Rask isolering av rygg rot Ganglion makrofager

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en mekanisk dissosiasjon protokoll for raskt å isolere makrofager fra rygg rot Ganglion for bestemmelse av fenotype og funksjonell analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yu, X., Leff, J., Guan, Z. Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages. J. Vis. Exp. (151), e60023, doi:10.3791/60023 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det er økende interesser for å studere molekylær og cellulære interaksjoner mellom immunceller og sensoriske neurons i rygg roten ganglia etter perifer nerveskader. Perifere monocyttisk celler, inkludert makrofager, er kjent for å svare på en vevsskade gjennom fagocytose, antigenpresentasjon, og cytokin utgivelse. Emerging bevis har innblandet bidraget av rygg rot ganglia makrofager å nevropatisk smerte utvikling og axonal reparasjon i sammenheng med nerveskade. Raskt bestemmelse av fenotype (eller "rask isolering av") responsen av rygg rot ganglia makrofager i sammenheng med nerveskader er ønskelig å identifisere de ukjente neuroimmune faktorene. Her viser vi hvordan laboratoriet vårt raskt og effektivt isolerer makrofager fra rygg roten ganglia ved hjelp av en enzym fri mekanisk dissosiasjon protokoll. Prøvene er holdt på isen hele å begrense mobilnettet stress. Denne protokollen er langt mindre tidkrevende i forhold til standard enzymatisk protokollen og har blitt rutinemessig brukt for vår fluorescens-aktivert Cell sortering analyse.

Introduction

Det er nå betydelige bevis for at immunceller bidrar til nevropatisk smerte etter perifer nerveskader1,2. Perifere monocyttisk celler, inkludert modne makrofager, er kjent for å svare på vevskader og systemisk infeksjon gjennom fagocytose, antigenpresentasjon, og cytokin utgivelse. Parallelt nerve skaden-indusert mikroglia i spinal rygg Hornet, makrofager i rygg roten ganglia (DRG) utvides også betraktelig etter nerveskade3,4. Spesielt er det økende interesser for å avgjøre om makrofager bidrar til nevropatisk smerte utvikling etter perifer nerveskader ved å samhandle med sensoriske neurons i DRG5,6,7, 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11. Videre har nyere studier også implisere bidraget fra DRG makrofager i axonal reparasjon etter nerveskader12,13. En annen studie antyder videre at macrophage subpopulasjoner (dvs. CD11b+Ly6CHi og CD11b+Ly6Clav/- celler) kan spille en annen rolle i den mekaniske overfølsomhet14. Derfor raskt bestemmelse av fenotype respons av DRG makrofager i sammenheng med nerveskader kan hjelpe oss med å identifisere neuroimmune faktorer som bidrar til nevropatisk smerte.

Konvensjonelt, protokollen for å isolere makrofager i DRG innebærer flere trinn inkludert enzymatisk fordøyelse15,16. Teknikken er ofte tidkrevende og kan være kostbart for store eksperimenter. Selv om mild fordøyelse med kollagenase type II (4 mg/mL) og dispase type II (4,7 mg/mL) i 20 min ble anbefalt tidligere15, er det tenkelig at cellene etter eksponering for dette enzymet er utsatt for celle skade eller celle død, noe som kan føre til lav Gi. I tillegg kan forskjellen i kvaliteten på enzymer fra batch til batch ytterligere påvirke effektiviteten av denne prosessen. Enda viktigere, makrofager eksponert for enzymet fordøyelsen kan være uønsket stimulert og dermed kan være svært forskjellig fra in-vivo-status. Endringene kan potensielt komplisere utfallet av den funksjonelle studien.

Her beskriver vi en enzym fri protokoll for raskt å isolere DRG makrofager ved 4 ° c ved hjelp av mekaniske dissosiasjon. Prøvene er holdt på isen for å begrense mobilnettet stress. Som et resultat av vår tilnærming gir en fordel å opprettholde konsistens av isolasjonen, og de isolerte cellene er antagelig sunnere og mindre stimulert. Vi presenterer ytterligere bevis for å validere kvaliteten på de isolerte cellene med fluorescens-aktivert Cell sortering (FACS) analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr eksperimenter ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of California San Francisco og ble gjennomført i samsvar med NIH guide for omsorg og bruk av laboratorium Animals.

1. samle kors-DRG fra eksperimentelle mus

  1. Før du starter eksperimentet, forberede arbeider løsning av tettheten gradient medium (f. eks, Percoll) ved å blande 9 volumer av mediet med 1 volum av ca+ +/mg+ +-gratis 10x HBSS. Hold den på isen.
  2. Bedøve musen med 2,5% Avertin. Anerkjenne det det dyr er fullt ut anesthetized av det mangel på svaret å det bakben pote hugge.
    Merk: både mannlige og kvinnelige mus i alderen 6-8 uker ble brukt.
  3. Perfuse musen transcardially med 10 mL pre-kjølt 1x PBS.
    1. Plasser musen i liggende posisjon med fire poter festet med tapen inne i en kjemisk avtrekks hette. Løft huden under ribbeinet buret av tang, og lage et lite snitt med kirurgisk saks for å avdekke lever og membran.
    2. Fortsett å bruke saks for å kutte membranen og rib bur, åpne pleural hulrom å avdekke bankende hjerte.
    3. Raskt skjære høyre atrieflimmer vedheng med Iris saks. Når blødningen er notert, sette inn en 30 G nål i bakre enden av venstre ventrikkel, og langsomt injisere 10 mL pre-kjølt 1x PBS å perfuse dyret.
  4. Utfør rygg laminectomy15 på musen plassert i liggende posisjon.
    Merk: Hvis cellen kultur er planlagt, spray musen med 70% etanol før snitt og bruke pre-sterilisert Kirurgiske instrumenter for disseksjon.
    1. Bruk en størrelse 11 skalpell å lage en langsgående lateral dype snitt fra bryst regionen ned til sakral regionen. Fjern huden ved saksen for å avdekke rygg muskellaget.
    2. Bruk Friedman-Pearson Rongeur å skrelle av bindevev og muskler til lumbosacral ryggraden prosesser og bilaterale tverrgående prosesser er eksponert.
    3. Bruk en Noyes Spring saks til å åpne nøye ryggmargen, og deretter bytte til en Friedman-Pearson Rongeur for å fjerne vertebrale bein å eksponere ryggmargen med intakt spinal nerver vedlagt.
  5. Forsiktig analysere ipsilateral og kontralateral korsrygg DRG (L4/L5 DRG inne våre studere) og sted den i 1 mL av isen-kulden ca+ +/mg+ +-ledig 1X HBSS inne en Dounce tissue homogenisator. Nå er vevet klar for trinn 2.
    Merk: trim spinal nerven festet til DRG hvis mulig.

2. isolere enkeltceller fra musen korsryggen DRG

  1. Homogenisere DRG-vevet med en løs morter i Dounce homogenisator 20-25 ganger.
  2. Plasser en steril nylon celle sil 70 μm i et sterilt 50 mL konisk rør. Fukt celle sil med 800 μL av iskald 1x HBSS, og gjennomstrømning er samlet i konisk rør.
  3. Samle den homogenisert vevs suspensjonen fra homogenisator ved hjelp av en pipette og passere gjennom den våte 70 μm nylon celle sil inn i 50 mL konisk rør.
  4. Skyll homogenisator to ganger med 800 μL av iskald 1x HBSS og Dekanter deretter til samme 50 mL konisk slange med celle sil for å øke utbyttet.
  5. Tilsett 1,5 mL equilibrated iskald isoton tetthet gradient medium (fremstilt i trinn 1,1) til en steril 5-mL polystyren FACS tube.
  6. Overfør celle homogenate fra 50 mL konisk rør (i trinn 2,4) inn i FACS tube, bland godt med tettheten gradient medium ved pipettering opp og ned. Legg til ytterligere 500 μL av 1x HBSS for å forsegle toppen.
  7. Pellet cellene ved sentrifugering ved 800 x g i 20 min ved 4 ° c.
  8. Nøye aspirer supernatanten som inneholder myelin i mediet uten å forstyrre celle pellet på bunnen av FACS røret.
  9. Resuspend cellene i PBS eller FACS buffer som inneholder 5% fosterets storfe serum (FBS) for FACS analyse.
    Merk: minst 50 000 til 100 000 celler er forventet fra L4/L5 DRG av en mus.
    1. Resuspend de mekanisk isolerte DRG-cellene (L4/L5) i 100 μL av PBS som inneholder 5% fosterets storfe serum og deretter ruge med α-mus CX3CR1-APC antistoff (1:2000) i mørket ved 4 ° c for 1 t.
    2. Vask cellene med 5 mL PBS gang; sentrifuger cellene 360 x g i 8 min ved 4 ° c.
    3. Aspirer supernatanten, deretter resuspend celle pellet i 300 til μL av PBS for FCAS analyse. Hvis celle sorteringen er planlagt, resuspend cellene i FACS-bufferen i stedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å validere de isolerte cellene valgte vi først macrophage FAS-indusert apoptose (MAFIA) transgene mus17. Denne linjen uttrykker et medikament-induserbart FK506-binding protein (FKBP)-FAS selvmord Fusion genet og grønt fluorescerende protein (eGFP) under kontroll av arrangøren av CSF1 reseptor (CSF1R), som er spesielt uttrykt i både makrofager og mikroglia. Systemisk injeksjon av FK-bindende protein dimerizer, AP20187 (AP), induserer apoptose av cellene som uttrykker transgene. Uttrykket av EGFP også tillater oss å overvåke makrofager i DRG. For å tømme makrofager i MAFIA musene, begynte vi studiene med 3 daglige intraperitoneal injeksjoner av AP (1 mg/kg). Etter siste injeksjon var DRG delt for immunostaining for GFP. Vi registrerte et betydelig tap av GFP+ celler i DRG av de Ap-behandlede mus SAMMENLIGNET med VEH-behandlede mus (figur 1a-B). I et eget eksperiment, brukte vi denne protokollen til mekanisk distansere DRG makrofager etter behandlingen. Påfølgende FACS analyse avdekket en vellykket reduksjon av GFPHi BEFOLKNINGEN i Ap-behandlede mus (figur 1C-D) og demonstrerte den høye kvaliteten på isolerte celler.

Vi har også karakterisert de isolerte DRG-cellene fra vill-type mus. Mekanisk isolerte DRG celler (L4/L5) ble farget med α-mus CX3CR1-APC antistoff. Vi fant at 6% av DRG-cellene var CX3CR1+ makrofager (figur 2A-B). Celle levedyktighet ble også vurdert med Propidium iodide (endelig konsentrasjon av 2,5 μg/ml) som binder seg til det intracellulære DNA av de uholdbare cellene, avslørende at mer enn 80% av nylig isolerte DRG-celler var levedyktig (figur 2C-D).

Figure 1
Figur 1: FACS analyse av makrofager i DRG av MAFIA mus etter AP behandling.
MAFIA mus mottatt daglig intraperitoneal injeksjon av 1 mg/kg av AP20187 (AP) eller kjøretøy (VEH) for 3 dager før analysen. (A, B) Representative immunostaining bilder som viser den AP-induserte reduksjonen av GFP+ (grønn) makrofager i L4/L5 DRG etter 3Rd Ap-behandling. NF200 (blå) ble brukt til å merke myelinated neurons. Scale bar: 50 μm. (C, D) Prosent CSF1R-GFPHi celler etter mekanisk dissosiasjon av L4/5 DRG ble bestemt av FACS analyse, og en representativ datasett fra tre uavhengige eksperimenter er vist med prosentandelen av gated celle befolkning indikert. Resultatet viser at 4% av totalt isolerte celler fra DRG av VEH-behandlede dyr var GFPHi makrofager. I kontrast var bare 0,4% av totalt DRG-celler GFPHi makrofager i Ap-behandlet mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: FACS karakterisering av makrofager i DRG av vill-type mus.
(A, B) Ipsilateral L4 og L5 DRG av naive vill-type mus ble samlet for mekaniske dissosiasjon. Prosent CX3CR1+ makrofager ble målt ved FACS-analyse (A). Gating for CX3CR1+ celler var basert på bakgrunns fluorescens i cellene INKUBERT med APC-bøyd isotype kontroll antistoff (B). (C, D) Celle levedyktigheten til ferske isolerte DRG-celler ble vurdert med Propidium iodide (PI) farging. PI+ celler (C) var gated basert på bakgrunnen fluorescens i unstained celler (D). En representativ datasett fra tre uavhengige eksperimenter er vist med prosentandelen av den gated celle populasjonen indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her introduserer vi en ny metode for å effektivt berike isolerte makrofager fra mus DRG. Den konvensjonelle tilnærmingen til å isolere DRG immunceller krever enzymatisk fordøyelse15,18, som nå er erstattet med mekanisk homogenisering i vår protokoll for å begrense uønsket celle skade og øke avkastningen. Den nye protokollen er derfor langt mindre tidkrevende. Enda viktigere, kan enzym fordøyelsen stimulere makrofager og endre molekylær signatur. I kontrast, vår mekaniske tilnærming sterkt begrenser mobilnettet stress.

Ved hjelp av FACS analyse, vi videre karakterisert makrofager i isolerte DRG celler og demonstrerte en stor cellulær utvinning. Mer enn 80% av isolerte DRG-celler under denne protokollen ble funnet å være levedyktig (figur 2D). Minst 50 000 til 100 000 celler er forventet fra L4/L5 DRG av en mus. Derfor kan vi trygt konkludere med at DRG-cellene kan bli ytterligere sortert i macrophage subpopulasjoner14 for enten kultur eller RNA isolasjon. Det er imidlertid noen kritiske trinn som kan påvirke avkastningen. Hvis utilfredsstillende celle yield er notert, utilstrekkelig eller overdreven homogenisering i trinn 2,1 bør mistenkes. Omfanget av celle død vurdert med PI (figur 2) eller 7-AAD farging kan utnyttes til å optimalisere protokollen. I tillegg kan DRG-disseksjon i trinn 1,4 kreve gjentatt praksis for nybegynnere.

For tiden bruker vår Lab i hovedsak denne protokollen for å studere DRG makrofager. Sannsynlig kan anvendelsen av denne protokollen utvides til å studere andre ikke-neuronal celler i DRG, slik som satellitt celler19, og T-celler20. Videre studier er nødvendig for å bekrefte effektiviteten av celle isolasjon. Dessverre er vår nåværende mekaniske dissosiasjon metode ikke ideelt for isolering av DRG sensoriske neurons, og enzymatisk fordøyelsen er fortsatt den mest effektive metoden for sensorisk Nevron isolasjon15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser knyttet til dette manuskriptet.

Acknowledgments

Studien ble støttet av: Foundation for anestesi utdanning og forskning (XY); den UCSF Department of anestesi og Perioperativ Care (XY); og 1R01NS100801-01 (GZ). Denne studien ble støttet delvis av HDFCCC laboratorium for Cell analyse delte ressurser Facility gjennom en bevilgning fra NIH (P30CA082103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AP20187 Clontech 635058
α-mouse CX3CR1-APC antibody Biolegend 149007
Avertin Sigma T48402
Cell strainer (70 mm nylon) Falcon 352350
Centrifuge Eppendorf 5810R
Dounce tissue homogenizer Wheaton 357538 (1ml)
FACS tubes (5ml) Falcon 352052
Friedman-Pearson Rongeur FST 16121-14
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) Gibco 14185-052
Noyes Spring Scissor FST 15012-12
Percoll Sigma P4937-500ml
Propidium iodide Sigma P4864-10ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354, (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19, (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184, (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8, (1), 1778 (2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22, (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17, (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86, (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130, (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158, (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35, (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112, (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2, (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75, (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7, (1), 16460 (2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21, (5), 518-523 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics