שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Electrospray אינון (ESI) יכול להעביר פפטיד מימית בשלב מורכב או פפטיד לשלב הגז תוך שימור מסה שלה, המטען הכולל, מתכת-מחייב אינטראקציות, וצורה הקונפורמציה. מצמד ESI עם ניידות-המסה (IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית המאפשרת מדידה בו של מסת המסה של פפטיד (m/z) וחתך התנגשות (סמ ק) המתייחסים לסטואיצ'ימטריה שלה, פרוטונציה state, ובצורה מעשית. המטען הכולל של קומפלקס פפטיד נשלט על-ידי הפרוטונציה של 1) באתרים החומציים והבסיסיים של הפפטיד ו -2) מצב החמצון של יון המתכת (s). לכן, מצב החיוב הכולל של קומפלקס הוא פונקציה של ה-pH של הפתרון המשפיע על הזיקה של מתכת פפטידים מחייב האהדה. עבור הניתוחים של ESI-IM-MS, פפטיד ופתרונות יוני מתכת מוכנים מתוך פתרונות מימית בלבד, עם pH מותאם עם לדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר תלות pH וסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד ספציפי. יתר על כן, m/z ו-סמ ק של מתחם פפטיד יכול לשמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי להבחין באתרי הכריכה של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות מציגות כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את הביצועים הסלגטיים סלקטיבי של קבוצה של פפטידים מתיונין חלופיים ולהשוות אותם לתוך מתיונין הנחושת-פפטיד מתיאנקובטין.

Introduction

נחושת ויוני אבץ חיוניים עבור אורגניזמים חיים חיוניים לתהליכים כולל הגנה חמצונית, צמיחה רקמות, נשימה, כולסטרול, מטבוליזם הגלוקוז, ו הגנום קורא1. כדי להפוך את הפונקציות הללו לזמינות, קבוצות כמו ה-thiolate של cys, סרטיאזול שלהשניים,3, (לעתים רחוקות יותר) תיויואתר של מתיונין, ו carboxylate אוחר של גלו ו-Asp לשלב באופן סלקטיבי מתכות כקופרים לתוך האתרים הפעילים של . מטלואנזימים הדמיון של קבוצות תיאום אלה מעלה שאלה מרתקת לגבי האופן שבו הליזלים והאחרים משלבים בצורה סלקטיבית את ה-Cu (I/II) או Zn (II) כדי להבטיח את התפקוד הנכון.

קשירה סלקטיבית מושגת לעתים קרובות על ידי רכישת פפטידים סחר, אשר שליטה Zn (II) או Cu (I/II) ריכוזי יון4. Cu (I/II) הוא תגובתי ביותר וגורם נזק חמצוני או כריכת האדוולקית לאנזימים, כך הריכוז החופשי שלה מוסדר בחוזקה על ידי מלווים נחושת ו-נחושת הוויסות חלבונים התחבורה אותו בבטחה למיקומים שונים בתא בחוזקה לשלוט הומאוסטזיס שלו5,6. שיבוש של מטבוליזם נחושת או הומאוסטזיס מעורב ישירות ב menkes ומחלת וילסון7 , כמו גם סרטן7 והפרעות עצביות, כגון פריון8 ומחלת אלצהיימר9.

מחלת וילסון קשורה לרמות נחושת מוגברת בעיניים, בכבד וחלקים של המוח, שם התגובות החמצון של Cu (I/II) מייצרת מינים חמצן תגובתי, גורם התנוונות וניוון נוירולוגי. טיפולי הכלרות הקיימים הם החומצות האמינו הקטנות מפאסיאנאמין וטריאטילנסאטולה. לחילופין, הmethanotrophic-פפטידים ברכישת נחושת מתיונין (mb)10,11 התערוכה פוטנציאל תרפויטי בגלל הזיקה הגבוהה שלהם עבור Cu (I)12. כאשר מתיונין (mb-OB3b) מתוך מתיונין trichosporium OB3b למדו במודל בעל חיים של מחלת וילסון, נחושת הוסר ביעילות מן הכבד מופרש באמצעות מרה13. בניסויים חוץ גופית אישר כי mb-OB3b יכול לאכול את הנחושת מתוך מטתיוגה נחושת הכלול ציטוסול הכבד13. אבלציה לייזר בשילוב עם המסת פלזמה המסה טכניקות הדמיה יש חקרו את ההתפלגות המרחבית של נחושת בסרטן המחלה של וילסון דגימות14,15,16 והראו כי mb-OB3b מסיר את הנחושת עם תקופות טיפול קצרות של 8 ימים בלבד.17.

The mb-OB3b יהיה גם לאגד עם יוני מתכת אחרים, כולל Ag (אני), Au (III), Pb (ii), Mn (ii), Co (ii), Fe (ii), Ni (ii), ו zn (ii)18,19. התחרות עבור האתר הפיסיולוגי Cu (I) מוצג על ידי Ag (I) כי זה יכול לתפוס את Cu (I) מתוך מתחם mb-OB3b, עם שני Ag (I) ו Ni (II) גם מראה מחייב בלתי הפיך Mb אשר לא ניתן לעקורים על ידי Cu (I)19. לאחרונה, סדרה של מתיונין אלטרנטיבית (amb) oligopeptides עם המוטיב 2cys מוטיב מחייב נחקרו20,21, ושלהם zn (ii) ו Cu (i/II) מאפייני איגוד מאופיין. רצפי חומצות האמינו העיקריים שלהם הם דומים, והם כולם מכילים את 2His-2Cys מוטיב, Pro ו acetylated N-טרמינוס. הם שונים בעיקר מ-mb-OB3b בגלל מוטיב 2Cys מחליף את שני אתרים כריכת oxazolone oxazolone של mb-OB3b.

Electrospray אינון בשילוב עם ניידות-המוני-המסה ספקטרומטריה (ESI-IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית רבת עוצמה לקביעת תכונות מתכת מחייב של פפטידים כי זה מודד את המסה שלהם לטעון (m/z) והתנגשות חתך (סמ ק) תוך שימור צורת המסה, הטעינה והקונפורמציה משלב הפתרון. ה- m/z ו-סי. סי. אי מתייחסים לפפטידים סטויכמטריה, פרוטונציה המדינה והצורה הקונפורמציה. סטויכמטריה נקבע כי הזהות והמספר של כל אחד מהרכיבים המצויים במין מזוהים במפורש. המטען הכללי של קומפלקס פפטיד מתייחס למצב הפרוטונציה של האתרים חומצי ובסיסיים ואת מצב החמצון של יון מתכת (s). ה-סי. פי. סי מספק מידע של הצורה הקונפורטית של קומפלקס הפפטיד, מכיוון שהוא מודד את גודל הסיבוב הממוצע המתייחס למבנה השלישוני של הקומפלקס. מצב החיוב הכולל של הקומפלקס הוא גם פונקציה של pH ומשפיע על הזיקה של המתכת של פפטיד האיגוד משום האתרים בסיסיים או חומצי כגון carboxyl, שלו, Cys ו Tyr הם גם אתרי הקשירה הפוטנציאליים של יון מתכת. עבור הניתוחים, את הפפטיד ואת יון מתכת מוכנים פתרונות מימית עם pH מותאם על ידי מדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר את התלות pH ואת הסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד. יתר על כן, m/z ו-סמ ק נקבעים על ידי ESI-IM-MS ניתן להשתמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי לגלות את סוג של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות המוצגות במאמר זה לחשוף כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את ביצועי הכלגדירוג סלקטיבית של סט של פפטידים amb ולהשוות אותם לתוך הנחושת-מחייב פפטיד mb-OB3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

  1. התרבות מתיונין trichosporium OB3b, לבודד את Cu (I)-mb חינם-OB3b18,22,23, להקפיא לקפוא את המדגם ואת החנות ב-80 ° צ' עד השימוש.
  2. לסנתז את הפפטידים amb (> 98% טוהר עבור amb1, amb2, amb4; > 70% טוהר עבור amb7), להקפיא את הדגימות, ולאחסן אותם ב-80 ° c עד השימוש.
  3. רכישה > 98% טוהר מנגן (II) כלוריד, קובלט (II) כלוריד, nickle (II) כלוריד, נחושת (ii) כלוריד, נחושת (II) חנקתי, כסף (I) חנקתי, אבץ (II) כלוריד, ברזל (III) כלוריד ועופרת (II) כלוריד.
  4. לרכוש את הפולימרים פולי-DL-אלטין המשמשים ככייל עבור מדידת מקטעים ההתנגשות התנגשות של מינים amb ו-כיתה של כיתה או הידרוקסיד אמוניום גבוה יותר, חומצה אצטית קרחוני, ו acetonitrile.

2. הכנת פתרון מניות

  1. פתרון מניות פפטיד
    1. שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 20.0 mg של mb-OB3b או amb בבקבוקון פלסטיק 1.7 mL.
      הערה: מסה שקלה צריך להניב או 12.5 mM או 1.25 mM, בהתאם מסיסות של פפטיד, כאשר 1.00 mL של המים (DI) הוסיף.
    2. באמצעות pipet, להוסיף 1.00 mL של מים מוכי (> 28.6 MΩ ס"מ) למדגם פפטיד שוקלת להניב או 12.5 mM או 1.25 mM פתרון. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.
    3. באמצעות מיקרופיפט לוותר 50.0 μL הפחת מדגימת פפטיד לתוך המסומנת באופן אינדיבידואלי 1.5 mL מבחנות ולאחסן אותם ב-80 ° צ' עד השימוש.
  2. מניות מתכת-פתרונות
    1. שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 30.0 mg של מתכת כלוריד או כסף חנקתי בבקבוקון 1.7 mL.
      הערה: מסה שקלה צריך להניב 125 mM כאשר 1.00 mL של מים DI מתווסף.
    2. הוסף את 1.00 mL של מים DI לדגימת מתכת שוקלת ב 1.7 mL בקבוקון כדי להניב את הפתרון 125 mM. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.
  3. הידרוקסיד אמוניום פתרונות מניות: להכין 1.0 M חומצה אצטית פתרון על ידי דילול 57 μl של 99.5% חומצה אצטית פתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. הכנת 1.0 M הידרוקסיד אמוניום הידרוקסידי על ידי דילול 90 μL של 21% אמוניום הידרוקסידי הפתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. לעשות שתי מדלל רצופים של כל פתרון על ידי נקיטת 100 μL של 1.0 M פתרונות להכין 0.10 M ו 0.010 חומצת חומץ M ו-אמוניום הידרוקסידי פתרונות.
  4. פולי-dl-alanine פתרון המניה: להכין את פולי-dl-alanine (PA) על ידי שקילה 1.0 מ"ג של הרשות והמסת ב 1.0 mL של מים DI לתת 1,000 ppm. מערבבים ביסודיות. באמצעות מיקרופיפט, לוותר על 50.0 μL ali, ולמקם כל אחד לתוך בקבוקון 1.7 mL ולאחסן ב-80 ° c.

3. ריסוס אלקטרומטריה-מוביטריית יונים

  1. נקה את אבובים בכניסה ESI ואת נימי המחט ביסודיות עם כ 500 μL של 0.1 M חומצה אצטית קרחוני, 0.1 M אמוניום הידרוקסיד, ולבסוף די מים.
  2. הפשרת 50.0 μl סדרת מחלקים של הפתרון של מניות 1,000 ppm הרשות הפלסטינית ולדלל אותו עם 450 μl של מים DI כדי לתת לדפי הבית הפלסטינית 100. Pipet 100.0 μL של פתרון זה ולדלל אותו ל 1.00 mL עם 500 μL של מים DI ו500 μL של acetonitrile לתת 10 לדפי הרשות הפלסטינית פתרון.
  3. לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל שימוש יליד ESI-IM-MS התנאים כמתואר בסעיף הדיון.
  4. ההפשרה 50.0 μl סדרת מחלקים של 12.5 מ"מ או 1.25 mm amb פתרון המניה ולעשות מדלל רצופים עם מים די לתת ריכוז סופי של 0.125 mM amb. מערבבים ביסודיות כל דילול.
  5. Pipet 100.0 μL של 125 mM מלאי הפתרון של מתכת יון, מקום בבקבוקון 1.7 mL ולדלל כדי 1.00 mL עם די מים כדי לתת ב12.5 מטאל mM יון. חזור עם עוד שתי מדלל רצופות כדי לתת הסופי 0.125 mM מטאל ריכוז יון. מערבבים ביסודיות כל דילול.
  6. Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500 μL של מים DI, ולערבב את הפתרון ביסודיות.
  7. להתאים את ה-pH של המדגם כדי 3.0 על ידי הוספת 50 μL של 1.0 M חומצה אצטית תמיסה.
  8. הוסף 200.0 μL של יון מתכת 0.125 מ"מ למדגם המותאם ל-pH. הוסף מים DI כדי להניב נפח סופי של 1.00 mL של המדגם, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי להאביק 10 דקות ב RT.
  9. באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ES-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.
  10. חזור על שלבים 3.6 – 3.9, תוך שינוי שלב 3.7 להתאים את ה-pH כדי 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, או 10.0 על ידי הוספת כרכים חדשים של 0.010 M, 0.10 M, או 1.0 M חומצה אצטית או הידרוקסידי פתרונות.
  11. לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום של 10 דפי הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.

4. הכנת הטטור מתכת לדיגום של דגימות amb

  1. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500.0 μL של מים DI ולערבב את הפתרון ביסודיות.
  3. להתאים את ה-pH של המדגם ל-pH = 9.0 על ידי הוספת 80 μL של 0.010 M אמוניום הידרוקסיד הפתרון.
  4. הוסף 28 μL של 0.125 mM הפתרון מתכת להעניק 0.14 מקבילות טוחנת של יון מתכת, להוסיף מים DI כדי להפוך את הנפח הסופי של המדגם 1.00 mL, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי equi, עבור 10 דקות ב RT.
  5. באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.
  6. חזור על שלבים 4.2 – 4.5, תוך שינוי שלב 4.3 כדי להוסיף נפח מתאים של פתרון מתכת 0.125 mM כדי לתת את שני 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26, או 1.40 מקבילות טוחנת.
  7. לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.

5. ניתוח מידע בנוגע לנתוני ה-ESI-MS

  1. מ-IM-MS ספקטרה לזהות אילו מינים טעונה של ambs נוכחים על ידי התאמת אותם דפוסי האיזוטופ שלהם m/z התיאורטי.
    1. פתח MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה לפתוח את החלון chromatogram.
    2. עבור אל תפריט הקובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.
    3. חלץ את הספקטרום IM-MS על ידי לחיצה ימנית וגרירה על פני chromatogram ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח ויציג את ספקטרום ה-IM-MS.
    4. בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון מידול האיזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של מיני amb, בדוק את תיבת היון של הצג והזן את מצב הטעינה. לחץ על אישור.
    5. חזור על הפעולה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS ולהקליט את טווח האיזוטופ של m/z שלהם.
  2. עבור כל מיני מינים, יש להפריד בין מיני מקרי m/z לבין הפצות הזמן ההגעה שלהם (ATD) תוך שימוש בדפוסי האיזוטופ שלהם כדי לזהות אותם.
    1. ב-MassLynx לחץ על Driftscope כדי לפתוח את התוכנית. בתוך DriftScope לחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.
    2. השתמש בעכבר ולחץ לחיצה שמאלה כדי להתקרב על תבנית איזוטופ m/z של המינים amb.
    3. השתמש בכלי בחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.
    4. כדי להפריד כל מיני מקרי m/z להשתמש בכלי בחירה ולחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את הזמן atd מיושר עם תבנית איזוטופ של מינים amb. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.
    5. כדי לייצא את ה-ATD, עבור לקובץ | ייצוא ל-MassLynx, לאחר מכן בחר שמור זמן הסחף ושמור קובץ בתיקיה המתאימה.
  3. לקבוע את הסנטאיד של ATD ולשלב את האזור תחת עקומת ATD כמדד של אוכלוסיית המינים.
    1. בחלון Chromatogram של MassLynx פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על התהליך | שילוב מהתפריט. בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור.
    2. הקלט את המרכז האזורי ATD (tA) ואת האזור המשולב כפי שמוצג בחלון chromatogram . חזור על כל קבצי הנתונים שנשמרו amb והרשות הפלסטינית-MS.
  4. השתמש ATD משולב עבור כל המינים מחולץ amb של יונים חיוביים או שליליים בכל נקודת טיטור לנרמל לקנה מידה יחסי באחוזים.
    1. הזן את הזהויות של מינים amb ו-ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני.
    2. עבור כל pH, השתמש בסכום ה-ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה-ATDS של האדם לקנה מידה באחוזים.
    3. מתווה את אחוזי הכוונות של כל מיני מינים לעומת pH בגרף כדי להראות כיצד אוכלוסיית כל מינים משתנה כפונקציה של pH.

