokemi (mfihc) er dukket op som et effektivt værktøj til multi-antigen-fænotypning af celler i studiet af kræft og tilknyttede sygdomme1,2,3,4, 5,6,7. Dette, i kombination med nye software og programmer designet til at analysere store datasæt, muliggør observation af komplekse interaktioner mellem cellerne1,2,4. Den sats begrænsende faktor i dataopsamling er ofte kvaliteten af det farvede væv før analyse.

Tidligere anvendte teknikker til fænotype celler i TME omfatter Immunhistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) og flow cytometri, som alle har betydelige begrænsninger. IHC bruger formalin fast paraffinindlejret (FFPE) vævs sektioner, som er afparaffinerede og rehydreret, før de bliver plettet af oftest et antistof. Anvendelse af et peberrod-peroxidase (HRP)-bundet sekundært antistof og en kemisk reaktion giver mulighed for visualisering af en enkelt antigen epitop8. Mens IHC er pålidelig og udføres på FFPE væv, som er let at arbejde med, begrænsninger for det synlige lys spektrum betyder kun en eller to markører kan være pålidelig skelnes og samlokalisering af antigener ganske vanskeligt8. En måde at udvide tilgængelige markører og derfor antigener, der kan probed på en enkelt sektion er at skifte til fluorescens, som giver mulighed for brug af en bredere vifte af det visuelle spektrum. For hvis, frosne eller FFPE væv overføres på slides og antistoffer anvendes, der er konjugeret til forskellige fluorophorer. Mens dette øger antallet af antigener, der kan probed, der er flere vigtige begrænsninger. For det første fordi hvert antistof typisk kun har én fluoroforet vedhæftet, er lysstyrken ofte ikke stærk nok til at overvinde vævs autofluorescens. Det er af denne grund, de fleste hvis der udføres på frosset væv, som er dyrt at opbevare og svært at arbejde med. Et begrænset antal fluorescerende Tags er tilgængelige til brug på grund af spektral overlap og Cross Arts reaktivitet, især når ikke-konjugeret antistoffer anvendes. Flow cytometri, som består af frisk vævs behandling i en enkelt cellesuspension og mærkning med fluorescerende antistoffer har været guldstandarden for immunophenotyping i årtier9,10. En fordel ved flow cytometri er evnen til at mærke flere antistoffer uden bekymring for Arts krydsreaktivitet, da de fleste er konjugeret. Fordi cellerne er "visualiseret" af en maskine og ikke menneskelige øjne, der er langt flere fluorophores til rådighed, men dette kommer med en omkostning. Kompensationen skal ske manuelt, hvilket i væsentlig grad kan ændre resultater, der producerer falske positive og negative populationer. Den væsentligste begrænsning af strømnings cytometri er, at vævs arkitekturen og efterfølgende alle rumlige oplysninger går tabt ved nødvendigheden af enkeltceller suspension.

Multiplex fluorescerende Immunhistokemi (mfIHC) ved hjælp af et automatiseret fluorescerende mikroskop kombineret med ny software kombinerer fordelene ved IHC, hvis og flow cytometri ved at tillade multi-antigen vævs farvning med signal forstærkning og fastholdelse af rumlige relationer uden behov for kompensation. FFPE-væv anbringes på ladede lysbilleder, som efter antigen-udtagning gennemgår en runde af primær antistof applikation til målantigen, efterfulgt af et sekundært antistof med et HRP-kemikalie mærke, der ligner IHC. Efter placeringen af det sekundære antistof resulterer en HRP-specifik reaktion i en fluoroforet, der er kovalent bindende for epitop af interesse11. Når vævet er mærket, en anden runde af opvarmning slides er afsluttet fjerne den tidligere anvendte primære og sekundære antistof-kompleks efterlader kun fluorescerende tag bundet til vævet epitop11. Dette giver mulighed for flere antistoffer af enhver art, der skal genappliceres uden bekymring for cross-reactivity11,12. For at minimere behovet for manuel kompensation for flere fluorescerende farvestoffer, bruges en samling af fluorophorer med lille spektral overlap, herunder en atomart Counter plet, til at fuldføre mfIHC. For at gøre brug af den autofluorescens, der er opstået med FFPE-væv, trækker softwaren autofluorescens fra det endelige billede ved hjælp af et billede fra et tomt dias, som er muligt på grund af styrken af antigen specifik fluorescens efter fluoroforet signal forstærkning. Ved hjælp af nye programmer, der er designet til store datasæt, kan celleplaceringer identificeres og analyseres for rumlig kontekst1,2,4. Den mest betydningsfulde begrænsning af denne teknik er optimering tid. Her findes en detaljeret metodologi med instruktioner til eksperimentel design og farvning og billedbehandlings strategi. mfIHC vil være nyttigt for laboratorier, der ikke i øjeblikket har en optimeret automatiseret farvning system, der gerne vil bedre forstå den rumlige kontekst af celle-til-celle interaktioner i intakt FFPE væv ved hjælp af manuel teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt arbejde er blevet godkendt af University of Michigans interne klagenævn.

1. optimering af primære antistoffer og slide forberedelse

  1. Bestem ideel koncentration af antistoffer for multiplex ved hjælp af konventionelle IHC.
    1. Test antistofferne for multiplex ved manuel konventionel immun histokemi (IHC)13.
    2. Brug specifikke væv, der har en rigelig celletype for hvert antistof testet såsom brug af tonsil væv til CD3 antistof test.
    3. Brug den reference koncentration for IHC, som virksomheden anbefaler, og fuldfør derefter IHC med antistofkoncentrationer ved de anbefalede koncentrationer samt koncentrationer over og under den anbefalede koncentration.
  2. Forbered formalin fast paraffinindlejret væv på slides.
    1. Ved hjælp af en mikrotomen skæres blokke af FFPE væv i en tykkelse mellem 4 og 6 μm og gælder for ladede slides.
      Bemærk: brug af destilleret vand sikrer korrekt vævs montering og-tilslutning i hele multiplex.
    2. Placer slides fladt, væv side op, og lad det tørre ved 37 °C natten over.
    3. Gem slides i en slide boks væk fra ekstreme temperaturer, indtil du er klar til at fuldføre multiplex.

2. generel farvnings metode

  1. Klargøring af løsninger til genfinding af vask og antigen
    1. Vask opløsningen på 0,1% TBST fremstilles ved at blande 9 L afioniseret vand, 1 L Tris bufferet saltopløsning (TBS) og 10 mL Polysorbat 20.
    2. Forbered begge antigen-genfindings opløsninger (pH 6 og pH 9; Tabel over materialer) fortyndes til 1x med deioniseret vand.
  2. Deparaffinization og rehydrering
    1. Bage slides, liggende flad, væv side op ved 60 °C for 1 h i en hybridiseringsovn1. Fjern slides fra ovnen, og lad den køle af i mindst 5 − 10 minutter, og Placer den i et lodret glide stativ.
    2. Behandl diasene i følgende opløsninger sekventielt: xylen i tre eksemplarer, efterfulgt af en enkelt behandling af 100% ethanol, 95% ethanol, og endelig 70% ethanol i 10 min hver ved hjælp af en slide farvning sæt1.
    3. Vask rack af slides i 2 min med deioniseret vand ved nedsænkning i en plastik glide boks efterfulgt af fiksering ved nedsænkning i en plastik slide boks fyldt med neutral Buffered formalin i 30 min13. Vask slides i deioniseret vand i 2 min derefter fortsætte til antigen hentning.
  3. Antigen hentning
    1. Placer stativet til en varmebestandig æske, der er fyldt til den indvendige linje (ca. 300 mL) med en pH 6-eller pH 9-antigen-genfindings buffer.
      Bemærk: antigen søgnings bufferen kan enten være pH 6 eller pH 9, som skal optimeres pr. epitope. Men start med at bruge pH 9 for antistoffer, der binder sig til nukleare epitoper og pH 6 for alle andre antistoffer.
    2. Dæk kassen med plastikfolie og brug et gummibånd til at sikre. Anbring æsken i mikrobølgeovnen i kanten af den roterende plade (mikrobølgeovnen skal være udstyret med inverterteknologi til jævn opvarmning). Opvarm diasene til 45 s ved 100% strøm efterfulgt af 15 min ved 20% Power13.
      Bemærk: mikrobølge behandling kan have brug for optimering afhængigt af den anvendte mikrobølge.
    3. Lad slidene køle af i ca. 15 − 20 minutter.
  4. Forbered arbejdsopløsninger af antistoffer og fluorophorer, mens slides afkøles.
    1. Det primære antistof fortyndingsmiddel forberedes ved at opløse 0,5 g kvægserum albumin granulat til 50 mL TBST. Alternativt kan du bruge 50 mL 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) til at opløse granulat.
    2. Gør hver primær antistofarbejdsopløsning til den optimerede koncentration, som bestemmes i afsnit 1, i det primære antistof fortyndingsmiddel. Anslået ca. 200 μL pr. slide.
    3. Fluoroforet-arbejdsopløsningen forberedes ved fortynding af hver fluoroforet i fluoroforet-fortyndingsmidlet i en koncentration på 1:100.
      Bemærk: Dette kan være nødvendigt at optimere afhængigt af antistoffet. Anslået ca. 100 μL pr. slide.
    4. På den sidste dag i farvning, forberede 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) arbejdsopløsning ved at tilføje 3 dråber DAPI i 1 mL TBST.
  5. Skub farvning (vask og blokering)
    1. Fjern kassen fra mikrobølgeovnen efter afkøling og tag plastik wrap af, vask slides med deioniseret vand i 2 min efterfulgt af en 2 min vask i en plastik slide boks fyldt TBST13.
    2. Efter tørring hver slide rundt i vævet med en delikat opgave tørre omhyggelig med ikke at lade vævet tørre ud, spore omkring yder linjen af vævet ved hjælp af en hydrofobe barriere pen. Rør ikke ved vævet med den delikate opgave serviet eller pennen.
    3. Placer hvert dias i det befugnede kammer og tilsæt blokerende opløsning (ca. 4 dråber) til vævet. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
  6. Slide farvning (primær antistof applikation)
    1. Tag hver slide og fjerne blokerende løsning ved at trykke på siden af diaset på en stak af papirhåndklæder og ved hjælp af en delikat opgave tørre at fjerne overskydende blokerende middel fra omkring vævet.
    2. Læg diaset tilbage i det befugdede kammer, og tilsæt ca. 200 μL af det primære antistof. Inkuber i det befugdede kammer i 1 time ved RT.
    3. Vask med TBST i 2 min. ved nedsænkning i tre triplicat13.
      Bemærk: efter hvert vaske trin vil udskiftning af TBST hjælpe med at sikre et renere billede.
  7. Slide farvning (sekundært antistof program)
    1. DUP den resterende TBST ud af hvert lysbillede og Påfør ca. 3 til 4 dråber sekundært antistof (blanding af kanin-og musens sekundære HRP-konjugerede antistoffer). Inkuber i 10 minutter i det befurede kammer ved RT13.
      Bemærk: Hvis du planlægger at bruge et primært antistof, der kræver et sekundært antistof, bortset fra mus eller kanin, eller hvis du vælger at bruge et alternativt sekundært antistof, skal du anvende det relevante HRP konjugeret sekundært til diasene og inkubere ved RT i 45 min. optimering af Inkubationstiden kan være nødvendig for den alternative sekundære14.
    2. Efter inkubation vaskes med TBST i 2 min i tre eksemplarer13.
  8. Slide farvning (fluorophore ansøgning)
    1. Påfør ca. 100 μl fluoroforet-arbejdsopløsningen og Inkuber i det befugdede kammer ved rt i 10 min13.
    2. Vask med TBST i 2 min. i tre eksemplarer13.
  9. Fjernelse af antistoffer
    1. Mikrobølge slides (45 s ved 100% derefter 15 min ved 20%) i den varmebestandige boks (Se trin 2.3.2) til fjernelse af antistoffer13,14.
      Bemærk: Dette afslutter en runde af multiplex. Dette er det eneste punkt, hvor protokollen kan afbrydes midlertidigt. Hvis du vil afbryde protokollen midlertidigt, skal du lade diasene være nedsænket i antigen søgnings bufferen natten over ved stuetemperatur.
  10. Fortsætte yderligere runder af farvning. Gentag trin 2.5.1 − 2.9.1 for resten af antistof-fluorophore-parrene. Når alle antistoffer og fluorophorer er blevet anvendt, fortsættes til afsnit 2,11.
  11. DAPI-applikation og montering
    1. Efter den sidste farvning runde i multiplex, fjerne den sidste antistof ansøgning med antigen hentning løsning pH 613. Vask med deioniseret vand efterfulgt af TBST i 2 min. hver13.
    2. Påfør ca. 150 μL af den fungerende DAPI-opløsning til slides og Inkuber i det befurede kammer i 10 minutter ved RT1.
    3. Vask med TBST i ca. 30 s og monter dæmonerne med en antifade-montering. Påfør den klare Fingernegl på de fire hjørner af dæksedlen, når monterings mediet er tørret for at sikre dæksedlen (valgfrit).

3. oplysninger om bibliotek, monoplexer og multiplex

  1. Vælg slides til opbygning af et fluoroforet-bibliotek.
    1. For en 7-farve multiplex samle 7 immuncelle rige væv dias (dvs., tonsil, milt, etc.) for biblioteket.
      Bemærk: Vælg kontrol slides, der skal bruges til et fluoroforet bibliotek med hvert dias, der repræsenterer hver unik fluoroforet, som vil blive brugt i multiplex. Kontrol slides bør have en rigelig epitop valg og kan være den samme type væv for hver fluorophore.
  2. Pletter og billede bibliotek slides til brug med monoplexer og multiplexer.
    1. Følg trin 2.1 − 2.9.1 ved hjælp af kontrol slides og Control tissue slides af valg. Der placeres en anden fluoroforet på hvert dias i en koncentration på 1:100. et dias bør kun indeholde DAPI.
    2. Fortsæt til afsnit 2,11, bortset fra at udelade DAPI-farvning og i stedet bruge TBST og montere som beskrevet.
    3. Efter at lade slides tørre natten over, billede med alle kanaler dapi, CY3, CY5, CY7, Texas rød, halvleder kvante prikker, og fluorescein allylisothiocyanat (FITC) indstilling af eksponeringen for 250 MS med mætning beskyttelse funktion1.
      Bemærk: eksponerings tiderne kan indstilles til 50 − 250 MS13.
    4. Upload bibliotekets billeder til softwaren og brug i analysen af monoplexer og multiplex.
  3. Vælg slides til monoplexer.
    1. Vælg kontrol slides, der har en rigelig epitop af valg baseret på optimerede antistoffer (afsnit 1). For hver runde af farvning, der skal gøres i multiplex, skal du vælge det antal kontrol slides til at oprette monoplexer.
      Bemærk: Formålet med monoplex er at bestemme den bedste position (rækkefølge) for hvert antistof, der skal anvendes i multiplex.
  4. Plet monoplexer.
    1. Følg afsnit 2.1 − 2.11 ved hjælp af det primære antistof i en anden rækkefølge (position) for hvert af diasene. Hvert dias skal kun have ét primært antistof anvendt ved en ordre (position), der er forskelligt fra de andre dias.
      Bemærk: for hvert dias, hvor runden ikke kræver primært antistof eller fluoroforet, skal du i stedet bruge primær antistoffortynder og fluoroforet fortyndingsmiddel13.
  5. Billede slides og analysere monoplex.
    1. Brug af mikroskop og indstilling af eksponeringstid til 250 MS for alle kanaler fange hvert billede udnytte DAPI til at fokusere.
      Bemærk: eksponerings tiderne kan indstilles til 50 − 250 MS14.
    2. Ved hjælp af analyse software evaluere hver monoplex slide ved at se på fluorescerende intensitet af den farvede markør.
    3. Sammenlign denne intensitet med baggrunden. Hvis det er mindst 5 − 10 gange højere end baggrunden, er placeringen af dette dias en optimal position at bruge i den endelige multiplex.
  6. Vælg slides til multiplex.
    1. Vælg de slides af interesse og tilføje en ekstra slide, der skal bruges som en tom slide for subtraktion af Auto luorescence efter farvning og billeddannelse.
  7. Plette multiplex.
    1. Baseret på monoplex resultater, vælge den passende rækkefølge (positioner) for hvert antistof baseret på trin 3.5.3. Tildel hver fluoroforet til et antistof.
      Bemærk: Dette kan have brug for optimering; Men, planlægger at bruge lyse antistoffer for mindre rigelige markører1, co-lokalisering antistoffer bør matches med fluorophores på langt spektre fra hinanden13, og fluorophores med spektret 540 og 570 bør ikke være co-lokaliseret på grund til spektral overlap spørgsmål1.
    2. Fortsæt med afsnit 2.1 − 2.11 at sikre, at det tomme lysbillede ikke modtager primært antistof, fluoroforet eller dapi, skal du i stedet bruge antistof fortyndingsmiddel, fluoroforet-fortyndingsmiddel og tbst på sin plads.
  8. Billede multiplex og analysere for integriteten af farvning
    1. Ved hjælp af mikroskopet og indstilling af eksponeringstid til 250 MS for alle kanaler, fange hvert billede udnytte DAPI til at fokusere.
    2. Ved hjælp af analyse software (tabel over materialer), evaluere hver multiplex af fluorescerende falsk farve.
      Bemærk: et klart billede skal demonstrere hver markør tydeligt. Hvis en markør ser diffus og kornet eller er ikke-eksisterende, er det sandsynligt, at markøren ikke virkede og skal optimeres igen.
    3. Brug analysesoftwaren til at evaluere hver multiplex efter patologi visning. Patologi visning vil bekræfte specificiteten af hver markør. Sammenlign med tidligere optimeret IHC (afsnit 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den overordnede proces med at opnå en 7-farvet multiplex-analyse følger et gentaget mønster. Figur 1 beskriver processen i en skematisk form. Når slides er skåret og tørret eller modtages fra laboratoriet og bagt i en hybridiseringsovn ved 60 °c i 1 time, derefter gå videre til deparaffinisering og rehydrering, fastgør diasene i formalin igen efterfulgt af antigen hentning. Hver runde af multiplexing starter ved antigen hentning og slutter ved antistof fjernelse (figur 1).

Optimering af hvert trin i processen er altafgørende for at opnå et klart og brugbart billede. Antistoffer skal testes af IHC først ved hjælp af antigen hentning buffere med pH 6 og pH 9 for hvert antistof til at visualisere hvilken antigen hentning buffer fungerer bedst med det pågældende antistof. Generelt reagerer nukleare mål på antigen hentning med buffer pH 9. For eksempel virker FOXP3 bedst, når antigen hentning buffer af pH 9 anvendes i modsætning til CD3, der fungerer bedst med antigen hentning buffer af pH 6. Billeder taget fra IHC-processen bør anvendes til at validere specificiteten af multiplex-analysen.

En monoplex er nødvendig for at bestemme rækkefølgen af hvert antistof i multiplex. Når du bruger enten en 4-eller en 7-farve kit, hvert antistof vil have en foretrukken rækkefølge i array. For antallet af antistoffer, der vil blive brugt, samle de relevante kontrol slides (dvs., for en 7-farve multiplex hvor en farve er DAPI, Vælg 6 vævsspecifikke repræsentative kontrol slides for de 6 andre fluorophores). Figur 2 A-C er en skematisk repræsentation af en monoplex analyse ved hjælp af 3 dias med FFPE tyktarmskræft væv. Hvert dias har FOXP3 i en anden position i matrixen ved hjælp af fluoroforet 570 som sit tag. DAPI bruges som en Counter plet til tilstrækkeligt visualisere kerner. I figur 3vises repræsentative billeder af en monoplex og en multiplex med varierende FOXP3 position. I figur 3A, B, hvor FOXP3 befinder sig på den tredje position (svarende til den rækkefølge, der er vist i figur 2c), ses en specifik og robust farvning af FOXP3 (rød) som påvist af lyse nukleare farvnings figur 3a og samlokalisering med CD3 figur 3b. Fluoroforet-signal intensiteten bekræfter specificiteten af FOXP3 uden uspecifik farvning andetsteds i vævs figur 3a. I figur 3c, hvor FOXP3 er på første position (svarende til rækkefølgen i figur 2a), er der ikke-specifik farvning af FOXP3. Kornet diffuse områder af rødt dække det meste af lysbilledet og fluorescerende intensitet på disse områder er mindre end 1. Forsøg på at gøre en multiplex uden at fuldføre en monoplex først at teste rækkefølgen af farvning resulterer i et lignende resultat og vil spilde reagenser. Et andet kritisk skridt, der ikke kan overses i multiplex processen er DAPI farvning. En fungerende DAPI-kontra bejdsning er grundlaget for celle identifikation og yderligere rumlig analyse ved hjælp af analysesoftwaren. En vigtig kontrast kan ses i det sammensatte billede med arbejder DAPI (blå) i figur 3E og i den ikke-arbejdende Dapi i figur 3F. Billedet i figur 3F kunne ikke bruges til at identificere celler i analysesoftwaren. Et forsøg på at redde multiplex og vævsanalyse, dæksedlen måske fjernes ved at suge diaset i TBST efterfulgt af et mikrowaving trin i pH 6 antigen hentning buffer med en yderligere anvendelse af DAPI.

Når monoplex assay er afsluttet og optimal antistof ordre bekræftet, en multiplex strategi kan konstrueres figur 4. For hvert mål skal der vælges en anden fluoroforet. Det antal, der er forbundet med hver fluoroforet, repræsenterer omtrent den spektral fluorescerende bølgelængde udledt efter excitation, svarende til strømnings cytometri. Der skal udvises forsigtighed ved matchning af foreslåede antistoffer med fluorophorer for at begrænse spektral overlap og potentiel blødning af markører. En god strategi er at vælge bølgelængder langt fra hinanden for Co-lokalisering antistoffer til at reducere overskydende spektral overlap giver et skarpt billede og mere pålidelig fænotypebestemmelse13. For eksempel er CD8 i den viste multiplex-strategi (figur 4) parret med fluoroforet 570, mens CD3 er parret med fluoroforet 520. Man bør undgå brug af fluoroforet 540 og 570 i co-lokaliseret mål, da disse har tendens til at være den mest udiskriminerende og kan forringe resultaterne. Fluorophore 620 tendens til at være meget lyse og bør anvendes til antistoffer, der ikke er rigelige i vævet. Et nyligt bibliotek bruges som reference for hver fluoroforet også aids til at reducere spektral overlap af fluorophorer. En tom slide, der gennemgår alle runder af antigen hentning er nødvendig for at sikre autofluorescens ekstraktion fra det sammensatte billede. Dette blanke dias gennemgår den samme behandling som multiplex-diasene, undtagen i stedet for et fungerende primært antistof og fluoroforet, og antistoffortynder og fluoroforet fortyndingsmiddel vil blive anvendt henholdsvis figur 4b.

For at sikre, at multiplex-designet fungerede korrekt, og de markører, der ses i det sammensatte billede, er specifikke, skal du bruge "patologisk billede" i kombination med indstillingen "brightfield" ved hjælp af mikroskop-software, der skaber et faux IHC-billede, som derefter kan sammenlignet med de tidligere IHC-analyser, som omtales i afsnit 1. Desværre, smukke komposit billeder kan ikke nødvendigvis afspejle en præcis plet, og dette er et vigtigt skridt til kvalitetskontrol processen og forhindre falsk positive resultater. Figur 5a viser et sammensat billede uden indledende bekymring. CD3 visualiseres og viser specifik farvning (grøn) og bekræftes af patologi lysfelt-billedet i figur 5b. CD163 (orange) ses i det sammensatte billede (figur 5a). men ved vurderingen af patologien lysfelt View of CD163 (figur 5c) er antistoffet ikke-specifikt. Et eksempel på et optimalt multiplex-billede med specifik farvning påvises i et sammensat billede (figur 5D). CD3 og CD163 specificitet bekræftes ved hjælp af patologi lysfelt View (figur 5e og figur 5Fhenholdsvis) og sammenlignes positivt med tidligere IHC assays udført ved hjælp af disse antistoffer (ikke vist).

Figure 1
Figur 1: farvnings arbejdsprocesdiagram.
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: udvikling af Monoplex.
A) tyktarmskræft slide med FOXP3 på position 1. B) tyktarmskræft slide med FOXP3 på position 2. C) tyktarmskræft slide med FOXP3 på position 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: succeser og faldgruber af monoplex og multiplex.
(A) monoplex-assay af primær tyktarmskræft med FOXP3 ved position 3, viste fluorescerende intensitet. B) multiplex-assay af primær tyktarmskræft med FOXP3 ved position 3 og CD3 ved position 2. (C) monoplex-assay af primær tyktarmskræft med FOXP3 ved position 1, fluorescerende intensitets mærke. D) multiplex-assay af primær tyktarmskræft med FOXP3 ved position 1 og CD3 ved position 2. E) multiplex-assay af primær tyktarmskræft med en rækkefølge af antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grøn), CD163 (orange), pancytokeratin (hvid), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), fungerende dapi (blå). F) multiplex-assay af primær tyktarmskræft med en rækkefølge af antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grøn), CD163 (orange), pancytokeratin (hvid), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), ikke-fungerende dapi (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: multiplex-udvikling.
(A) multiplex slide af tyktarmskræft i en 7-farvet multiplex. (B) blank slide i en 7-farvet multiplex ved hjælp af tyktarmskræft væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: analysere specificitet af en 7-farve multiplex.
A) multiplex-sammensat billede med antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grøn), CD163 (orange), pancytokeratin (hvid), Ki67 (rød), dapi (blå). (B) patologi lysfelt visning af billedet i panel A på CD3 kun visning. (C) patologi lysfelt visning af billedet i panel A på CD163 kun visning. (D) multiplex sammensat billede med antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grøn), CD163 (orange), pancytokeratin (hvid), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), dapi (blå). (E) patologi lysfelt visning af billedet i panel D på CD3 kun visning. (F) patologi lysfelt visning af billedet i panel D på CD163 kun visning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intakte vævsprøver fra solid tumor biopsi og kirurgisk resektion er fortsat vigtige diagnostiske og forudsigende værktøjer til sygdoms analyse samt patient prognose. Multiplex fluorescerende immun histokemi (mfIHC) er en ny teknik, der kombinerer fordelene ved immun histokemi (IHC), immunofluorescens (IF) og flow cytometri. Tidligere metoder til sonde celler in situ har tilladt for evaluering af celle-til-celle arrangementer i et vævs miljø8, men det lave antal epitoper, der kan probed begrænser komplekse analyse. Flow cytometri, selvom nyttige i at analysere mange celletyper i en prøve, mister rumlig sammenhæng i kraft af at forberede prøver som en enkelt cellesuspension9,10. mfihc broer disse teknikker ved at bevare den rumlige kontekst af cellulære mikromiljø og øge antallet af epitoper, der kan mærkes, mens forstærke signalet per mærket epitop11. Tidligere forskning har brugt mfihc til fænotypebestemmelse cellulære infiltrat i kræft og ikke-Cancer vævsprøver1,2,3,4,5,15. Post-image analyse er også blevet brugt til at analysere rumlige relationer af celler og strukturer inden for vævs mikromiljø1,2,4. Til pålidelig analyse skal der først produceres et specifikt og præcist billede. Den manuelle farvningsteknik, i modsætning til et automatiseret farvnings system, gør det muligt for mindre og omkostningsbevidste laboratorier at få adgang til denne teknologi. Optimering tid og farvnings tiden er blandt de største barrierer for at opnå et pålideligt billede for yderligere rumlig analyse.

Flere generelle regler øger sandsynligheden for en vellykket generering af et pålideligt sammensat multiplex-billede og sparer tid og ressourcer. Antistoffer, der skal anvendes i multiplex bør vælges baseret på succes med manuel konventionel IHC. Antigen genfinding buffere med pH 6 og pH 9 bør anvendes til IHC for at undersøge den relevante antigen hentning til brug i multiplex. Monoplex udvikling er nødvendig for at identificere placeringen af antistoffer inden for multiplexing protokol. Begrundelsen for dette er kompliceret og varierer mellem vævsprøver og epitoper. I nogle tilfælde kan epitop nedbrydes med flere opvarmning trin og markør visualisering går tabt, som det ofte er tilfældet med CD3. FOXP3, dog bliver lysere med mere opvarmning trin og er næppe synlig, hvis placeret på den første eller anden runde af multiplex13,14.

Farvningsprocessen starter med FFPE væv skåret på ladede slides. Det første problem, der kan opstå, er vævet falder ud af diaset efter microwaving. Når ladede slides ikke anvendes, er det begrænset at holde vævet på glasoverfladen, og vævet vil have enten overdreven foldning eller kan glide helt af. For yderligere at sikre, at vævet klædes til diasene under farvningsprocessen, udføres der flere teknikker. Først mens du skærer blokkene på slides, fungerer den reneste form for vand bedst. For nogle laboratorier kan deioniseret vand være tilstrækkeligt, men destilleret vand har fungeret bedst. Slidene skal tørres fladt umiddelbart efter opskæring ved 37 °C natten over. For yderligere at sikre overholdelse placeres diasene derefter i en hybridiseringsovn og bages i liggende flade ved 60 °C i en timelige før brug. Selv om formalin fiksation allerede har fundet sted under den indledende vævs forberedelsesproces, er placeringen af gliderne i neutral Buffered formalin i 30 minutter efter afparaffinering og rehydrerings proces en øget strukturel integritet af den monterede væv1,13.

Den manuelle farvning proces kan tage op til tre, 8-timers dage afhængigt af antallet af anvendte antistoffer. Undgå faldgruber er afgørende for at spare tid og besparende reagenser. Den første almindeligt forekommende fejl opstår ofte i reagens præparatet. Vand varierer mellem laboratorier og kan være den eneste forskel i resultater fra et laboratorium til det næste. Brug af den samme såvel som en ren vandkilde til alle reaktioner og reagenser sikrer et ensartet resultat. Antistofferne, blokerende opløsning og fluorophores fungerer bedst ved stuetemperatur. For at undgå faldgruber i reagens-og arbejdsopløsningen skal du bruge det samme vand til alle reagenser. Brug også alle arbejdsopløsninger og reagenser ved stuetemperatur.

Fejlfinding af mfIHC er vigtig og overholdelse af strenge laboratorie retningslinjer afgørende for at begrænse kontaminering af komponenter og/eller operatør fejl. Produktion af suboptimale billeder vil skævvride resultater og føre til falske positive og negative cellepopulationer, som kan have en negativ indvirkning på data. Da den ultimative analyse typisk omfatter computergenererede fænotyper baseret på maskinel indlæring, kan små fejl i farvning forstørres for at påvirke hele datasættet. For eksempel, selv om alle pletter kan fungere perfekt, en fejl eller udeladelse af DAPI vil forhindre fremtidig celle segmentering og tælle rendering eksperimentet ubrugelig. Analyse software bruger DAPI-farvning ikke kun til at identificere celler, men tildeler x-og y-koordinater til hver celle, og hvis multiplex har Dim, dårligt afgrænset eller diffus DAPI-farvning, kan billedet ikke anvendes yderligere, og multiplex skal redone eller forsøges redning og genfarvning af DAPI. Brug af softwarekomponenter såsom patologi og lysfelt synspunkter vil øge tilliden til følsomhed og specificitet tidligt i optimeringsprocessen og forhindre fejl tidligt i multiplex processen.

De modificerende aspekter af billedbehandlings processen kan også støtte i billedoptimering. For eksempel, at tage et billede ved hjælp af DAPI som visuel hjælp til at fokusere hjælper med at undgå slørede billeder. Tilføjelse af den nyligt fremstillet fluoroforet bibliotek til softwaren vil sikre et rent billede og mindre spektral overlap af hver fluoroforet i analysefasen og ved hjælp af den tomme slide til at udtrække autofokus intensiverer markører og forbedrer billedet Kvalitet.

Brugen af vævsprøver har og vil fortsat være et vigtigt redskab til undersøgelse af Patofysiologi af sygdom. Fremspirende teknologi har øget vores forståelse af celle-til-celle interaktioner og mfIHC er en lovende ny spiller. Optimering og nøjagtighed under farvningsprocessen i denne teknik er altafgørende for korrekt udnyttelse og yderligere analyse af celle-til-celle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke ed stack, tidligere fra Perkin Elmer, for hans assistance med opsætning og optimering af originale multiplex farvning. Forfatterne vil også gerne takke kristen Schmidt fra Akoya Biosciences for tips ved hjælp af Analysis software. Den forskning, som rapporteres i denne publikation, blev støttet af de nationale Cancer institutter for sundhed under Award nummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed. Yderligere støtte blev leveret af Jeffery A. Colby Colon cancer og Tom Liu Memorial forskningsmidler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3, (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
  3. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  4. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
  5. Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
  6. Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200, (1), 347-354 (2018).
  7. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
  9. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37, (2), 163-176 (2017).
  10. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, (6), 601-616 (2010).
  11. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  12. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97, (7), 873-885 (2017).
  13. Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. 32 (2016).
  14. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. Perkin Elmer Manual. (2014).
  15. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130, (22), 2420-2430 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics