Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Cancer Research

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Summary

Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

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Lazarus, J., Akiska, Y., Perusina Lanfranca, M., Delrosario, L., Sun, L., Long, D., Shi, J., Crawford, H., Di Magliano, M. P., Zou, W., Frankel, T. Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (149), e59915, doi:10.3791/59915 (2019).

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Abstract

Die Mikroumweltbewertung von intaktem Gewebe zur Analyse der Zellinfiltration und räumlichen Organisation ist für das Verständnis der Komplexität von Krankheitsprozessen von entscheidender Bedeutung. Zu den in der Vergangenheit verwendeten Prinziptechniken gehören Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF), die die Visualisierung von Zellen als Momentaufnahme in der Zeit mit 1 bis 4 Markern ermöglichen. Beide Techniken weisen Mängel auf, darunter Schwierigkeiten bei der Färbung schlecht anogener Ziele und Einschränkungen im Zusammenhang mit der artenübergreifenden Reaktivität. IHC ist zuverlässig und reproduzierbar, aber die Art der Chemie und die Abhängigkeit vom sichtbaren Lichtspektrum ermöglicht nur wenige Marker und macht die Kolokalisierung schwierig. Die Verwendung von IF erweitert potenzielle Marker, beruht aber aufgrund der umfangreichen Gewebe-Autofluoreszenz nach formaler Fixierung in der Regel auf gefrorenes Gewebe. Durchflusszytometrie, eine Technik, die die gleichzeitige Etikettierung mehrerer Epitope ermöglicht, beseitigt viele der Mängel von IF und IHC, jedoch verliert die Notwendigkeit, Zellen als einzelzellige Suspension zu untersuchen, den räumlichen Kontext von Zellen, die wichtige biologische Beziehungen. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) überbrückt diese Technologien, die eine multiepitopzelluläre Phänotypisierung in formalin fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe ermöglichen und gleichzeitig die gesamte Mikroumgebungsarchitektur und die räumliche Beziehung der Zellen innerhalb intakten, ungestörten Gewebes. Fluorophore mit hoher fluoreszierender Intensität, die kovalent mit dem Gewebeepitop verbunden sind, ermöglichen mehrere Anwendungen primärer Antikörper, ohne sich um eine artspezifische Kreuzreaktivität durch sekundäre Antikörper zu kümmern. Obwohl sich diese Technologie als zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten erwiesen hat, kann der Prozess der Erstellung einer nützlichen mfIHC-Färbestrategie aufgrund umfangreicher Optimierung und Design zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Um robuste Bilder zu erstellen, die genaue zelluläre Interaktionen vor Ort darstellen, und um den Optimierungszeitraum für die manuelle Analyse zu mildern, werden hier Methoden zur Folienvorbereitung, Optimierung von Antikörpern, Multiplex-Design sowie Fehler vorgestellt. häufig während des Färbevorgangs auftreten.

Introduction

Die Visualisierung einer intakten Tumormikroumgebung (TME) ist wichtig, um nicht nur die zelluläre Infiltration bei festen Malignomen, sondern auch bei Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu bewerten. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) hat sich als wirksames Werkzeug für Multi-Antigen-Phänotypisierung von Zellen in der Untersuchung von Krebs und assoziierten Krankheiten1,2,3,4, 5,6,7. Dies ermöglicht in Kombination mit neuartigen Software und Programmen zur Analyse großer Datensätze die Beobachtung komplexer Interaktionen zwischen den Zellen1,2,4. Der Ratenbegrenzungsfaktor bei der Datenerfassung ist oft die Qualität des gebeizten Gewebes vor der Analyse.

Frühere Techniken, die zur Phänotyp-Zelle in der TME verwendet wurden, umfassen Immunhistochemie (IHC), Immunfluoreszenz (IF) und Durchflusszytometrie, die alle signifikante Einschränkungen aufweisen. IHC verwendet formalin fixiertes Paraffin eingebettet (FFPE) Gewebeabschnitte, die deparaffiniert und rehydriert werden, bevor sie von den meisten von einem Antikörper gefärbt werden. Die Verwendung eines meerrettichperoxidase (HRP) gebundenen Sekundärantikörpers und einer chemischen Reaktion ermöglicht die Visualisierung eines einzelnen antigenen Epitops8. Während IHC zuverlässig ist und auf FFPE-Gewebe durchgeführt wird, das einfach zu arbeiten ist, bedeutet die Begrenzung des sichtbaren Lichtspektrums, dass nur ein oder zwei Marker zuverlässig unterschieden und die Kolokalisierung von Antigenen ziemlich schwierig ist8. Eine Möglichkeit, verfügbare Marker und damit Antigene zu erweitern, die auf einem einzigen Abschnitt untersucht werden können, besteht darin, auf Fluoreszenz umzustellen, was die Verwendung eines breiteren Spektrums des visuellen Spektrums ermöglicht. Für IF wird gefrorenes oder FFPE-Gewebe auf Dias und Antikörper übertragen, die zu verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind. Während dies die Anzahl der Antigene erhöht, die untersucht werden können, Gibt es mehrere wichtige Einschränkungen. Erstens, da jeder Antikörper in der Regel nur ein Fluorophor befestigt hat, ist die Helligkeit oft nicht stark genug, um die Gewebeautofluoreszenz zu überwinden. Es ist aus diesem Grund, die meisten IF wird auf gefrorenem Gewebe durchgeführt, die teuer zu lagern und schwierig zu arbeiten ist. Eine begrenzte Anzahl von fluoreszierenden Tags steht aufgrund von Spektralüberlappungen und artenübergreifender Reaktivität zur Verfügung, insbesondere wenn nicht konjugierte Antikörper verwendet werden. Die Durchflusszytometrie, die aus der Verarbeitung von frischem Gewebe zu einer Einzelzellsuspension und der Etikettierung mit fluoreszierenden Antikörpern besteht, ist seit Jahrzehnten der Goldstandard für Dieimmunphenotypisierung9,10. Ein Vorteil der Durchflusszytometrie ist die Fähigkeit, mehrere Antikörper ohne Sorge um die Kreuzreaktivität der Arten zu kennzeichnen, da die meisten konjugiert sind. Da die Zellen von einer Maschine "visualisiert" werden und nicht von menschlichen Augen, gibt es viel mehr Fluorophore zur Verfügung, aber dies hat seinen Preis. Die Kompensation muss manuell erfolgen, was die Ergebnisse, die zu falschen positiven und negativen Populationen führen, erheblich verändern kann. Die bedeutendste Einschränkung der Durchflusszytometrie ist, dass die Gewebearchitektur und anschließend alle räumlichen Informationen durch die Notwendigkeit der Suspension einzelner Zellen verloren gehen.

Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit neuartiger Software kombiniert die Vorteile der IHC-, IF- und Durchflusszytometrie, indem multiantigene Gewebefärbung mit Signalverstärkung und Beibehaltung räumlicher Beziehungen ohne Entschädigung. FFPE-Gewebe wird auf geladenen Dias platziert, die nach dem Antigen-Retrieval eine Runde primärer Antikörperanwendung auf das Zielantigen von Interesse durchlaufen, gefolgt von einem sekundären Antikörper mit einem HRP-Chemikalien-Tag, ähnlich wie IHC. Nach der Platzierung des sekundären Antikörpers führt eine HRP-spezifische Reaktion zu einem Fluorophor, das kovalent an das Epitop von Interesse bindet11. Sobald das Gewebe beschriftet ist, wird eine weitere Runde der Erwärmung der Dias abgeschlossen, um den zuvor angewendeten primären und sekundären Antikörperkomplex zu entfernen, so dass nur das fluoreszierende Tag an das Gewebeepitop11gebunden ist. Dies ermöglicht die wiederanwendung von mehreren Antikörpern jeder Art ohne Bedenken bei der Kreuzreaktivität11,12. Um jeglichen Bedarf an manueller Kompensation mehrerer fluoreszierender Farbstoffe zu minimieren, wird eine Ansammlung von Fluorophoren mit geringer spektraler Überlappung einschließlich eines nuklearen Zählerflecks verwendet, um den mfIHC zu vervollständigen. Um die Mitfluoreszenz mit FFPE-Gewebe zu berücksichtigen, subtrahiert die Software die Autofluoreszenz vom endgültigen Bild mit einem Bild von einem leeren Dia, was aufgrund der Stärke der antigenspezifischen Fluoreszenz nach Fluorophor möglich ist. Signalverstärkung. Mit neuartigen Programmen, die für große Datensätze entwickelt wurden, können Zellpositionen identifiziert und für den räumlichen Kontext1,2,4analysiert werden. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die Optimierungszeit. Eine detaillierte Methodik mit Anleitungen für experimentelles Design und Färbe- und Bildgebungsstrategie finden Sie hier. mfIHC wird für Laboratorien nützlich sein, die derzeit nicht über ein optimiertes automatisiertes Färbesystem verfügen, das den räumlichen Kontext von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen in intaktem FFPE-Gewebe mit der manuellen Technik besser verstehen möchte.

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Protocol

Alle Arbeiten wurden vom internen Überprüfungsausschuss der University of Michigan genehmigt.

1. Optimierung der primärantikörper und Der Diavorbereitung

  1. Bestimmen Sie die ideale Konzentration von Antikörpern für Multiplex mit konventionellem IHC.
    1. Testen Sie die Antikörper für den Multiplex durch manuelle konventionelle Immunhistochemie (IHC)13.
    2. Verwenden Sie spezifische Gewebe, die einen reichlichen Zelltyp für jeden getesteten Antikörper haben, z. B. die Verwendung von Tonsillengewebe für CD3-Antikörpertests.
    3. Verwenden Sie die vom Unternehmen empfohlene Referenzkonzentration für IHC und vervollständigen Sie dann IHC mit Antikörperkonzentrationen in den empfohlenen Konzentrationen sowie Konzentrationen oberhalb und unterhalb der empfohlenen Konzentration.
  2. Bereiten Sie formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe auf Dias vor.
    1. Mit einem Mikrotome Blöcke aus FFPE-Gewebe mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m schneiden und auf geladene Dias auftragen.
      HINWEIS: Die Verwendung von destilliertem Wasser sorgt für eine ordnungsgemäße Gewebemontage und Haftung im gesamten Multiplex.
    2. Die Dias flach, Gewebeseite nach oben legen und bei 37 °C über Nacht trocknen lassen.
    3. Bewahren Sie Dias in einer Folienbox weg von extremer Temperatur auf, bis sie bereit sind, das Multiplex abzuschließen.

2. Allgemeine Färbemethode

  1. Vorbereitung von Wasch- und Antigen-Retrieval-Lösungen
    1. Bereiten Sie die Waschlösung von 0,1% TBST vor, indem Sie 9 L entionisiertes Wasser, 1 L Tris gepufferte Salzsalzlösung (TBS) und 10 ml Polysorbat 20 mischen.
    2. Bereiten Sie beide Antigen-Retrieval-Lösungen (pH 6 und pH 9; Materialtabelle) durch Verdünnen auf 1x mit entionisiertem Wasser.
  2. Deparaffinierung und Rehydratation
    1. Dias backen, flach liegen, Gewebeseite bei 60 °C für 1 h im Hybridisierungsofen1. Entfernen Sie die Dias aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 5 x 10 min abkühlen und dann in ein vertikales Schiebeträger stecken.
    2. Behandeln Sie die Dias in den folgenden Lösungen sequenziell: Xylol in Dreifacharbeit, gefolgt von einer einzigen Behandlung von 100% Ethanol, 95% Ethanol und schließlich 70% Ethanol für je 10 min mit einem Gleitfärbeset1.
    3. Waschen Sie das Zahnstangengestell für 2 min mit entionisiertem Wasser durch Tauchen in einer Kunststoff-Schiebebox gefolgt von Fixierung durch Untertauchen in einer Kunststoff-Schiebebox gefüllt mit neutral gepufferten Formalin für 30 min13. Waschen Sie die Rutschen in entionisiertem Wasser für 2 min dann gehen Sie zu Antigen-Retrieval.
  3. Antigen-Retrieval
    1. Legen Sie das Zahnradregal in eine hitzebeständige Box, die mit pH 6 oder pH 9 Antigen-Abrufpuffer an die Innenleitung (ca. 300 ml) gefüllt ist.
      HINWEIS: Antigen-Abrufpuffer kann entweder pH 6 oder pH 9 sein, die möglicherweise pro Epitop optimiert werden müssen. Verwenden Sie jedoch zunächst pH 9 für Antikörper, die an nukleare Epitope binden, und pH 6 für alle anderen Antikörper.
    2. Bedecken Sie die Box mit Plastikfolie und verwenden Sie ein Gummiband, um zu sichern. Legen Sie die Box in die Mikrowelle am Rand der rotierenden Platte (Mikrowelle muss mit Wechselrichter-Technologie für gleichmäßiges Heizen ausgestattet sein). Erhitzen Sie die Rutschen für 45 s mit 100% Leistung gefolgt von 15 min bei 20% Leistung13.
      HINWEIS: Die Mikrowellenbehandlung kann je nach verwendeter Mikrowelle optimiert werden müssen.
    3. Lassen Sie die Dias ca. 15 bis 20 min abkühlen.
  4. Bereiten Sie Arbeitslösungen von Antikörpern und Fluorophoren vor, während die Dias abkühlen.
    1. Bereiten Sie das primäre Antikörperverdünnungsmittel vor, indem Sie 0,5 g Rinderserumalbumingranulat in 50 ml TBST auflösen. Alternativ können Sie 50 ml 1x Phosphatgepufferte Saline (PBS) verwenden, um Granulat aufzulösen.
    2. Machen Sie jede primäre Antikörperarbeitslösung für die optimierte Konzentration, die in Abschnitt 1 im primären Antikörperverdünner bestimmt wird. Schätzen Sie ca. 200 l pro Folie.
    3. Bereiten Sie die Fluorophor-Arbeitslösung vor, indem Sie jedes Fluorophor im Fluorophor-Verdünnungsmittel in einer Konzentration von 1:100 verdünnen.
      HINWEIS: Dies muss möglicherweise je nach Antikörper optimiert werden. Schätzen Sie ca. 100 l pro Folie.
    4. Bereiten Sie am letzten Tag der Färbung die Arbeitslösung 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) vor, indem Sie 3 Tropfen DAPI in 1 ml TBST hinzufügen.
  5. Gleitfärbung (Waschen und Blockieren)
    1. Entfernen Sie die Box aus der Mikrowelle nach dem Abkühlen und nehmen Sie die Kunststofffolie, waschen Sie die Dias mit entionisiertem Wasser für 2 min gefolgt von einer 2 min Waschen in einer Kunststoff-Schiebebox gefüllt TBST13.
    2. Nach dem Trocknen jeder Rutsche um das Gewebe mit einer empfindlichen Aufgabe wischen Darauf achten, das Gewebe nicht austrocknen lassen, verfolgen um die Außenseite des Gewebes mit einem hydrophoben Barriere-Stift. Berühren Sie das Gewebe nicht mit dem empfindlichen Aufgabenwisch oder Stift.
    3. Legen Sie jede Rutsche in die befeuchtete Kammer und fügen Sie dem Gewebe eine Blockierlösung (ca. 4 Tropfen) hinzu. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  6. Gleitfärbung (primäre Antikörperanwendung)
    1. Nehmen Sie jede Folie und entfernen Sie die blockierende Lösung, indem Sie auf die Seite der Folie auf einem Stapel von Papiertüchern tippen und eine empfindliche Aufgabe wischen, um überschüssiges Blockierungsmittel aus dem Gewebe zu entfernen.
    2. Legen Sie das Dia wieder in die befeuchtete Kammer und fügen Sie etwa 200 L des arbeitenden Primärantikörpers hinzu. Inkubieren Sie in der befeuchteten Kammer für 1 h bei RT.
    3. Waschen Sie mit TBST für 2 min durch Tauchen in dreifacher Ausführung13.
      HINWEIS: Nach jedem Waschschritt wird durch das Ändern des TBST ein saubereres Bild sichergestellt.
  7. Gleitfärbung (sekundäre Antikörperanwendung)
    1. Die verbleibenden TBST von jeder Rutsche abziehen und ca. 3 bis 4 Tropfen sekundären Antikörpern (Mischung aus Kaninchen und Maus sekundären HRP konjugierten Antikörpern) auftragen. 10 min in der befeuchteten Kammer bei RT13brüten.
      ANMERKUNG: Wenn Sie einen primären Antikörper verwenden möchten, der einen anderen sekundären Antikörper als Maus oder Kaninchen erfordert, oder einen alternativen sekundären Antikörper verwenden möchten, wenden Sie den entsprechenden HRP konjugierten Sekundäraufden auf die Dias an und inkubieren Sie bei RT für 45 min. Inkubationszeit kann für die alternative sekundäre14benötigt werden.
    2. Nach der Inkubation mit TBST für 2 min in Dreifache13waschen.
  8. Gleitfärbung (Fluorophor-Anwendung)
    1. Etwa 100 l der Fluorophor-Arbeitslösung auftragen und in der befeuchteten Kammer bei RT 10 min13inkubieren.
    2. Waschen Sie mit TBST für 2 min in dreifacher Ausführung13.
  9. Entfernung von Antikörpern
    1. Mikrowellenrutschen (45 s bei 100% dann 15 min bei 20%) in der hitzebeständigen Box (siehe Schritt 2.3.2) zur Entfernung von Antikörpern13,14.
      HINWEIS: Damit wird eine Runde des Multiplexs abgeschlossen. Dies ist der einzige Punkt, an dem das Protokoll angehalten werden kann. Um das Protokoll anzuhalten, lassen Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur im Antigen-Abrufpuffer untergetaucht.
  10. Weitere Färberunden. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.9.1 für die übrigen Antikörper-Fluorophor-Paare. Sobald alle Antikörper und Fluorophore verwendet wurden, fahren Sie mit Abschnitt 2.11 fort.
  11. DAPI-Anwendung und -Montage
    1. Nach der letzten Färberunde im Multiplex entfernen Sie die letzte Antikörperanwendung mit Antigen-Retrievallösung pH 613. Waschen Sie mit entionisiertem Wasser, gefolgt von TBST für 2 min je13.
    2. Tragen Sie ca. 150 l der arbeitenden DAPI-Lösung auf Dias auf und inkubieren Sie in der befeuchteten Kammer 10 min bei RT1.
    3. Mit TBST ca. 30 s waschen und Abdeckungen mit einem Antifade-Mountant montieren. Nach dem Trocknen des Montagemediums an den vier Ecken des Deckels, sobald das Montagemedium getrocknet ist, um den Deckel zu sichern (optional), müssen Sie klare Fingernagellackur auftragen.

3. Details für Bibliothek, Monoplexe und Multiplex

  1. Wählen Sie Folien für den Aufbau einer Fluorophorbibliothek aus.
    1. Für einen 7-Farben-Multiplex sammeln 7 Immunzellreiche Gewebe-Dias (d.h. Mandeln, Milz, etc.) für die Bibliothek.
      HINWEIS: Wählen Sie Steuerfolien aus, die für eine Fluorophorbibliothek verwendet werden sollen, wobei jede Folie jedes einzelne Fluorophor darstellt, das im Multiplex verwendet wird. Kontrollschlitten sollten ein reichliches Epitop der Wahl haben und können für jedes Fluorophor die gleiche Art von Gewebe sein.
  2. Flecken- und Bildbibliotheksfolien zur Verwendung mit Monoplexen und Multiplexen.
    1. Führen Sie die Schritte 2.1-2.9.1 mit den Steuerschlitten und der Steuerung von Gewebeschlitten Ihrer Wahl aus. Legen Sie ein anderes Fluorophor auf jeder Folie mit einer Konzentration von 1:100; eine Folie sollte nur DAPI enthalten.
    2. Fahren Sie mit Abschnitt 2.11 fort, außer dAPI-Färbung wegzulassen, und verwenden Sie stattdessen TBST und Mount wie beschrieben.
    3. Nachdem Sie Dias über Nacht trocknen lassen, bilden Sie mit allen Kanälen DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, Halbleiterquantenpunkten und Fluoresceinisothiocyanat (FITC), das die Belichtung s. 250 ms mit der Sättigungsschutzfunktion1einstellt.
      HINWEIS: Die Belichtungszeiten können auf 50 bis 250 ms13eingestellt werden.
    4. Laden Sie die Bibliotheksbilder auf die Software hoch und verwenden Sie sie bei der Analyse der Monoplexe und Multiplex.
  3. Wählen Sie Folien für Monoplexe aus.
    1. Wählen Sie Steuerfolien, die ein reichliches Epitop ihrer Wahl haben, basierend auf optimierten Antikörpern (Abschnitt 1). Wählen Sie für jede Färbungsrunde im Multiplex die Anzahl der Steuerelementfolien aus, um Monoplexe zu erstellen.
      HINWEIS: Der Zweck des Monoplexistes ist es, die beste Position (Ordnung) für jeden Antikörper zu bestimmen, der im Multiplex verwendet werden soll.
  4. Fleckenmonoplexe.
    1. Folgen Sie den Abschnitten 2.1-2.11 mit dem primären Antikörper in einer anderen Reihenfolge (Position) für jede der Folien. Auf jeder Folie sollte nur ein Primärantikörper in einer anderen Position (Position) angewendet werden, die sich von den anderen Folien unterscheidet.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Folie, bei der die Runde keinen primären Antikörper oder Fluorophor erfordert, stattdessen primäres Antikörperverdünnungsmittel und Fluorophorverdünnungsmittel13.
  5. Bild diagleitet und analysiert das Monoplex.
    1. Mit dem Mikroskop und der Einstellung der Belichtungszeit auf 250 ms für alle Kanäle erfassen jedes Bild unter Verwendung von DAPI zu fokussieren.
      HINWEIS: Die Belichtungszeiten können auf 50 bis 250 ms14eingestellt werden.
    2. Mit Hilfe der Analysesoftware bewerten Sie jedes Monoplex-Dia, indem Sie die fluoreszierende Intensität des gebeizten Markers betrachten.
    3. Vergleichen Sie diese Intensität mit dem Hintergrund. Wenn er mindestens 5 bis 10 Mal höher ist als der Hintergrund, ist die Position dieses Dias eine optimale Position, die im endgültigen Multiplex verwendet werden kann.
  6. Wählen Sie Folien für das Multiplex aus.
    1. Wählen Sie die Folien von Interesse und fügen Sie eine zusätzliche Folie als leere Folie für die Subtraktion der Autofluoreszenz nach Färbung und Bildgebung verwendet werden.
  7. Stain der Multiplex.
    1. Wählen Sie auf der Grundlage der Monoplex-Ergebnisse die passende Reihenfolge (Positionen) für jeden Antikörper auf Basis von Schritt 3.5.3 aus. Weisen Sie jedes Fluorophor einem Antikörper zu.
      HINWEIS: Dies kann eine Optimierung erforderlich sein; jedoch planen, helle Antikörper für weniger reichlich eimierte Marker1zu verwenden, kolokalisierende Antikörper sollten mit Fluorophoren in weiten Spektren von einander13abgeglichen werden, und Fluorophore mit dem Spektrum 540 und 570 sollten nicht aufgrund von zu spektralen Überlappungsproblemen1.
    2. Fahren Sie mit den Abschnitten 2.1-2.11 fort, um sicherzustellen, dass der Blindschlitten keine primären Antikörper, Fluorophor oder DAPI erhält, sondern stattdessen Antikörperverdünnung, Fluorophorverdünnung stritten und TBST an seiner Stelle verwenden.
  8. Bildmultiplex und Analyse auf Integrität der Färbung
    1. Mit dem Mikroskop und der Einstellung der Belichtungszeit auf 250 ms für alle Kanäle, erfassen Sie jedes Bild mit DAPI zu fokussieren.
    2. Bewerten Sie mit der Analysesoftware (Tabelle der Materialien) jeden Multiplex anhand einer fluoreszierenden falschen Farbe.
      HINWEIS: Ein klares Bild sollte jede Markierung deutlich zeigen. Wenn ein Marker diffus und körnig aussieht oder nicht vorhanden ist, funktioniert der Marker wahrscheinlich nicht und muss erneut optimiert werden.
    3. Bewerten Sie mit der Analysesoftware jedes Multiplex nach Pathologieansicht. Die Pathologieansicht bestätigt die Spezifität jedes Markers. Vergleichen Sie mit IHC zuvor optimiert (Abschnitt 1).

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Representative Results

Der gesamte Prozess der Erlangung eines 7-Farben-Multiplex-Assays folgt einem sich wiederholenden Muster. Abbildung 1 beschreibt den Prozess in einer schemamatischen Form. Sobald die Dias geschnitten und getrocknet oder aus dem Labor empfangen und in einem Hybridisierungsofen bei 60 °C für 1 h gebacken werden, dann gehen Sie zur Deparaffinierung und Rehydrierung, fixieren Sie die Dias in Formalin wieder, gefolgt von Antigen-Retrieval. Jede Multiplexing-Runde beginnt bei der Antigenabrufung und endet bei der Antikörperentfernung (Abbildung 1).

Die Optimierung jedes Schritts im Prozess ist von größter Bedeutung, um ein klares und verwendbares Image zu erhalten. Antikörper sollten zuerst von IHC unter Verwendung von Antigen-Retrievalpuffern mit pH 6 und pH 9 für jeden Antikörper getestet werden, um zu visualisieren, welcher Antigen-Abrufpuffer am besten mit diesem speziellen Antikörper funktioniert. Im Allgemeinen reagieren kerntechnische Ziele auf Antigenabruf mit Puffer pH 9. Beispielsweise funktioniert FOXP3 am besten, wenn der Antigen-Abrufpuffer von pH 9 im Gegensatz zu CD3 verwendet wird, was am besten mit dem Antigen-Abrufpuffer von pH 6 funktioniert. Bilder aus dem IHC-Prozess sollten verwendet werden, um die Spezifität der Multiplex-Analyse zu validieren.

Ein Monoplex ist notwendig, um die Reihenfolge jedes Antikörpers im Multiplex zu bestimmen. Bei Verwendung eines 4- oder 7-Farben-Kits hat jeder Antikörper eine bevorzugte Reihenfolge im Array. Für die Anzahl der Antikörper, die verwendet werden, sammeln Sie die entsprechenden Kontrollfolien (d. h. für ein 7-Farben-Multiplex, bei dem eine Farbe DAPI ist, wählen Sie 6 gewebespezifische repräsentative Kontrollfolien für die 6 anderen Fluorophore aus). Abbildung 2 A-C ist eine schematische Darstellung eines Monoplex-Assays mit 3 Dias mit FFPE-Darmkrebsgewebe. Jede Folie hat FOXP3 an einer anderen Position im Array mit Fluorophor 570 als Tag. DAPI wird als Gegenfleck verwendet, um Kerne angemessen zu visualisieren. In Abbildung 3werden repräsentative Bilder eines Monoplexs und eines Multiplexs mit unterschiedlicher FOXP3-Position dargestellt. In Abbildung 3A,B, wo FOXP3 an dritter Stelle steht (entsprechend der Reihenfolge in Abbildung 2C),wird eine spezifische und robuste Färbung von FOXP3 (rot) durch helle Kernfärbung enden Abbildung 3A und Kolokalisierung mit CD3 Abbildung 3B. Die Fluorophorsignalintensität bestätigt die Spezifität von FOXP3 ohne unspezifische Färbung an anderer Stelle im Gewebe Abbildung 3A. In Abbildung 3C, wo FOXP3 an der ersten Position steht (entsprechend der Reihenfolge in Abbildung 2A), gibt es eine unspezifische Färbung von FOXP3. Kornige diffuse Bereiche von rot decken den größten Teil des Dias und fluoreszierende Intensität in diesen Bereichen sind weniger als 1. Der Versuch, einen Multiplex zu tun, ohne zuerst ein Monoplex zu vervollständigen, um die Reihenfolge der Färbung zu testen, führt zu einem ähnlichen Ergebnis und verschwendet Reagenzien. Ein weiterer kritischer Schritt, der im Multiplexprozess nicht übersehen werden kann, ist die DAPI-Färbung. Ein funktionierender DAPI-Gegenfleck ist die Basis für die Zellidentifikation und weitere räumliche Analyse mit der Analysesoftware. Ein wichtiger Kontrast ist im zusammengesetzten Bild mit der arbeitenden DAPI (blau) in Abbildung 3E und in der nicht funktionierenden DAPI in Abbildung 3Fzu sehen. Das Bild in Abbildung 3F konnte nicht verwendet werden, um Zellen in der Analysesoftware zu identifizieren. Ein Versuch, das Multiplex und die Gewebeanalyse zu retten, der Deckslip möglicherweise entfernt, indem die Rutsche in TBST gefolgt von einem Mikrowaving Schritt in pH 6 Antigen-Retrieval-Puffer mit einer zusätzlichen Anwendung von DAPI.

Sobald der Monoplex-Assay abgeschlossen und die optimale Antikörperreihenfolge bestätigt ist, kann eine Multiplex-Strategie aufgebaut werden Abbildung 4. Für jedes Ziel muss ein anderes Fluorophor gewählt werden. Die Zahl, die mit jedem Fluorophor verbunden ist, stellt ungefähr die spektrale fluoreszierende Wellenlänge dar, die nach anregung emittiert wird, ähnlich wie die Durchflusszytometrie. Bei der Abstimmung der vorgeschlagenen Antikörper mit Fluorophoren ist darauf zu achten, dass spektrale Überlappungen und mögliche Blutungen von Markern begrenzt werden. Eine gute Strategie ist es, Wellenlängen weit voneinander entfernt für die Kolokalisierung von Antikörpern zu wählen, um überschüssige Spektralüberlappung zu reduzieren, die ein gestochen scharfes Bild und zuverlässigere Phänotypisierung13bietet. In der angezeigten Multiplexstrategie (Abbildung 4) wird CD8 beispielsweise mit Fluorophor 570 gekoppelt, während CD3 mit Fluorophor 520 gekoppelt ist. Man sollte die Verwendung von Fluorophor 540 und 570 in ko-lokalisierten Zielen vermeiden, da diese in der Regel die unkrimiantsten sind und die Ergebnisse beeinträchtigen können. Fluorophor 620 neigt dazu, sehr hell zu sein und sollte für Antikörper verwendet werden, die nicht reichlich im Gewebe vorhanden sind. Eine neuere Bibliothek, die als Referenz für jedes Fluorophor verwendet wird, hilft auch bei der Verringerung der spektralen Überlappung von Fluorophoren. Eine leere Folie, die alle Runden des Antigen-Abrufs durchläuft, ist notwendig, um die Autofluoreszenzextraktion aus dem zusammengesetzten Bild sicherzustellen. Dieser Blindschlitten wird der gleichen Behandlung unterzogen wie die Multiplex-Dias, außer anstelle eines funktionierenden Primärantikörpers und Fluorophors werden das Antikörperverdünnungsmittel und das Fluorophorverdünnungsmittel bzw. Abbildung 4Bverwendet.

Um sicherzustellen, dass das Multiplex-Design ordnungsgemäß funktioniert und die Marker, die im zusammengesetzten Bild zu sehen sind, spezifisch sind, verwenden Sie das "Pathologiebild" in Kombination mit der Einstellungsoption "Hellfeld" mit Mikroskopsoftware, die ein faux IHC-Bild erzeugt, das dann im Vergleich zu den früheren IHC-Assays, die in Abschnitt 1 erörtert wurden. Leider spiegeln schöne zusammengesetzte Bilder nicht unbedingt einen genauen Fleck wider und dies ist ein wichtiger Schritt zur Qualitätskontrolle des Prozesses und zur Vermeidung falsch positiver Ergebnisse. Abbildung 5A zeigt ein zusammengesetztes Bild ohne anfängliche Bedenken. CD3 ist visualisiert und zeigt spezifische Färbung (grün) und wird durch die Pathologie Hellfeldbild in Abbildung 5Bbestätigt. CD163 (orange) ist im zusammengesetzten Bild zu sehen (Abbildung 5A); Bei der Bewertung der pathologiehellen Feldansicht von CD163 (Abbildung 5C) ist der Antikörper jedoch unspezifisch. Ein Beispiel für ein optimales Multiplexbild mit spezifischer Färbung wird in einem zusammengesetzten Bild gezeigt (Abbildung 5D). Die Spezifität von CD3 und CD163 wird mit pathologischen Hellfeld-Ansicht bestätigt (Abbildung5E bzw. Abbildung 5F)und vergleicht sich günstig mit früheren IHC-Assays, die mit diesen Antikörpern durchgeführt wurden (nicht gezeigt).

Figure 1
Abbildung 1: Befleckungs-Workflowdiagramm.
Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Entwicklung von Monoplex.
(A) Darmkrebsrutsche mit FOXP3 an Position 1. (B) Darmkrebsrutsche mit FOXP3 an Position 2. (C) Darmkrebsrutsche mit FOXP3 an Position 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erfolge und Fallstricke von Monoplex und Multiplex.
(A) Monoplex-Assay des primären Dickdarmkrebses mit FOXP3 an Position 3, fluoreszierendes Intensitätsetikett gezeigt. (B) Multiplex-Assay von primärem Dickdarmkrebs mit FOXP3 an Position 3 und CD3 an Position 2. (C) Monoplex-Assay von primärem Dickdarmkrebs mit FOXP3 an Position 1, fluoreszierendes Intensitätsetikett gezeigt. (D) Multiplex-Assay von primärem Dickdarmkrebs mit FOXP3 an Position 1 und CD3 an Position 2. (E) Multiplex-Assay von primärem Dickdarmkrebs in der Reihenfolge der Antikörper wie folgt: CD8 (gelb), CD3 (grün), CD163 (orange), Pancytokeratin (weiß), PD-L1 (Magenta), FOXP3 (rot), Arbeits-DAPI (blau). (F) Multiplex-Assay von primärem Dickdarmkrebs in der Reihenfolge der Antikörper wie folgt: CD8 (gelb), CD3 (grün), CD163 (orange), Pancytokeratin (weiß), PD-L1 (Magenta), FOXP3 (rot), nicht funktionierende DAPI (blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Multiplex-Entwicklung.
(A) Multiplex-Dia von Dickdarmkrebs in einem 7-Farben-Multiplex. (B) Leere Folie in einem 7-Farben-Multiplex mit Darmkrebsgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Analysieren der Spezifität eines 7-Farben-Multiplex.
(A) Multiplex-Composite-Bild mit Antikörpern wie folgt: CD8 (gelb), CD3 (grün), CD163 (orange), Pancytokeratin (weiß), Ki67 (rot), DAPI (blau). (B) Pathologie hellfeldansicht des Bildes in Panel A auf CD3 nur Ansicht. (C) Pathologie Hellfeldansicht des Bildes in Panel A auf CD163 nur Ansicht. (D) Multiplex-Composite-Bild mit Antikörpern wie folgt: CD8 (gelb), CD3 (grün), CD163 (orange), Pancytokeratin (weiß), PD-L1 (Magenta), FOXP3 (rot), DAPI (blau). (E) Pathologie hellfeldansicht des Bildes in Panel D auf CD3 nur Ansicht. (F) Pathologie Hellfeldansicht des Bildes im Panel D auf CD163 nur Ansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Intakte Gewebeproben aus der soliden Tumorbiopsie und der chirurgischen Resektion bleiben wichtige diagnostische und prädiktive Werkzeuge für die Krankheitsanalyse sowie patientenprognose. Multiplex fluoreszierende Immunhistochemie (mfIHC) ist eine neuartige Technik, die die Vorteile der Immunhistochemie (IHC), der Immunfluoreszenz (IF) und der Durchflusszytometrie kombiniert. Frühere Methoden zur Untersuchung von Zellen vor Ort haben die Auswertung der Zell-zu-Zell-Anordnungen in einer Gewebeumgebung8ermöglicht, jedoch begrenzt die geringe Anzahl von Epitopen, die untersucht werden können, komplexe Analysen. Die Durchflusszytometrie ist zwar nützlich bei der Analyse vieler Zelltypen in einer Probe, verliert aber den räumlichen Kontext, da Proben als Einzelzellsuspension vorbereitet werden9,10. mfIHC überbrückt diese Techniken, indem es den räumlichen Kontext der zellulären Mikroumgebung beibehält und die Anzahl der Epitope erhöht, die beschriftet werden können, während das Signal pro beschrifteten Epitop11verstärkt wird. Frühere Forschungen haben mfIHC für die Phänotypisierung des zellulären Infiltrats bei Krebs und Nicht-Krebs-Gewebeproben1,2,3,4,5,15. Post-Bild-Analyse wurde auch verwendet, um räumliche Beziehungen von Zellen und Strukturen innerhalb der Gewebe-Mikroumgebung1,2,4zu analysieren. Für eine zuverlässige Analyse muss zunächst ein spezifisches und genaues Bild erstellt werden. Die manuelle Färbetechnik ermöglicht im Gegensatz zu einem automatisierten Färbesystem kleineren und kostenbewussten Laboratorien den Zugang zu dieser Technologie. Optimierungszeit und Färbezeit gehören zu den größten Hindernissen, um ein zuverlässiges Bild für weitere räumliche Analysen zu erhalten.

Mehrere allgemeine Regeln erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Generierung eines zuverlässigen zusammengesetzten Multiplexabbilds und sparen Zeit und Ressourcen. Antikörper, die im Multiplex verwendet werden sollen, sollten auf der Grundlage des Erfolgs mit manuellen konventionellen IHC gewählt werden. Antigen-Retrievalpuffer mit pH 6 und pH 9 sollten für IHC verwendet werden, um den geeigneten Antigen-Retrieval für den Einsatz im Multiplex zu untersuchen. Die Monoplex-Entwicklung ist notwendig, um die Platzierung von Antikörpern innerhalb des Multiplexing-Protokolls zu identifizieren. Die Begründung dafür ist kompliziert und variiert zwischen Gewebeproben und Epitopen. In einigen Fällen kann das Epitop mit mehreren Mikrowaving-Schritten abgebaut werden und die Marker-Visualisierung geht verloren, wie dies bei CD3 häufig der Fall ist. FOXP3 wird jedoch mit mehr Mikrowaving-Schritten heller und ist kaum sichtbar, wenn es bei der ersten oder zweiten Runde von Multiplex13,14platziert wird.

Der Färbevorgang beginnt mit FFPE-Gewebe, das auf geladene Dias geschnitten wird. Das erste Problem, das auftreten kann, ist das Gewebe, das nach dem Microwaving von der Rutsche fällt. Wenn geladene Dias nicht verwendet werden, ist die Haftung des Gewebes an der Glasoberfläche begrenzt und das Gewebe wird entweder übermäßig gefaltet oder kann vollständig abrutschen. Um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Färbevorgangs an den Dias haftet, werden mehrere Techniken durchgeführt. Zuerst beim Schneiden der Blöcke auf Rutschen, die reinste Form von Wasser funktioniert am besten. Für einige Laboratorien mag entionisiertes Wasser ausreichen, aber destilliertes Wasser hat am besten funktioniert. Die Dias sollten sofort nach dem Schneiden bei 37 °C über Nacht flach getrocknet werden. Um die Haftung weiter zu gewährleisten, werden die Dias dann kurz vor Gebrauch in einen Hybridisierungsofen gelegt und bei 60 °C flach gebacken. Obwohl die Formalinfixierung bereits während des anfänglichen Gewebevorbereitungsprozesses aufgetreten ist, erhöht die Platzierung der Dias in neutral gepuffertem Formalin für 30 min nach dem Deparaffinierungs- und Rehydratationsprozess die strukturelle Integrität des Gewebe1,13.

Der manuelle Färbevorgang kann je nach Anzahl der eingesetzten Antikörper bis zu drei, 8 Stunden dauern. Die Vermeidung von Fallstricken ist wichtig, um Zeit zu sparen und Reagenzien zu schonen. Der erste häufige Fehler tritt häufig bei der Reagenzienzubereitung auf. Wasser unterscheidet sich zwischen Laboratorien und kann der einzige Unterschied in den Ergebnissen von einem Labor zum nächsten sein. Die Verwendung der gleichen sowie einer sauberen Wasserquelle für alle Reaktionen und Reagenzien sorgt für ein konsistentes Ergebnis. Die Antikörper, blockierenden Lösung und Fluorophore funktionieren am besten bei Raumtemperatur. Um Fallstricke bei der Reagenz- und Arbeitslösungsvorbereitung zu vermeiden, verwenden Sie für alle Reagenzien dasselbe Wasser. Verwenden Sie auch alle Arbeitslösungen und Reagenzien bei Raumtemperatur.

Die Fehlerbehebung von mfIHC ist wichtig und die Einhaltung strenger Laborrichtlinien, die entscheidend sind, um die Kontamination von Komponenten und/oder Bedienerfehlern zu begrenzen. Die Produktion suboptimaler Bilder verzerrt die Ergebnisse und führt zu falschen positiven und negativen Zellpopulationen, die sich negativ auf Daten auswirken können. Da die ultimative Analyse in der Regel computergenerierte Phänotypen auf der Grundlage von maschinellem Lernen umfasst, können kleine Fehler bei der Färbung vergrößert werden, um den gesamten Datensatz zu beeinflussen. Obwohl z. B. alle Flecken perfekt funktionieren, verhindert ein Fehler oder eine Auslassung von DAPI die zukünftige Zellsegmentierung und das Zählen, wodurch das Experiment nutzlos wird. Analysesoftware verwendet DAPI-Färbung nicht nur, um Zellen zu identifizieren, sondern weist jeder Zelle x- und y-Koordinaten zu, und wenn das Multiplex eine dimierte, schlecht umschriebene oder diffuse DAPI-Färbung aufweist, kann das Bild nicht weiter verwendet werden und das Multiplex muss neu oder versucht werden. Rettung und Erneutfärbung von DAPI. Die Verwendung von Softwarekomponenten wie Pathologie und Hellfeldansichten wird das Vertrauen in Empfindlichkeit und Spezifität zu einem frühen Beginn des Optimierungsprozesses erhöhen und Fehler frühzeitig im Multiplexprozess verhindern.

Die modifizierenden Aspekte des Bildgebungsprozesses können auch bei der Bildoptimierung helfen. Beispielsweise hilft die Verwendung eines Bildes, das DAPI als visuelle Hilfe zum Fokussieren verwendet, verschwommene Bilder zu vermeiden. Das Hinzufügen der neu erstellten Fluorophorbibliothek zur Software stellt ein sauberes Bild und eine geringere spektrale Überlappung jedes Fluorophors während der Analysephase sicher, und die Verwendung des leeren Dias zum Extrahieren der Autofluoreszenz intensiviert die Marker und verbessert das Bild. qualität.

Die Verwendung von Gewebeproben hat und bleibt ein wesentliches Werkzeug bei der Untersuchung der Pathophysiologie von Krankheiten. Die neue Technologie hat unser Verständnis von Zell-zu-Zell-Interaktionen verbessert und mfIHC ist ein vielversprechender neuer Player. Optimierung und Genauigkeit während des Färbeprozesses in dieser Technik ist für die ordnungsgemäße Nutzung und weitere Analyse von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von größter Bedeutung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Ed Stack, zuvor von Perkin Elmer, für seine Unterstützung bei der Einrichtung und Optimierung der originalen Multiplexfärbung. Die Autoren danken auch Kristen Schmidt von Akoya Biosciences für Tipps mit der Analysesoftware. Die in dieser Publikation berichteten Forschungsergebnisse wurden von den National Cancer Institutes of Health unter der Award-Nummer P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Weitere Unterstützung wurde von Jeffery A. Colby Colon Cancer und Tom Liu Memorial Research Funds geleistet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher HC8001GAL
70% ethanol Fisher HC10001GL
95% ethanol Fisher HC11001GL
Analysis software Akoya Biosciences CLS135783 inForm version 2.3.0
Antifade mountant ThermoFisher P36961 ProLong Diamond
Blocking solution Vector SP-6000 Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Life Sciences A9647-100G
Cover Slips Fisher 12-548-5E
Delicate task wipe Kimberly-Clark 34120
Fluorescent diluent Akoya Biosciences ARD1A01EA Opal TSA diluent
Fluorophore 520 Akoya Biosciences FP1487001KT 1:100
Fluorophore 540 Akoya Biosciences FP1494001KT 1:100
Fluorophore 570 Akoya Biosciences FP1488001KT 1:100
Fluorophore 620 Akoya Biosciences FP1495001KT 1:100
Fluorophore 650 Akoya Biosciences FP1496001KT 1:100
Fluorophore 690 Akoya Biosciences FP1497001KT 1:100
Fluorophore DAPI Akoya Biosciences FP1490 3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box Tissue-Tek 25608-904 Plastic slide box-green
Humidified Chamber Ibi Scientific AT-12
Hybridization oven FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen Vector H-4000 ImmEdge
Microscope Perkin Elmer CLS140089 Mantra quantitative pathology workstation
Microwave Panasonic NN-A661S with inverter technology
Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4 10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR600 AR6
pH 9 antigen retrieval buffer Akoya Biosciences AR900 AR9
Phosphate buffered saline Fisher BP3994 PBS
Plastic slide box Tissue-Tek 25608-906
Plastic wrap Fisher NC9070936
Polysorbate 20 Fisher BP337-800 Tween 20
Primary antibody CD163 Lecia NCL-LCD163 1:400
Primary antibody CD3 Dako A0452 1:400
Primary antibody CD8 Spring Bio M5390 1:400
Primary antibody FOXP3 Dako M3515 1:400
Primary antibody pancytokeratin Cell Signaling 12653 1:500
Primary antibody PD-L1 Cell Signaling 13684 1:200
Secondary antibody Akoya Biosciences ARH1001EA Opal polymer
Slide stain set Electron Microscopy Sciences 6254001
Tris buffered saline Corning 46-012-CM TBS
Vertical slide rack Electron Microscopy Sciences 50-294-72
Xylene Fisher X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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