6. התנגשות בין סעיפים

  1. באמצעות גיליון אלקטרוני, המירו את ccss (Ω) של הרשות הפלסטינית25,26 ו-27 יונים חיוביים שנמדדו ב-הוא מאגר גז28 לתיקון סמ ק (Ωc) באמצעות משוואה 1 להלן, כאשר: z = ion חיוב; ה c = מטען אלקטרוני (1.602 × 10-19 ג); מ ' נ 2 = מסה של N2 גז (Da); ו- mיון = מיסת יונים. בן 29

Equation 1

  1. להמיר את זמני ההגעה הממוצעת (tA) של הרשות הפלסטינית מיני נמלים ומינים amb לתוך זמני הסחף (tD) באמצעות משוואה 2 להלן, כאשר: c = מקדם העיכוב של מחזור החובה המשופר (1.41), ו-m/z הוא מסה-to-התשלום של יון פפטיד.

Equation 2

  1. העלילה הרשות הפלסטינית מכייל ' tD Vs. Ωcשלהם. לאחר מכן, תוך שימוש בהתאמת רגרסיה לפחות של משוואה 3 המוצגת להלן, קבע את ערכי a ' ו-B, כאשר: a ' הוא תיקון הטמפרטורה, הלחץ ופרמטרי השדה החשמליים; ו-B מפצה על ההשפעה לא לינארית של מכשיר ה-IM.

Equation 3

  1. באמצעות אלה ' ו B ערכיהערך של הסנטאיד t מתוך atd של ambs לקבוע Ωc שלהם באמצעות משוואה 3 ואת Ω שלהם באמצעות משוואה 1. שיטה זו מספקת ccss עבור מינים פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%25,26,27.

7. שיטות חישוביות

  1. השתמש ברמה הB3LYP/LanL2DZ של התיאוריה, הכוללת את הפונקציונליות היברידית של becke 3-הפרמטר30 ואת בסיס דנינג להגדיר31 ו אלקטרון פוטנציאל ליבה32,33,34 כדי לאתר הגיאומטריה האופטימיזציה עבור כל הסוגים האפשריים של coordinations של m/z amb מינים שנצפו35.
    הערה: לקבלת פרטים אודות אופן הבנייה והשליחה של חישובים, עיין בשימוש ב-GaussView בקובץ משלים.
  2. השוו את האנרגיה החופשית החזויה של כל אחד מהמגבונס ולחישוב CCSs התיאורטי שלהם באמצעות שיטת לנארד-ג'ונס (אל-ג'יי) מתוכנית סיגמא36.
  3. מהמגבנות הנמוכות ביותר של אנרגיה חופשית קובעות באיזה קונלשעבר מוצגים ה-אל. סי. אם. סי. אם. סי. סי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כריכת מתכת של amb1
מחקר IM-MS20 של amb1 (איור 1א) הראו כי שני יוני נחושת ואבץ הקשורים Amb1 באופן תלוי pH (איור 2). עם זאת, נחושת ואבץ מאוגד amb1 דרך מנגנוני תגובה שונים באתרי תיאום שונים. לדוגמה, הוספת Cu (II) ל-amb1 הביא חמצון של amb1 (amb1ox) על ידי היווצרות הגשר קשר דיסולפידי, ו ב-pH של > 6, את [amb1ox-3h + Cu (II)]ליון ( איור 2א) הוקמה. זה הצביע על הדה-פרוטונציה של שני הסרדזוקלימים, קבוצת קרבוקסילי, ושני אתרים נוספים שהיו תיאום Cu (II).

מידול מולקולרי של [amb1ox-3h + CU (II)] ליון באמצעות B3LYP/LanL2DZ קבע את מורכבות האנרגיה הנמוכה ביותר היה Cu (II) מתואם באמצעות מδN הסרדיטיות של שלו1 ואת הניטרותים של הגנים של השדרה אמיד קבוצות של cys2 ומכוערת3 עם זאת, מתחת ל-pH של 6, הוספת Cu (II) כדי amb1 יצרה תבנית האיזוטופ של m/z זה יכול להיות רק על ידי הכריכה Cu (i), ויוצרים את [amb1ox+ Cu (i)]+ יון (איור 2ב). לעומת זאת, pH גבוה מ-6 גרם לתבנית האיזוטופ m/z כדי להקטין 1 מ'/z, שנספרו על-ידי החיוב החיובי [amb1ox-H + Cu (II)]+ יון. הוספת Zn (II) לא התחלפה amb1, ו zn (ii) הכריכה נצפתה ב-pH של > 6, בעיקר להרכיב את [amb1-3H + zn (II)]ליון ( איור 2ג). הדבר הצביע על הדה-פרוטונציה של הסרלידזוקלימים, תיול וקבוצות הקרקסיקסיל. מידול מולקולרי של [amb1-3h + zn (II)] ליון קבע כי האנרגיה הנמוכה ביותר להיות הטטרהדרד zn (ii) תיאום באמצעות 2His-2Cys או שלו-2cys ואת carboxylate אוחר של C-הטרמינוס.

איגוד מרובה Cu (I) של amb2
תגובות החמצון בין Cu (II) ו-amb2 (איור 1ב) הביא בכריכת Cu (I). זה למדו בפירוט רב יותר באמצעות IM-MS, UV-Vis ספקטרופוטומטר, ו B3LYP דוגמנות מולקולרית37. המוצרים העיקריים של Cu (II) טיטור של amb2 ב-pH של 5 היו amb חמצון2 (דרך היווצרות גשר קשר דיסולפידי) ואת amb2 מינים מתאם שלושה Cu (I) יונים.

חיפוש באמצעות שיטת B3LYP/LanL2DZ הממוקם שני מתחמי אנרגיה נמוכה התמודדות עם מינים 3Cu (I) מתואם. הראשון היה הקומפלקס המוצג באיור 3A, שבו היונים 3cu (I) מתואמים באמצעות קבוצות thiolate הגישור38 של cys2 ו-cys6 (של שלו1) כמו גם δN1 ו δN5 (של שלו5 ). הקומפלקס השני (3c) יש גשר מלח בין protonated הקבוצה1 צד ו C-טרמינל carboxylate אוחר הקבוצה. תוצאות אלה מרמזות על כך ב-pH של 3.0 – 6.0, amb העיקרי2+ 3cu (I) קומפלקס הוא מבנה מלוחים מלח, אשר ניתן להעביר בהצלחה מהפתרון לשלב הגז עם סידור מבני מינימלי בלבד.

ה-אל. אס. פי התיאורטית של 209 ± 6 Å2, מחושב באמצעות התוכנית סיגמא36 עבור 3 ג מורכב, הסכים עם IM-MS מדדו סמ ק, המציין כי 3 ג מייצג [amb2-2h + 3 ג (אני)]+ קונפורמציה יווצרות ב-pH 3.0-6.0. עם זאת, ב-pH של > 6, מתחם זה לא נצפתה על ידי IM-MS, כנראה בגלל שדה-פרוטונציה נוספת של שלו1 (pKa= 6.0) תוצאות במתחם נייטרלי כולל. לאחר imidazoleum הקבוצה של1 שלו הוא deprotonated, 3cu (I) תיאום יכול להמיר את הקבוצות thiolate גישור של cys2 ו-cys6 , כמו גם δN1 ו δN5 שלו1 ו-5שלו, בהתאמה (3a).

התלות של ה-pH של amb4 Cu (I/II)-כריכת ופעילות מחודשת
הודעות IM-MS ו B3LYP שימשו כדי לחקור את Cu (II) ו-pH-חדירות של amb4 (איור 1ג) ו מזוהה מונומר, דימר, trimer, ו טטרמר תסביכים של amb4 המכיל עד שלושה Cu (I) יונים או שני cu (II ) יונים עבור כל יחידת משנה39. התסביכים גם הכילו מספר שונים של גשרים קשר דיסולפידי, ומוצרים אלה יוצרו אם או לא התגובות Cu (II) עם amb4 נערכו פתרונות אנאירובית או אירובית מימית.

באמצעות טכניקת IM-MS, הוכח כי מינים בודדים אלה ניתן להפריד ולכמת גם אם היו להם דפוסי איזוטופ חופפים בשל הבדלים בזמני הגעתם (איור 4). הזיהוי והקוונפיקציה של המינים הקרובים האלה הם משימה ששום שיטה אינסטרומנטלית או אנליטית אחרת אינה יכולה להשיג. אלה מחקרים IM-MS לספק תובנה ניכרת התגובות התלויות-pH התלויים וזיהה בדיוק את המספרים של הגשרים הבין-מולקולריים הפנים-מולקולרית, מספר Cu (I) או Cu (II) יונים, ומספר אתרים דה-פרוטונציה בכל התסביכים ( איור 5).

יתר על כן, מדידת מתחמי ה-סי. פי. סי מותר גם לקבוע את ההגדרה של כל מיני המינים בודדים, אשר שימש עם B3LYP נרחב/LanL2DZ החיפוש כדי לאתר מגבשי עם מבנים כי הסכימו עם שתי המולקולרי הנכון סטואיצ'ימטריה ו-סי. פי. או. באמצעות שיטה זו זוהו התאום Cu (I/II) של התסביכים השונים. התגובות בין Cu (II) ו-amb4 כללה את היווצרות דימרס, טרימרס, ו טטרמרס תיאום או cu (I) או CU (II), בהתאם ל-pH של הפתרון.

לדוגמה, בפתרונות שהיו חומצי במקצת (pH = 3.0 – 6.0), הם בעיקר כבולים cu (I) יונים והיו בלתי תחמוצת, בעוד בפתרונות שהיו מעט בסיסיים (pH = 8.0 – 17.7), הם בעיקר כבולים Cu (II) יונים והיה תחמוצת על ידי כל ה-cys להרכיב קשר דיסולפידי אגרות חוב (איור 6). הB3LYP/LanL2DZ קבע כי היונים Cu (I) היו ליניאריים ומגושרים על ידי הקבוצות האצבעונתיים והסרדיאזול, ואילו היונים של ה-Cu (II) היו מעובטים באמצעות מישורי המעוותים או המרובעים הרבועים של הסרדיאזול, כמו גם הניטרוגליצרין של העמוד השדרה. קבוצות אמיד.

בדיקות IM-MS של mb-OB3b
מחקרים IM-MS19,40 של מגה-OB3b (איור 1D) הראו כי בשלב הגז, Cu (I)-mb חינם-OB3b קיים כמו שלושה מינים טעונה שלילית: [mb-OB3b – H], [mb-OB3b – 2h]2 –, ו [מגה-OB3b – 3h] 3 –, עקבי עם התנהגות צפויה שלב הפתרון. מתכות בודדות מתכת בוצעו19 כדי לקבוע את בסלקטיביות יון מתכת של Mb-OB3b. איור 7 מראה את התוצאות של מרכזי המתכת שנבחרו ומראה כי בסלקטיביות המחייב לכאורה של Mb-OB3b ניתן לסווג כשלוש קבוצות עיקריות: 1) Cu (i) ו-Ag (i); 2) Ni (II), Zn (II) ו-Co (II); ו-3) Pb (II), Fe (II) ו-Mn (II). סדר זה של בסלקטיביות מחייב הוכח להיות בהסכם כללי עם זה נמצא על ידי הקרינה הפלואורסצנטית מקוטים19 ו איזותרמי טיטור calorimetry18.

השוואה של mb-OB3b ו amb מיכל סבן כריכת מתכת בסלקטיביות
בסלקטיביות המחייב לכאורה של mb-OB3b הושווה לסלקטיביות של amb7 ב-pH של 7. Amb7 תוכנן עם אותו רצף של חומצות אמינו כמו Mb-OB3b, אבל עם שתי קבוצות oxazolone אוקאזנול הוחלפו שתי קבוצות שלו-cys. ה-amb7 (איור 1E) הוא בעל קשר דיגופרתי יחיד בין cys6 ו-cys12. התוצאות של היווצרות מתחמי טעונה שלילית (איור 8) הראו כי amb7 מועדף מחייב סלקטיביות עבור Ni (Ii) ו zn (ii) (60%), ואחריו Co (Ii) ו-Pb (ii) (40%). יתר על כן, היה כ 20% Cu (II) כריכה. היה גם עקבות או לא מחייב amb7 של Ag (I), MN (ii), או FE (ii). זה בהשוואה ל-mb-OB3b's מועדף בסלקטיביות של מעל 90% עבור Cu (I) ו-Ag (I) מחייב.

Figure 1
איור 1: המבנים הראשוניים של מתיונין האלטרנטיבי (amb) ומתיונין (mb-OB3b) פפטידים. (א) מרחריל -שלו 1-cys2-ביילי3-Pro4-שלו5-cys6 (amb1); (ב) מרחריל-שלו1-cys2-tyr3-Pro4-שלו5-cys6 (amb2); (ג) מאצטל-שלו1-cys2-מאוד3-ser4-tyr5-Pro6-שלו7-cys8-ser9 (amb4); (ד) 1-(N-[mercapto-(5-אוקסו-2-(3-מתיל butanoyl) oxazol-(ז) -4-ylidene)-ממתיא 1-Ser2– cys3– tyr4)-פירולידין-2-yl-(מרקורי-[5-אוקסו-oxazol-(ז) -4-ylidene]-Ser5 – Cys6– Met7 (mb-OB3b); ו- (ה) מרחאיל-Leu1-שלו2-cys3-ביילי4-Ser5-cys6-tyr7-Pro8-שלו9-cys10-מטרים11-cys12-Met 13 (amb7). הצללה מציגה את: 2 שלו-2Cys או enethiol – oxazolone אתריIconכריכה (); פרוקו או צירי פירולידין (Icon); מטקסיל או מתילנול גרופ N-טרמינוס (Icon); וטירולה, שיכולה לייצב את תיאום מטאל באמצעות מעטפת π-הקטבציהIconהשנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: משמעות הכוונות היחסיות של המתיונין האלטרנטיבית (amb1) מרחלת-שלו1-cys2-באמת3-Pro4-שלו5-cys6 ו מורכב מתכת מורכבים (amb1+X) (שבו X = Cu או Zn). תצפיות נעשו במהלך ניתוח שלילי וחיובי המסה הספקטרומטר הספקטרומטריה של 1:1 היחס הטוחנת הפתרון amb:XCl2 על טווח ה-pH של 3.0 – 11.0. קווי שגיאה מציגים סטיות סטנדרטיות של האמצעים הן בעוצמה היחסית והן ב-ph משלושה שכפול של ניסויים ב-ph טיטור. 1:1 הפתרון הטוחנת של amb: cucl2 הביא חמצון של amb (השורהשני) עם cys2 ו-cys6, ויצרו גשר קשר דיסולפידי. (א) ניתוח יון שלילי של amb: cucl2 מראה [ambox-h] לשעה ולפי. (ב) ניתוח יון חיובי של amb: cucl2 מראה [ambox]+ ו [ambשור+ Cu (I/II)]+; מצב החמצון של Cu במתחם היה התלוי ב-pH, להיות [שוורים שור+ Cu (אני)]+;  מתחת ל-pH של 8 ו-[ambox-H + CU (II)]+; מעל ה-pH של 8. (ג) ניתוח יון שלילי של amb: לזלק2 מציג [amb]n על ו [AMB + zn (II)]n-. (ד) ניתוח יון חיובי של amb: לזלין2 מציג [amb]n + ו [AMB + zn (II)]n +. איור זה הותאם מפרסום קודם של20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מבנים מוצעים של [amb2+ 3cu (I)]+ שימוש באנרגיה הנמוכה ביותר ואת הגיאומטריה אופטימיזציה מבנים ממוקם מרמת B3LYP/LanL2DZ של תאוריה. (A) 3 Cu (I) קואורדינציה באמצעות δN1δN5 של שלו1 ו-5 ו thiolate גישור קבוצות thiolate של cys2 ו-cys6 עם חתך תיאורטי של 217 ± 6 Å2. (ב) איור של δN1δN5 ו thiolate תיאום גישור. ) מלח מבנה מגשר מראה את 3 Cu (I) תיאום באמצעות carboxylate מסוף (cys6), δN5, ו thiolate גישור עם חתך תיאורטי של 209 ± 6 Å2. ) אילוסטרציה של המסוף carboxylate δN5, ו thiolate התיאום גישור. מרחקים מליטה A, B, C, D, E ו-F מוצגים ביחידת Å. איור זה הותאם מפרסום קודם37. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הודעות IM-MS ניתוח של מוצרים של 1:1 התערובת של amb4: CU (II) ב-pH = 4.4.  (א) הופק דפוסי איזוטופ עבור [Amb4-2h + 3cu (i)]+, [Diamb4+ 4h + 6cu]2 +, [triamb4/6cu + 9cu)]3 + ו [טטרamb4-8h + 12cu (i)]4 + מינים. (ב) שילוב של זמני ההגעה המחולצים של [Amb + 3cu (i)]+, [diamb 4+ 4h + 6cu]2 +, [Triamb4/6cu + 9cu)]3 + ו [טטרamb4-8h + 12cu)]4 + שימשו לחישוב עוצמות היחס שלהם. כדי לחשב את אחוז העוצמות היחסי, הסיכום של האזור המשולב עבור כל המינים שחולצו עבור כל נקודת טיטור שימש לנרמול לסולם האחוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שינוי תבנית איזוטופ עבור Cu ביחידים (I/II) מאוגד amb4 נצפתה במהלך החומציות של המקבילה של CU (ii): amb4 ב-ph = 4.04, 6.02, ו 9.98. ב-pH = 4.04, התוצאה הניסיונית מתאימה בעיקר למודל האיזוטופ עבור [amb4+ Cu (I)]+. ב-pH = 6.02, יש משמרת של-2 m/z, המסמלת את היווצרות של הגשר קשר דיסולפידי (מוצג כחמצון amb4ox) והסכמה עם דפוס איזוטופ עבור [amb4ox+ Cu (אני)]+. ב-pH = 9.98, יש שינוי נוסף של-1 m/z, מציין Cu (II) והסרת פרוטון כדי לשמור על מצב טעינה + 1, אשר לאחר מכן מתאים לתבנית איזוטופ עבור [amb4ox-H + CU (II)]+. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שינוי עוצמות היחסי של זהויות של מכלולי Cu (I/II) של המונומר, dimer, ו trimer של amb4 על טווח pH של 3.0 – 11.0.  (א) מונומר עם אחד cu (i/ii) יון, (ב) דיימר עם 2 cu (i/ii) יונים, ו (ג) trimer עם 3 cu (i/ii) יונים. בכיתובים מופיע מספר איגרות החוב הדיסולניות במתחם. איור זה הותאם מפרסום קודם39. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: אחוז היווצרות של Cu (i), Ag (אני), Zn (ii), Ni (ii), Co (ii), Mn (ii), Pb (ii), או Fe (ii) מתחמים של methanobactin. נצפו במהלך התיפרצות הבודדות של המתכת של מתיונין. יש לציין כי Cu (I) הכריכה הביא התוספת של Cu (II) ו-Fe (II) הכריכה מתוך התוספת של Fe (III). איור זה הותאם מפרסום קודם של19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: השוואה בין אחוז Cu (i/II), Ag (ב), Zn (ii), Ni (ii), Co (ii), Mn (ii), Pb (ii), או Fe (ii) הכליון על ידי mb-OB3b ו-amb7 ב-pH = 7. ההשוואה היא היווצרות של יונים טעונה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary File
קובץ משלים. GaussView שימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים: שימור התנהגות בשלב הפתרון לבדיקה דרך ESI-IM-MS
יש להשתמש בהגדרות האינסטרומנטליות המקוריות שמאגור את הפפטידים הסטויכמטריה, לטעון את המצב ואת המבנה הקונפורמי. עבור תנאים מקומיים, התנאים במקור ESI כגון מתח חרוט, טמפרטורות, וזרמי הגז צריך להיות ממוטב. כמו כן, את הלחצים ואת המתח במקור, מלכודת, התנועה היון, והעברת גלי נסיעה (במיוחד הטיה מלכודת DC השולט מתח הזרקה בתא IM) יש לבדוק את ההשפעות שלהם על הפצות המדינה החיוב וניידות היון.

להלן תנאי ההפעלה הטיפוסיים ששימשו בעבודה זו. הדגימות פפטיד מימית הוזרק באמצעות אף קהה 1.0 mL מזרק באמצעות 10 μL דקות-1 שיעור זרימה, 2.0 kv קפילר מתח עבור יונים חיוביים (+) או על-ידי 1.8 kv עבור יונים שליליים (-), 130 טמפרטורה מקור ° c, 250 ° c desolvation, 20 v הדגימה קונוס, ו 4.0 V קונוס החילוץ. הקטע IM הופעל עם 6.0 V מתח כניסה לתוך תא המלכודת עם לחץ ארגון של 2.25 x 10 כ2 mbar באמצעות 1.5 mL/min קצב זרימה. המתח להזרקת יונים (מלכודת הטיה DC) לתוך התא IM הוגדר ב 12 V כדי למנוע הדיסוציאציה של יונים כפי שהם התנגשו בתחילה גז מאגר חנקן. תא IM מופרדים יונים מבוסס על הטעינה שלהם התנגשות חתך ומנוצל לחץ חנקן 0.52 mbar ו 20.0 mL דקה-1 שיעור זרימה. הודעות הIM פעלו באמצעות ה20.0 V (+) או 8.0 – 30.0 V (למעלה), ובגובה 800 – 1500 מ '-1 (+) או 250 – 1000 מטרלאחד (למעלה) עבור כל לטאטא דרך התא של הגל הנוסע IM. תא ההעברה הופעל באותו לחץ ארגון כמו תא המלכודת והנחה את היונים שנפתרו הודעות הIM למנתח הזמן של הטיסה המאסיבית למטען. הספקטרום של ניידות היונים נרכש על ידי סנכרון השחרור הסגור של היונים לתא הIM עם מנתח זמן הטיסה.

באמצעות תנאי ESI מקומיים, מאפייני שלב הפתרון כגון מצב הטעינה והמצב הקונפורמציה נשמרים במהלך ניתוחי IM-MS. לדוגמה, מדינות החיוב של mb-OB3b ו ambs נצפתה במהלך מנתח IM-MS20,37 היו קשורים היטב למדינות החיוב צפוי בשלב הפתרון40. פפטיד mb-OB3b הוא טטרפרוטיק וצורות רק יונים טעונה שלילית במהלך ניתוח IM-MS40, אם Cu (i)-כרוך או Cu (I)-חינם, כי הוא מכיל את C-הטרמינוס (pka < 1.7), שתי קבוצות oxazolone אוקסני (pka = 5.0 ו 9.7), וקבוצת Tyr (pKa = 11.0)42. Ambs בצורה מלאה protonated שלהם יהיה חיוב כולל של +2 בגלל C-הטרמינוס (pk≈ 2), שני שלו (pka = 6.0), שני cys (pka = 8.3), ו-tyr (pka = 11.0) אתרים19,41. לפיכך, הם בדרך כלל ליצור יונים טעונה חיובי ב-pH של < 6 ויונים טעונה שלילית ב-pH של > 6.

Ambs גם הראה ברור ברורים של ה-pH התלויים Cu (I/II) התנהגות איגוד הפעילות החוזרת שבה Cu (I)-מחייב ב-pH נמוך העברה Cu (II) הכריכה ב-pH גבוה יותר. את התגובות Cu (I/II) כללו להרכיב את מינים תחמוצת amb (ambox) כי הכיל איגרות חוב קשר דיסולפידי ומולטיימרים שונים Cu (I/ii) כריכה (איור 5 ואיור 6). אלה תגובות החמצון הם תלויי זמן והוא הוכח כי ככל שמרווח זמן (עד 210 דקות) בין ההכנה לדוגמה IM-MS מנתח מוצרים מחמצנים יותר נצפו37. לכן, נדרש גם התחשבות קפדנית בתלות בזמן התגובה על התבוננות במוצרים.

מגבלות: IM-MS והתנגשות תיאורטית צולבות סעיפים לזהות איזה סוג של תיאום כל יון מתכת מעדיף
כדי לסייע בפענוח נתוני ה-IM-MS/z ו-סמ ק, נערך חיפוש נרחב באמצעות רמת התאוריה B3LYP/LanL2DZ. גאומטריה ממוטבת עם אתרי תיאום שונים הושוו בין האנרגיה שלהם בחינם החזוי הסכם עם ה-סמ ק שנמדד על ידי IM-MS. מידול מולקולרי של פפטידים אלה התסביכים שלהם הוא מוגבל על ידי סוג של אלקטרוניקה חישובים מבנה שניתן להחיל על אלה מערכות גדולות יחסית. שיטות אחרות שנחקרו או המומלצות כוללות עבודה על ידי Truhlar et al.43, שמצא כי M05-2x היה הטוב ביותר הפונקציונלי DFT ו PM7 ו mndo/d היו טוב nddo חצי אמפירי שיטות עבור ZN (II)-המכילים תרכובות44. פפטידים אלה יש מרחב הקונפורמי גדול וחקירה יסודית כדי לאתר את האנרגיה הנמוכה ביותר מהמגבלים חייב לכלול השוואת האתרים השונים מתכת כלטינג, מצבים שונים של ציס-פפטיד, גשרים מלח, מימן התחברות, ו π-היון אינטראקציה בין הקבוצה הארומטית של ה-Tyr לבין הקטיון המתכות.

משמעות לגבי שיטות קיימות: Cu (I/II) וכריכת יון מתכת נבחרים אחרים בהשוואה ל-mb-OB3b ו-ambs
קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וספקטרוסקופיית NMR הן הטכניקות הנפוצות ביותר לקביעת הרזולוציה האטומית של המבנה הלישוני הפפטידים. עם זאת, מחקרים קריסטלוגרפיה רנטגן של מטפפטידים הם נדירים בשל בעיות עם התגבשות של מתחמי אלה45. NMR הוא גם לא מתאים לפרשנות של מדגם שבו הקשר הדוק oligopeptide מינים בודדים נמצאים46. לכן, IM-MS ו-dft דגמי מולקולרית הם טכניקות חלופיות לחקר התגובות פפטיד במיוחד אלה הנובעים מחמצון מורכבים Cu (I/II)-מחייב תגובות20,37,40, 47. כוחה של IM-MS היא כי הוא יכול לפתור כל אחד מהמוצרים ולזהות את הקומפוזיציה המולקולרית שלהם על ידי במקביל מדידת שלהם m/z וזמני ההגעה הקשורים הסטואיצ'ימטריה, פרוטונציה המדינה, ואת המבנה מבנה.

לדוגמה, ה-mb-OB3b מגוון של יוני מתכת, והסלקטיביות שלו כלפי כל יונים הוצגה על-ידי מיון הודעות IM-MS (איור 7). התוצאות הראו את ההעדפה mb-OB3b עבור מחייב Cu (I) ו-Ag (I), תוך השוואת התוצאות ב-pH של 7 עם amb7. איור 8 מראה amb7 מעדיפים את zn (ii) ו Ni (ii). באופן כללי, מחקרים amb הראו כי החלפת שני enethiol-oxazones עם 2His-2Cys לא לכלול Cu (I/II)-מחייב, אבל זה הביא מספר Cu (I)-כריכה באמצעות תיאום ליניארי גישור (איור 3) לעומת mon, ברור Cu (i) האיגוד של48OB3b's. Cu (II) הפחתת גם על ידי חמצון תיול ו קשר דיסולפידי היווצרות גשר בניגוד לגשר קשר דיסולפידי הקיים ב-apo-mb-OB3b ואת הפוטנציאל הפחתת גבוהה של נחושת טעון mb-OB3b, אשר תומך בהעדפה חזקה עבור Cu (I)49 .

יישומים עתידיים
עוד הודעות IM-MS של פפטידים amb הם בעיצומן, שבו הרצף העיקרי שלהם הוא שונה על ידי החלפת ה-שלו או Cys עם מכוערת או Asp, בעוד שאריות Tyr מוחלף או מכוערת או פה. מחקרים אלה מתנהלים גם ב 10.0 מילימטר אמוניום אצטט, עם pH שונה עם הידרוקסיד אמוניום (עבור pH = 7, 8, ו 9) כדי לשמור על קבוע הכוח הכולל של יונית לכל מדגם. תוצאות אלה יפורסמו בקרוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת 1764436, תמיכה בכלי NSF (MRI-0821247), קרן וולש (T-0014), ומשאבי מיחשוב מהמחלקה לאנרגיה (TX-W-20090427-0004-50) ו-L3 תקשורת . אנו מודים לקבוצת בוואר של אוניברסיטת קליפורניה-סנטה ברברה על שיתוף התוכנית סיגמא ו Ayobami Ilesanmi להפגין את הטכניקה בווידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114, (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256, (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107, (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30, (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256, (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305, (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80, (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7, (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25, (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19, (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51, (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261, (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14, (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141, (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84, (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26, (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82, (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50, (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98, (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88, (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18, (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4, (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5, (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43, (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96, (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17, (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15, (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50, (4), 1378-1391 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics