Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

Neuroscience

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Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo mecânico da dissociação para isolar ràpida macrófagos do gânglio dorsal da raiz para o fenotipagem e a análise funcional.

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Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

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Abstract

Há interesses crescentes para estudar as interações moleculares e celulares entre as células imunes e os neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal após lesão do nervo periférico. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos, são conhecidas por responder a uma lesão tecidual por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. A evidência emergente implicou a contribuição de macrófagos dorsais do gânglio da raiz ao desenvolvimento neuropática da dor e ao reparo axonal no contexto de ferimento do nervo. Rapidamente fenotipagem (ou "isolação rápida de") a resposta de macrófagos dorsais do gânglio da raiz no contexto da lesão de nervo é desejada identificar os fatores neuroimune desconhecidos. Aqui nós demonstramos como nosso laboratório isola ràpida e eficazmente macrófagos dos gânglios da raiz dorsal usando um protocolo mecânico enzima-livre da dissociação. As amostras são mantidas no gelo por toda parte para limitar o stress celular. Este protocolo é muito menos demorado comparado ao protocolo enzimático padrão e foi usado rotineiramente para nossa análise fluorescência-ativada da classificação de pilha.

Introduction

Há agora uma evidência considerável que as pilhas imunes contribuem à dor neuropática que segue a lesão periférica do nervo1,2. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos maduros, são conhecidas por responder a lesões teciduais e infecção sistêmica por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. Paralelamente à ativação de microglia induzida por lesão nervosa no Corno dorsal espinhal, os macrófagos nos gânglios da raiz dorsal (DRG) também se expandem significativamente após a lesão nervosa3,4. Notavelmente, háinteresses crescentes para determinar se os macrófagos contribuem para o desenvolvimento da dor neuropática após lesão nervosa periférica, interagindo com neurônios sensoriais no DRG5,6,7, 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11. Além disso, estudos recentes também implicam a contribuição dos macrófagos DRG no reparo axonal após lesão nervosa12,13. Outro estudo sugere ainda que as subpopulações de macrófago (i.e., CD11b+Ly6CHi e CD11b+Ly6CLow/- Cells) podem desempenhar um papel diferente na hipersensibilidade mecânica14. Conseqüentemente, ràpida fenotipagem a resposta de macrófagos de DRG no contexto da lesão do nervo pode ajudar-nos a identificar os fatores neuroimune que contribuem à dor neuropática.

Convencionalmente, o protocolo para isolar macrófagos no DRG envolve múltiplas etapas, incluindo a digestão enzimática15,16. A técnica é muitas vezes demorada e pode ser dispendiosa para experimentos em grande escala. Embora a digestão suave com colagenase tipo II (4 mg/ml) e Dispase tipo II (4,7 mg/ml) por 20 min foi recomendado anteriormente15, é concebível que as células após a exposição a esta enzima são propensos a danos celulares ou morte celular, o que pode levar a baixa Rendimento. Além disso, a diferença na qualidade das enzimas de lote para lote pode impactar ainda mais a eficiência deste processo. Mais importante, os macrófagos expostos à digestão enzimática podem ser estimulados involuntàvelmente e, portanto, podem ser muito diferentes do status in vivo. As alterações podem potencialmente complicar o desfecho do estudo funcional.

Aqui nós descrevemos um protocolo enzima-livre para isolar ràpida macrófagos de DRG em 4 ° c usando a dissociação mecânica. As amostras são mantidas no gelo para limitar o stress celular. Como resultado, nossa abordagem oferece uma vantagem para manter a consistência do isolamento, e as células isoladas são presumivelmente mais saudáveis e menos estimuladas. Nós apresentamos mais a evidência para validar a qualidade das pilhas isoladas com análise fluorescência-ativada do Cell Sorting (FACS).

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da Califórnia em São Francisco e foram conduzidos de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. colete DRG lombar de camundongos experimentais

  1. Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio de gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) misturando 9 volumes do meio com 1 volume de CA+ +/mg+ +-Free 10x HBSS. Mantenha-o no gelo.
  2. Anestesie o rato com 2,5% Avertin. Confirme que o animal está totalmente anestesiado pela falta de resposta à pinça da pata traseira.
    Nota: foram utilizados ratos machos e fêmeas com idades compreendidas entre 6-8 semanas.
  3. Perfuse o rato transcardially com 10 mL de PBS pre-refrigerado 1x.
    1. Coloc o rato na posição supina com as quatro patas fixadas com a fita dentro de uma capa química das emanações. Levante a pele abaixo da caixa torácica pelo fórceps, e faça uma pequena incisão com tesouras cirúrgicas para expor o fígado e o diafragma.
    2. Continue a usar tesouras para cortar o diafragma e a caixa torácica, abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.
    3. Corte rapidamente o Apêndice Atrial direito com tesouras da íris. Uma vez que o sangramento é observado, insira uma agulha de 30 G na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mL de PBS pré-refrigerado 1x para perfuse o animal.
  4. Realize laminectomia dorsal15 no rato colocado na posição prona.
    Nota: se a cultura da célula for planejada, pulverize o mouse com 70% de etanol antes da incisão e use instrumentos cirúrgicos pré-esterilizados para dissecção.
    1. Use um bisturi de tamanho 11 para fazer uma incisões profundas laterais longitudinais a partir da região torácica até a região sacral. Retire a pele pela tesoura para expor a camada dorsal do músculo.
    2. Use Friedman-Pearson Rongeur para descascar fora os tecidos e os músculos conexivos até que os processos Lumbosacral da espinha e os processos transversais bilaterais estejam expostos.
    3. Use uma mola de Noyes Scissor para abrir com cuidado a coluna espinal dorsal, a seguir mude a um Friedman-Pearson Rongeur para remover os ossos vertebrais para expor a medula espinal com os nervos espinais intactos Unidos.
  5. Cuidadosamente dissecado DRG lombar ipsilateral e contralateral (L4/L5 DRG em nosso estudo) e colocá-lo em 1 mL de CA+ +/mg+ +-livre de gelo-1x HBSS em um homogeneizador de tecido dounce. Agora os tecidos estão prontos para o passo 2.
    Nota: aparar o nervo espinhal anexado ao DRG, se possível.

2. isolar células individuais do mouse lombar DRG

  1. Homogeneizar o tecido DRG com um pilão solto no homogeneizador dounce 20-25 vezes.
  2. Coloque um filtro de célula de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL. Molhe o filtro da pilha com 800 μL do gelo-frio 1x HBSS, e o fluxo-através é coletado no tubo cônico.
  3. Colete a suspensão do tecido homogeneizado do homogeneizador usando uma pipeta e passe pelo filtro de células de nylon molhado de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL.
  4. Enxague o homogeneizador duas vezes com 800 μL de gelo-frio 1x HBSS e, em seguida, decantar no mesmo tubo cônico 50 mL com filtro de células para aumentar o rendimento.
  5. Adicionar 1,5 mL de meio de gradiente de densidade isotónica gelado equilibrado (preparado no passo 1,1) num tubo de poliestireno FACS estéril de 5 mL.
  6. Transfira o homogeneizar da pilha do tubo cônico de 50 mL (na etapa 2,4) no tubo de FACS, misture bem com o meio do inclinação da densidade pipetando acima e para baixo. Adicione um adicional de 500 μL de 1x HBSS para selar a parte superior.
  7. Pellet as células por centrifugação em 800 x g por 20 min a 4 ° c.
  8. Aspirar com cuidado o sobrenadante que contem o mielina no meio sem perturbar a pelota da pilha na parte inferior do tubo de FACS.
  9. Ressuscitem as células no tampão PBS ou FACS contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) para análise de FACS.
    Nota: pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um rato.
    1. Ressuscitem as células DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) em 100 μL de PBS contendo 5% de soro bovino fetal e, em seguida, incubar com anticorpo α-mouse CX3CR1-APC (1:2000) no escuro a 4 ° c por 1 h.
    2. Lave as células com 5 mL de PBS uma vez; Centrifugar as células 360 x g durante 8 min a 4 ° c.
    3. Aspirar o sobrenadante, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 300 μL de PBS para análise de FCAS. Se a classificação de célula é planejada, resuspender as células no buffer FACS em vez disso.

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Representative Results

Para validar as células isoladas, primeiro escolhemos os camundongos transgênicos de apoptose induzida por macrófago (MAFIA)17. Esta linha expressa um fármaco-inducible FK506-Binding proteína (FKBP)-FAS suicídio gene de fusão e proteína verde fluorescente (eGFP) o controle do promotor do receptor CSF1 (CSF1R), que é especificamente expressa em ambos os macrófagos e microglia. A injeção sistemática do dimerizer da proteína de ligação de FK, AP20187 (AP), induz o apoptose das pilhas que expressam o transgene. A expressão do EGFP também nos permite monitorar os macrófagos no DRG. Para esgotar os macrófagos nos camundongos da máfia, iniciamos nossos estudos com 3 injeções intraperitoneal diárias de AP (1 mg/kg). Após a última injeção, a DRG foi seccionada para imunocoloração para GFP. Nós registramos uma perda significativa de GFP+ Cells no DRG dos ratos AP-tratados comparados aos ratos Veh-tratados (Figura 1a-B). Em uma experimentação separada, nós usamos este protocolo para dissociar mecanicamente os macrófagos de DRG após o tratamento. A análise subseqüente de FACS revelou uma depleção bem sucedida da população de GFPHi em ratos AP-tratados (Figura 1C-D) e demonstrou a alta qualidade de pilhas isoladas.

Nós igualmente caracterizamos as pilhas isoladas de DRG dos ratos do selvagem-tipo. As pilhas DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) foram manchadas com o anticorpo do α-rato CX3CR1-APC. Verificou-se que 6% das células DRG foram CX3CR1+ macrófagos (Figura 2a-B). A viabilidade celular também foi avaliada com o iodeto de propidium (concentração final de 2,5 μg/ml) que se liga ao DNA intracelular das células não viáveis, revelando que mais de 80% das células DRG recém-isoladas foram viáveis (Figura 2C-D).

Figure 1
Figura 1: análise de FACS de macrófagos no DRG de camundongos MAFIA após tratamento com AP.
Os ratos da máfia receberam a injeção intraperitoneal diária de 1 Magnésio/quilograma de AP20187 (AP) ou do veículo (VEH) por 3 dias antes da análise. (A, B) Imagens de imunocoloração representativas mostrando a depleção induzida por AP de macrófagos GFP+ (verde) no DRG L4/L5 após o tratamento de 3RD AP. NF200 (azul) foi usado para rotular neurônios mielinizadas. Barra de escala: 50 μm. (C, D) As célulasHi por cento CSF1R-GFP após a dissociação mecânica do DRG L4/5 foram determinadas pela análise de FACS, e um conjunto de dados representativos de três experimentos independentes é mostrado com a porcentagem da população de células fechadas indicada. O resultado mostra que 4% das células totais isoladas da DRG de animais tratados com VEH foram macrófagos do GFPHi . Por outro lado, apenas 0,4% das células DRG totais foram macrófagos do GFPHi em camundongo tratado com AP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: caracterização do FACS de macrófagos no DRG dos camundongos do tipo selvagem.
(A, B) Ipsilateral L4 e L5 DRG de rato selvagem-tipo ingênuo foram agrupados para a dissociação mecânica. Os percentuais CX3CR1+ macrófagos foram medidos pela análise de FACS (a). O gating para CX3CR1+ Cells foi baseado na fluorescência do fundo nas pilhas incubadas com o anticorpo do controle do ISOTIPO de APC-conjugated (B). (C, D) A viabilidade celular de células DRG recém-isoladas foi avaliada com coloração de iodeto de Propiídio (PI). As células PI+ (C) foram fechadas com base na fluorescência de fundo nas células não manchadas (D). Um conjunto de dados representativos de três experimentos independentes é mostrado com a porcentagem da população de células fechadas indicada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui nós introduzimos um método novo para enriquecer eficazmente macrófagos isolados do rato DRG. A abordagem convencional para isolar as células imunes do DRG requer digestão enzimática15,16, queagora é substituída por homogeneização mecânica em nosso protocolo para limitar os danos celulares indesejados e aumentar o rendimento. Portanto, o novo protocolo é muito menos demorado. Mais importante, a digestão da enzima pode estimular os macrófagos e alterar a assinatura molecular. Em contrapartida, a nossa abordagem mecânica limita muito o stress celular.

Usando a análise de FACS, nós caracterizamos mais mais os macrófagos nas pilhas isoladas de DRG e demonstraram uma grande recuperação celular. Mais de 80% das células DRG isoladas este protocolo foram encontradas como viáveis (Figura 2D). Pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um mouse. Conseqüentemente, nós podemos confidencialmente concluir que as pilhas de DRG podem mais ser classificadas em subpopulações14 do macrófago para a cultura ou o isolamento do RNA. No entanto, existem algumas etapas críticas que podem impactar o rendimento. Se o rendimento celular insatisfatório for observado, a homogenização insuficiente ou excessiva na etapa 2,1 deve ser suspeitada. A extensão da morte celular avaliada com o PI (Figura 2) ou a coloração 7-AAD pode ser utilizada para otimizar o protocolo. Além disso, a dissecção DRG na etapa 1,4 pode requerer prática repetida para iniciantes.

Atualmente, nosso laboratório usa principalmente este protocolo para estudar os macrófagos DRG. Provavelmente, a aplicação deste protocolo pode ser expandida para estudar outras células não-neuronais no DRG, como células de satélite19e células T20. Novos estudos são necessários para confirmar a eficácia do isolamento celular. Infelizmente, nosso método de dissociação mecânica atual não é ideal para o isolamento de neurônios sensoriais DRG, e a digestão enzimática continua sendo o método mais eficaz para o isolamento do neurônio sensorial15.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes relacionados a este manuscrito.

Acknowledgments

O estudo foi apoiado por: Fundação para a educação e pesquisa em anestesia (XY); o departamento de anestesia e assistência perioperatória (XY) da UCSF; e 1R01NS100801-01 (GZ). Este estudo foi apoiado em parte pelo laboratório HDFCCC para a análise de células recurso compartilhado recursos através de uma subvenção da NIH (P30CA082103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AP20187 Clontech 635058
α-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

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References

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