多尾根结鱼巨噬细胞的快速隔离

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

在这里,我们提出了一个机械分离协议,以快速分离巨噬细胞从背根结条,用于方位和功能分析。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

研究周围神经损伤后背根神经痛的背根神经瘤的免疫细胞和感觉神经元之间的分子和细胞相互作用的兴趣越来越大。外周单细胞,包括巨噬细胞,已知通过噬菌体、抗原表达和细胞因子释放对组织损伤作出反应。新出现的证据已经牵连到背根神经性巨噬细胞对神经损伤背景下的神经病痛发展和斧道修复的贡献。快速的声叫(或"快速隔离"),背根神经质噬细胞在神经损伤的情况下的反应需要识别未知的神经免疫因素。在这里,我们演示了我们的实验室如何使用无酶的机械解离方案快速有效地从背根结节分离巨噬细胞。样品一直保存在冰上,以限制细胞压力。与标准酶协议相比,该协议的耗时要少得多,并常用于荧光激活细胞分拣分析。

Introduction

现在有相当多的证据表明,免疫细胞在外周神经损伤1,2后造成神经病变疼痛。外周单细胞,包括成熟的巨噬细胞,已知通过噬菌体、抗原表达和细胞因子释放对组织损伤和全身感染作出反应。平行神经损伤引起的微胶质激活在脊髓背角,巨噬细胞在背根神经神经损伤(DRG)后也显著扩大后神经损伤3,4。值得注意的是,有越来越多的兴趣,以确定宏噬细胞是否有助于神经病变后,周围神经损伤后,与感觉神经元在DRG 5,6,7相互作用8,9,10,11.此外,最近的研究也涉及DRG巨噬细胞在神经损伤12、13后对斧道修复的贡献。另一项研究进一步表明,巨噬细胞亚群(即CD11b+Ly6CHi和CD11b+Ly6C低/-细胞)在机械超敏14中可能扮演不同的角色。因此,在神经损伤的情况下快速对DRG巨噬细胞的反应进行表示,可以帮助我们识别导致神经病痛的神经免疫因素。

按照惯例,在DRG中分离巨噬细胞的协议涉及多个步骤,包括酶消化15,16。该技术通常非常耗时,对于大规模实验来说可能成本高昂。虽然温和的消化与胶原酶II型(4毫克/mL)和消血酶II型(4.7毫克/mL)20分钟建议之前15,可以想象,细胞后暴露于这种酶是容易细胞损坏或细胞死亡,这可能导致低产量。此外,酶质量的差异可能进一步影响这一过程的效率。更重要的是,暴露于酶消化的巨噬细胞可能被无情地刺激,因此可能与体内状态非常不同。这些变化可能使功能性研究的结果复杂化。

在这里,我们描述了一种无酶协议,利用机械解散在4°C下快速分离DRG巨噬细胞。样品保存在冰上,以限制细胞压力。因此,我们的方法提供了保持隔离一致性的优势,并且分离的细胞可能更健康,刺激更少。我们进一步提出证据,通过荧光激活细胞分拣(FACS)分析验证分离细胞的质量。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有动物实验均获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准,并根据NIH《实验室动物护理和使用指南》进行。

1. 从实验鼠身上收集腰椎DRG

  1. 在开始实验之前,通过将 9 卷介质与 1 卷 Ca+/Mg=-10x HBSS 混合,准备密度梯度介质(例如 Percoll)的工作溶液。把它放在冰上
  2. 用2.5%的Avertin麻醉小鼠。确认动物完全麻醉,由于缺乏对后爪捏的反应。
    注:使用6-8周为公的小鼠和雌性小鼠。
  3. 将小鼠与预冷却 1x PBS 的 10 mL 进行透心。
    1. 将鼠标放在软着的位置上,用四个爪子将胶带固定在化学烟气罩内。用钳子将肋骨笼下面的皮肤抬起,用手术剪刀做一个小切口,露出肝脏和隔膜。
    2. 继续用剪刀切割隔膜和肋骨笼,打开胸腔,露出跳动的心脏。
    3. 用虹膜剪刀快速切割右心房附属件。一旦注意到出血,将一根30G的针头插入左心室的后端,然后缓慢地注射10 mL的预冷冻1x PBS,以渗透动物。
  4. 对放置在易发位置的鼠标执行背膜切除术15。
    注:如果计划进行细胞培养,在切口前用70%乙醇喷洒小鼠,并使用预消毒手术器械进行解剖。
    1. 使用大小 11 手术刀使一个纵向横向深切口从胸腔区域开始到骨部区域。用剪刀去除皮肤,露出背肌层。
    2. 使用弗里德曼-皮尔森龙剥离结缔组织和肌肉,直到腰椎过程和双边横向过程暴露。
    3. 使用 Noyes Spring 剪刀小心地打开背脊柱,然后切换到弗里德曼-皮尔森龙骨,以暴露脊髓与完整的脊髓连接。
  5. 仔细解剖侧和反向腰椎DRG(L4/L5 DRG在我们的研究中),并将其放入1mL的冰冷的Ca+/Mg=--无1xHBSS在一个Dounce组织均质器。现在,组织已准备好执行步骤 2。
    注:如果可能的话,修剪连接到DRG的脊髓神经。

2. 从小鼠腰椎DRG中分离单个细胞

  1. 在滴同质器中用松散的害虫使DRG组织同质化20-25次。
  2. 将无菌 70 μm 尼龙细胞滤网放入无菌 50 mL 锥形管中。用800 μL的冰冷1x HBSS湿细胞过滤器,在锥形管中收集流过。
  3. 使用移液器从均质器中收集均质组织悬浮液,并通过湿 70 μm 尼龙细胞滤网进入 50 mL 锥形管。
  4. 用800 μL的冰冷1x HBSS冲洗均质器两次,然后放入同一个50 mL锥形管,用细胞过滤器提高产量。
  5. 将1.5 mL的平衡冰冷等分密度梯度介质(在步骤1.1中制备)加入无菌5-mL聚苯乙烯FACS管中。
  6. 将细胞均质从 50 mL 锥形管(步骤 2.4)转移到 FACS 管中,通过上下移液与密度梯度介质很好地混合。添加额外的 500 μL 的 1x HBSS 以密封顶部。
  7. 在4°C下,在800 x g下通过离心将细胞进行20分钟的离心。
  8. 小心地吸出含有骨髓素的上清液,而不会干扰FACS管底部的细胞颗粒。
  9. 在PBS或FACS缓冲液中重新悬浮含有5%胎儿牛血清(FBS)的细胞,用于FACS分析。
    注: 一只鼠标的 L4 /L5 DRG 至少需要 50,000 到 100,000 个细胞。
    1. 在含有5%胎儿牛血清的PBS的100μL中重新悬浮机械分离的DRG细胞(L4/L5),然后用β-小鼠CX3CR1-APC抗体(1:2,000)在黑暗中在4°C下孵育1小时。
    2. 用5mL的PBS清洗细胞一次;在4°C下将细胞离心8分钟,360 x g。
    3. 吸气上清液,然后在300μL的PBS中重新悬浮细胞颗粒,用于FCAS分析。如果计划对单元格进行排序,请改为在 FACS 缓冲区中重新挂起单元格。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

为了验证分离的细胞,我们首先选择了巨噬细胞Fas诱导凋亡(MAFIA)转基因小鼠17。此行表示在CSF1受体(CSF1R)的启动子(CSF1R)的调控下,一种药物诱导的FK506结合蛋白(FKBP)-Fas自杀融合基因和绿色荧光蛋白(eGFP),这种蛋白在巨噬细胞和微胶质中具体表达。系统注射FK结合蛋白二聚体,AP20187(AP),诱导表达转基因的细胞凋亡。EGFP的表达还允许我们监测DRG中的巨噬细胞。为了消耗MAFIA小鼠的巨噬细胞,我们开始我们的研究,每天注射3次AP(1毫克/千克)。上次注射后,对DRG进行GFP免疫染色切片。与VEH处理小鼠相比,我们在AP处理小鼠的DRG中记录了GFP+细胞的显著损失(图1A-B)。在另外一项实验中,我们使用该协议在治疗后机械地分离DRG巨噬细胞。随后的FACS分析表明,AP处理小鼠的GFPhi群(图1C-D)成功耗尽,并证明了分离细胞的高质量。

我们还对野生型小鼠的分离DRG细胞进行特征描述。机械分离的DRG细胞(L4/L5)被β-小鼠CX3CR1-APC抗体染色。我们发现,6%的DRG细胞是CX3CR1+巨噬细胞(图2A-B)。还评估了与未存活细胞的细胞内DNA结合的碘化钠(最终浓度为2.5微克/毫升),表明80%以上新分离的DRG细胞是可行的(图2C-D)。

Figure 1
图1:AP治疗后MAFIA小鼠DRG的巨噬细胞FACS分析。
在分析前3天,MAFIA小鼠每天接受1mg/kg AP20187(AP)或车辆(VEH)的腹内注射。(A, B)在第三次AP治疗后,显示L4/L5 DRG中GFP+(绿色)巨噬细胞的AP诱导消耗的代表性免疫染色图像。NF200(蓝色)用于标记骨髓神经元。刻度条: 50 μm。(C, D)通过FACS分析,确定了L4/5 DRG机械分离后的CSF1R-GFP细胞百分比,并显示了三个独立实验中的代表性数据集,并显示了所示的封闭细胞群的百分比。结果表明,从VEH处理动物DRG中分离出的细胞中,有4%为GFP巨噬细胞。相比之下,在AP处理小鼠中,只有0.4%的DRG细胞是GFP巨噬细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:野生型小鼠DRG中巨噬细胞的FACS表征。
A, B)天真的野生型小鼠的益边L4和L5 DRG被汇集在一起进行机械解散。通过 FACS 分析 (A) 测量 CX3CR1+巨噬细胞百分比。CX3CR1+细胞的浇注基于使用APC共偶型对照抗体(B)孵育的细胞的背景荧光。(C, D)用碘化钠(PI)染色评估新分离的DRG细胞的细胞活力。PI+细胞 (C) 基于未染色细胞 (D) 的背景荧光进行封闭。显示了来自三个独立实验的代表性数据集,其中显示了所示的封闭细胞群的百分比。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

在这里,我们介绍了一种新方法,有效地丰富了从小鼠DRG分离的巨噬细胞。分离DRG免疫细胞的传统方法需要酶消化15,18,现在在我们的协议中用机械均质代替,以限制不需要的细胞损伤,提高产量。因此,新协议省时少得多。更重要的是,酶消化可以刺激巨噬细胞并改变分子特征。相比之下,我们的机械方法极大地限制了细胞压力。

利用FACS分析,我们进一步对分离的DRG细胞中的巨噬细胞进行了特征分析,并展示了一种很好的细胞恢复。根据该协议,超过80%的分离的DRG细胞被发现是可行的(图2D)。一只鼠标的L4 /L5 DRG预计至少50,000到100,000个细胞。因此,我们可以自信地得出结论,DRG细胞可以进一步分类到巨噬细胞亚群14培养或RNA分离。但是,有几个关键步骤可能会影响产量。如果注意到不满意的细胞产量,则应怀疑步骤 2.1 中不充分或过度的同质化。使用PI(图2)或7-AAD染色评估的细胞死亡程度可用于优化协议。此外,步骤 1.4 中的 DRG 解剖可能需要初学者反复练习。

目前,我们的实验室主要使用该协议来研究DRG巨噬细胞。很可能,该协议的应用可以扩展到研究DRG中的其他非神经元细胞,如卫星细胞19和T细胞20。需要进一步的研究来确认细胞分离的有效性。不幸的是,我们目前的机械分离方法不是分离DRG感觉神经元的理想,酶消化仍然是感觉神经元分离最有效的方法15。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者声明没有与这份手稿相关的相互竞争的财务利益。

Acknowledgments

这项研究得到了麻醉教育与研究基金会(XY)的支持;UCSF麻醉和围手术期护理部(XY);和 1R01NS100801-01 (GZ)。这项研究部分得到了HDFCCC细胞分析共享资源实验室的一部分支持,得到了NIH(P30CA082103)的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AP20187 Clontech 635058
α-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354, (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19, (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184, (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8, (1), 1778 (2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22, (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17, (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86, (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130, (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158, (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35, (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112, (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2, (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75, (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7, (1), 16460 (2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21, (5), 518-523 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics