Valutazione emodinamica invasiva per il sistema ventricolare destro e l'ipertensione arteriosa polmonare indotta dall'ipossia nei topi

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire una valutazione emodinamica invasiva del ventricolo destro e dell'arteria polmonare nei topi utilizzando un approccio chirurgico a torace aperto.

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Luo, F., Wang, X., Luo, X., Li, B., Zhu, D., Sun, H., Tang, Y. Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice. J. Vis. Exp. (152), e60090, doi:10.3791/60090 (2019).

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Abstract

L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è un disturbo cardiopolmonare cronico e grave. I topi sono un modello animale popolare utilizzato per imitare questa malattia. Tuttavia, la valutazione della pressione ventricolare destra (RVP) e della pressione dell'arteria polmonare (PAP) rimane tecnicamente impegnativa nei topi. RVP e PAP sono più difficili da misurare rispetto alla pressione ventricolare sinistra a causa delle differenze anatomiche tra il sistema del cuore sinistro e quello destro. In questo articolo, descriviamo un metodo stabile di misurazione emodinamica del cuore destro e la sua convalida utilizzando topi sani e PAH. Questo metodo si basa sulla chirurgia toracica aperta e supporto di ventilazione meccanica. È una procedura complicata rispetto alle procedure del torace chiuso. Mentre un chirurgo ben addestrato è richiesto per questo intervento chirurgico, il vantaggio di questa procedura è che può generare entrambi i parametri RVP e PAP allo stesso tempo, quindi è una procedura preferibile per la valutazione dei modelli Di PAH.

Introduction

L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è un disturbo cardiopolmonare cronico e grave con elevazione della pressione dell'arteria polmonare (PAP) e pressione ventricolare destra (RVP) causata dalla proliferazione cellulare e dalla fibrosi di piccole arterie polmonari 1. Cateteri dell'arteria polmonare, chiamati anche cateteri Swan-Ganz2, sono comunemente utilizzati nel monitoraggio clinico di RVP e PAP. Inoltre, un sistema di monitoraggio PAP wireless è stato utilizzato clinicamente3,4,5. Per imitare la malattia per lo studio nei topi, viene utilizzato un ambiente ipossico per simulare le manifestazioni cliniche umane della PAH6. Nella valutazione del PAP negli animali, gli animali di grandi dimensioni sono relativamente facili da monitorare attraverso cateteri dell'arteria polmonare utilizzando la stessa tecnica dei soggetti umani, ma piccoli animali come ratti e topi sono difficili da valutare a causa delle loro piccole dimensioni corporee. La misurazione emodinamica del sistema ventricolare destro nei topi è possibile con una dimensione ultrapiccola 1 Catetere Fr7. Un metodo per misurare RVP e PAP nei topi è stato riportato nella letteratura8,9, ma la metodologia manca di una descrizione dettagliata. RVP e PAP sono più difficili da misurare rispetto alla pressione ventricolare sinistra a causa delle differenze anatomiche tra il sistema cardiaco sinistro e destro.

Per ottenere entrambi i parametri PAP e RVP nello stesso mouse, descriviamo un approccio basato su chirurgia a torace aperto per le misurazioni emodinamiche del cuore destro, la sua convalida con topi sani e PAH, e come evitare di generare dati artificiali durante il complicato open-chest chirurgia. Anche se questa tecnica è meglio eseguita da un chirurgo ben addestrato, ha il vantaggio di essere in grado di valutare PAP e RVP nello stesso mouse.

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Protocol

Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College (NO.0000287). Gli animali sperimentali sono stati alloggiati e nutriti secondo le linee guida del benessere degli animali in Cina.

NOTA: i topi C57BL di età di otto-12 settimane erano alloggiati in un ambiente con un ciclo di luce scuro/12 h da 12 h. I topi PAH sono stati alloggiati per 4 settimane sotto una concentrazione di ossigeno del 10%, mantenuti da una camera ipossia controllata dall'ossigeno per indurre ipertensione polmonare, e topi di controllo sono stati alloggiati nell'aria ambiente (21% di ossigeno) in condizioni identiche. Le misurazioni RVP e PAP sono state eseguite alla fine delle 4 settimane di sfida di ipossia.

1. Preparazione preoperatoria

  1. Immergere il catetere del trasduttore di pressione (dimensioni: 1 Fr) in 0,9% salina a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'esperimento emodinamico.
  2. Filtrare la soluzione 2,2,2-Tribromoethanolo con filtro 0,22 m e conservarlo in frigorifero a 4 gradi.
  3. Preparare strumenti di chirurgia pulita e forniture come guanti per la chirurgia.
  4. Preparare 10 mL di 1,0% soluzione enzimatica digestiva per la pulizia del catetere.
  5. Collegare il catetere del trasduttore di pressione a un sistema di volume di pressione.
  6. Calibrare il trasduttore di pressione prima di ottenere misurazioni della pressione per ogni topo.
    1. Ruotare la manopola di calibrazione su 0 mmHg e 25 mmHg per inviare un segnale di pressione di verifica al software di acquisizione dati e configurare l'impostazione di calibrazione nel software.
    2. Ruotare la manopola su Trasduttore e regolare la manopola Saldo su linea di base a zero.
  7. Impostare uno stereoscopio standard e una tabella chirurgica di piccoli animali controllata a temperatura per il mantenimento della temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.
  8. Impostare un sistema di illuminazione della luce per la microchirurgia per fornire abbastanza luce sull'area chirurgica.

2. Chirurgia open-chest e misurazione emodinamica

  1. Anestesia topi con 250 mg/kg di 2,2,2 Tribromoetanolo tramite iniezione intraperitoneale (i.p.). Se necessario, ripetere dosi supplementari a 1/3 a 1/2 della dose originale durante la procedura.
  2. Rimuovere la pelliccia del torace e del collo con un rasoio e una lozione per la rimozione dei peli (Figura 1A, 2A).
  3. Fissare ogni topo in posizione supina su una tavola chirurgica animale piccolo controllato a temperatura per aiutare a mantenere la temperatura corporea (37 gradi centigradi) durante l'intervento chirurgico.
  4. Pulire il sito chirurgico con il 70% di etano.
  5. Una volta che l'anestesia è in vigore, confermare un'adeguata induzione dell'anestesia utilizzando un pizzico di dita dei dei idi.
  6. Fare un'incisione mediana sulla pelle del collo (Figura 1A).
  7. Dissezionare il muscolo scheletrico utilizzando pinze curve ed esporre la trachea (Figura 1B, 1C).
  8. Eseguire l'intubazione attraverso la bocca utilizzando un catetere di guaina per via endovenosa modificato da 22 G. Verificare che il tubo è nella trachea utilizzando pinze (Figura 1D).
  9. Collegare il tubo a un piccolo ventilatore animale. Calcolare e impostare la frequenza respiratoria e il volume delle maree in base al peso corporeo in base al manuale dell'utente del ventilatore10. Ad esempio, impostare la frequenza respiratoria su 133/min e il volume delle maree su 180 per un topo da 30 g in base al calcolo descritto.
  10. Fissare il tubo per la ventilazione con nastro adesivo.
  11. Confermare un'adeguata induzione dell'anestesia utilizzando un pizzico di dita dei dei idi.
  12. Fare un'incisione mediana sulla pelle del torace e sezionare attentamente i muscoli del torace con uno strumento di cauteria (Figura 2B, 2C).
  13. Tagliare lo sterno utilizzando le forbici al centro ed esporre la cavità toracica (Figura 2D).
  14. Prevenire qualsiasi sanguinamento utilizzando lo strumento cautery durante la procedura di chirurgia toracica aperta.
  15. Esporre il ventricolo destro con i retrattili (Figura 2E).
  16. Inserire il catetere del trasduttore a pressione imbevuto di saline attraverso un piccolo tunnel creato con un ago da 25 G nel ventricolo destro per misurare RVP (Figura 2F e Figura 3A, 3C).
  17. Tenere il cavo del catetere e attraversare la valvola polmonare in modo coassiale con l'arteria polmonare. Osservare la forma d'onda di pressione e ottenere un segnale PAP stabile (Figura 3B, 3D).
  18. Registrare i dati emodinamici utilizzando il sistema di acquisizione dei dati e il software.
  19. Dopo le misurazioni finali, l'eutanasia i topi umanamente attraverso l'iniezione i.p. di una dose in eccesso di 2,2,2-Tribromoethanol soluzione.
  20. Rimuovere con attenzione il catetere dal sistema cardiaco destro e metterlo in una siringa da 1 mL contenente 1% soluzione enzimatica digestiva.
  21. Utilizzare acqua distillata per lavare continuamente il catetere e conservarlo nella scatola originale.

3. Analisi dei dati per l'emodinamica

NOTA: i dati emodinamici sono stati registrati e analizzati utilizzando il software di analisi11 (Tabella dei materiali).

  1. Per ogni mouse, selezionare almeno 10 cicli di heartbeat continui e stabili senza rumore per ottenere i dati medi dei dati RVP o PAP per ogni parametro.
  2. Utilizzare il test tdi Student per confrontare i normali gruppi di controllo dell'aria e ipossia. NOTA: p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono presentati come la media : SD.

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Representative Results

Il catetere del trasduttore di pressione è stato inserito nel ventricolo destro (Figura 3A) attraverso un tunnel espanso da un ago da 25 G ed è stata ottenuta una tipica forma d'onda RVP (Figura 3C). Il catetere è stato continuamente regolato e lentamente avanzato e mantenuto nello stesso asse dell'arteria polmonare mentre passa attraverso la valvola polmonare (Figura 3B). Quando il sensore di pressione è stato inserito con successo nell'arteria polmonare, è apparsa una tipica forma d'onda PAP con una caratteristica tacca dicrotica (Figura 3D). Per evitare la generazione di dati artificiali, abbiamo osservato se la forma d'onda aveva rumore (Figura 4) o se il livello zero del catetere era andato alla deriva (Figura 5). In questo caso, sono state apportate correzioni e questi segmenti con rumore sono stati esclusi dall'analisi dei dati.

La PAH è caratterizzata da un'elevazione sostenuta in PAP e RVP, causata da una maggiore resistenza nelle piccole arterie polmonari. La PAH è definita da un PAP medio di 25 mmHg a riposo, misurato durante la cateterizzazione del cuore destro nella clinica12. Abbiamo misurato il RVP e il PAP nei topi con l'ipossia cronica indotta (mantenuta al 10% di ossigeno per 4 settimane) o un gruppo di controllo (mantenuto nell'aria normale). I risultati sono illustrati nella figura 6. Rispetto a quelli del normale gruppo di controllo dell'aria, PAP sistolico (Figura 6A), PAP diastolico (Figura 6B), PAP medio (Figura 6C) e pressione sistolica ventricolare destra (Figura 6D) sono stati tutti significativamente aumentati nel gruppo dell'ipossia cronica. I ricercatori hanno anche riferito che rispetto all'ipossia da solo, una combinazione di un inibitore VEGFR con ipossia cronica per 3 settimane per indurre una grave PAH nei topi può provocare un aumento significativo di RVP13,18.

Figure 1
Figura 1: Intubazione per supporto di ventilazione meccanica nei topi. (A) La pelliccia del collo viene rimossa utilizzando la lozione per la rimozione dei peli per ottenere un'area pulita per la chirurgia. Un'incisione mediana è fatta sulla pelle del collo. (B) Il muscolo scheletrico che copre la trachea è esposto. (C) I muscoli scheletrici sono smussati per esporre la trachea. La freccia gialla indica la trachea. (D) Il tubo (modificato con un catetere per via endovenosa da 22 G) viene inserito nelle vie aeree, con il posizionamento confermato con pinze. La freccia gialla indica il tubo all'interno della trachea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Chirurgia toracica aperta per la misurazione emodinamica al giusto sistema ventricolare. (A) La pelliccia toracica viene rimossa utilizzando la lozione per la rimozione dei peli per ottenere un'area pulita per la chirurgia. (B) Viene fatta un'incisione mediana per esporre i muscoli scheletrici del torace e lo sterno. (C) Uno strumento di cautery viene utilizzato per ridurre al minimo il sanguinamento durante l'apertura del torace (la freccia indica la punta del cautery). (D) Lo sterno viene tagliato lungo la linea mediana (la linea del trattino giallo). (E) Due retrattori sono utilizzati per esporre il cuore (la freccia superiore indica la parete atriale destra e la freccia inferiore indica la parete libera ventricolare destra). (F) Un catetere trasduttore a pressione (la freccia inferiore) viene inserito nella camera ventricolare destra utilizzando uno strumento di puntura (ago di dimensione 25 G, la freccia superiore) per produrre un piccolo tunnel sulla parete libera ventricolare destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Curve RVP e PAP rappresentative. Il catetere del trasduttore di pressione viene inserito nella camera ventricolare destra (A) per ottenere la forma d'onda RVP (C). Il catetere trasduttore di pressione passa attraverso la valvola polmonare e rimane nell'arteria polmonare (B) per generare la forma d'onda PAP. Le frecce indicano la caratteristica tacca dicrotica sulla forma d'onda PAP (D), segno di una chiusura della valvola polmonare. RA - Atrio destro, RV - ventricolo destro, PA - arteria polmonare, LV - ventricolo sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rumore della forma d'onda RVP causato dal tocco della superficie del sensore di pressione alla parete ventricolare. Il punto freccia mostra un forte aumento della pressione sulla curva RVP (il canale superiore), che produce contemporaneamente un cambiamento artificiale in dP/dt (il canale inferiore). dP/dt viene calcolato da RVP. Le linee tratteggiate indicano il rumore dP/dt. Se il rumore è costantemente presente, la regolazione della posizione del sensore del catetere nel ventricolo può impedire il rumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: deriva zero del trasduttore di pressione durante la misurazione RVP. La finestra di sinistra mostra artificialmente leggermente elevato RVP end-diastolic. La finestra espansa a destra mostra un aumento del RVP diastolico finale (le frecce indicano RVP end-diastolic). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Ipertensione dell'arteria polmonare indotta da ipossia nei topi C57BL. (A) Pap sistolico (sPAP). (B) Pap diastolico (dPAP). (C) PAP medio (mPAP). (D) Pressione sistolica ventricolare destra (RVSP). (E) e (F), Forma d'onda rappresentativa PAP rispettivamente per il controllo e mouse PAH :p < 0,05; Test t-testdello studente; gruppo di controllo n - 10; gruppo di ipossia n I dati sono presentati come la media : SD. PAP - pressione dell'arteria polmonare, RVP - pressione ventricolare destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'intubazione tracheale è il primo passo importante per interventi chirurgici a torso aperto. Il metodo classico di intubazione tracheale per piccoli animali, come ratti o topi, prevede di fare un'incisione a forma di T sulla trachea e di inserire direttamente tubi tracheali di tipo Y nella trachea. In pratica, troviamo che questo metodo non è facile durante il funzionamento. Il tubo tracheale di tipo Y è troppo grande per i piccoli animali e forma un angolo con la trachea. Così, è difficile fissare il tubo in atto. Inoltre, una volta che il tubo di intubazione esce accidentalmente dalle vie respiratorie durante l'intervento chirurgico al torace aperto, di solito si traduce in morte animale a causa della perdita del supporto meccanico di ventilazione. Pertanto, abbiamo modificato il metodo di intubazione endotracheale14 facendo un'incisione sulla pelle, separando lo strato muscolare per esporre la trachea (Figura 1C),e inserendo direttamente il tubo tracheale nelle vie aeree attraverso il bocca dell'animale. Il posizionamento dei tubi nella trachea può essere convenientemente confermato bloccando la trachea utilizzando pinze (Figura 1D). Dopo aver rimosso l'ago guida e aver usato solo il catetere di tè, un catetere intravenoso da 22 G viene utilizzato come tubo intubazione. Il tubo può essere facilmente fissato dopo l'intubazione. Questo è un modo sicuro per gestire l'intubazione durante l'intervento chirurgico e può migliorare significativamente il tasso di successo della chirurgia a toracico aperto di piccoli animali. Tuttavia, questo metodo richiede formazione e pratica.

L'approccio del torace chiuso per la misurazione emodinamica del cuore destro è stato descritto nel dettaglio15,16. Una limitazione del metodo del torace chiuso è che può essere utilizzato per valutare solo RVP, perché il catetere non può accedere all'arteria polmonare nei topi. Usiamo un'incisione toracica mediana in cui si trova la parete libera ventricolare destra, appena sotto lo sterno (Figura 2D). Dopo la cateterizzazione ventricolare destra per ottenere RVP, è facile inserire il catetere in modo coassiale con l'arteria polmonare per ottenere PAP (Figura 2E). Quando lo sterno viene tagliato durante l'intervento chirurgico al torace aperto, viene utilizzato uno strumento di elettrocoagulazione per evitare il sanguinamento della sezione di taglio sternale per prevenire la diminuzione artificiale della pressione sanguigna causata dalla perdita di sangue (Figura 2C). È facoltativo per questa chirurgia toracica aperta utilizzare un catetere a ciclo P-V per ottenere sia RVP che informazioni sul volume17. Tuttavia, è meglio non usarlo per ottenere PAP a causa delle sue dimensioni più grandi. Anche se questo metodo è meglio eseguito da un chirurgo ben addestrato, è preferibile all'approccio toracico chiuso perché consente il mantenimento dell'intubazione tracheale e la prevenzione del sanguinamento durante la chirurgia del torace aperto per evitare la morte animale.

Inoltre, la parete libera ventricolare destra viene forata con un ago da 25 G o più piccolo per ridurre la resistenza durante l'inserimento del catetere nel ventricolo. Durante la cateterizzazione, la superficie del sensore di pressione non deve deviare dallo smusso dell'ago per evitare danni accidentali al sensore catetere da parte della superficie metallica tagliente. È preferibile non utilizzare un ago grande per forare la parete libera ventricolare, in quanto di solito provoca ulteriore sanguinamento, e l'insufficiente volume sanguigno in circolazione provoca anche dati di pressione artificiale.

A causa del piccolo volume del ventricolo e delle dimensioni irregolari della camera ventricolare destra nei topi, il sensore di pressione del catetere tocca facilmente la parete libera ventricolare destra durante l'alta frequenza di battito cardiaco. Ciò genera rumore sulla curva di pressione ventricolare (Figura 4), influenzando direttamente l'analisi della pressione ventricolare. In questo caso, l'angolo e la profondità del catetere devono essere regolati fino a quando il rumore scompare per ottenere nuovamente una forma d'onda a pressione ventricolare liscia.

Le piccole dimensioni del catetere trasduttore a pressione 1 Fr7 lo rendono un trasduttore di pressione molto preciso e preciso. La deriva zero non si sperimenta generalmente durante un test standard del catetere in soluzione salina in vitro, a meno che il catetere non sia difettoso o danneggiato. Tuttavia, in presenza di sangue corporeo, i componenti del sangue aderiscono alla superficie del sensore di pressione possono causare il catetere a subire una deriva zero durante un esperimento in vivo (Figura 5). Per risolvere questo problema, facciamo quanto segue: rimuovere temporaneamente il catetere dalla camera ventricolare e posizionare la punta del sensore del catetere in soluzione calda 1,0% enzimatico digestivo; incubarlo per digerire i componenti del sangue collegati alla superficie del sensore; e dopo aver pulito delicatamente il catetere con una garza imbevuta di salina, inserire il catetere nella camera ventricolare per ottenere una forma d'onda ventricolare stabile e non a deriva zero.

Anche la preparazione di un catetere trasduttore di pressione è essenziale per ottenere dati stabili. La punta del sensore di pressione del catetere deve essere imbevuta per almeno 30 min in 0,9% salina a temperatura ambiente prima della procedura in vivo per mantenere la stabilità del catetere. In questo modo, le caratteristiche elettriche del catetere del trasduttore a pressione possono essere stabilizzate in modo ottimale.

Infine, il periodo di ipossia è praticabile da 3 a 4 settimane per il modello di ipertensione indotta da ipossia nei topi6,14,17,18. I nostri dati hanno mostrato che 4 settimane di ipossia possono indurre un modello stabile di ipertensione polmonare nei topi C57BL, e i livelli di PAP e RVP sono paragonabili alla letteratura. Sono necessari ulteriori studi per affrontare la durata del mantenimento del modello Di PAH se i topi vengono rimessi in condizioni normossiche per diversi protocolli di ipossia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è sostenuta dal Postgraduate Education and Teaching Reform Project del Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), dal Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) e dal Director Fund of Beijing Key Laboratory of Pre-Clinical Research and Valutazione dei materiali impiantati cardiovascolari (2018-PT2-

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G For anesthesia
Animal temperature controller Physitemp Instruments, Inc. TCAT-2LV For temperature control
Dissection forceps Fine Science Tools, Inc. 11274-20 For surgery
Gemini Cautery System Gemini GEM 5917 For surgery
Intravenous catheter (22G) BD angiocath 381123 For intubation
LabChart 7.3 ADInstruments For data analysis
Light illumination system Olympus For surgery
Mikro-Tip catheter Millar Instruments, Houston, TX SPR-1000 For pressure measurement
Millar Pressure-Volume Systems Millar Instruments, Houston, TX MVPS-300 For pressure measurement
O2 Controller and Hypoxia chamber Biospherix ProOx 110 For chronic hypoxia
PowerLab Data Acquisition System ADInstruments PowerLab 16/30 For data recording
Scissors Fine Science Tools, Inc. 14084-08 For surgery
Small animal ventilator Harvard Apparatus Mini-Vent 845 For surgery
Stereomicroscope Olympus SZ61 For surgery
Surgery tape 3M For surgery
Terg-a-zyme enzyme Sigma-Aldrich Z273287-1EA For catheter cleaning

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References

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