विवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में लर्निंग-प्रेरित सिंपटिक प्लास्टिकिटी में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर

Neuroscience

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Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसके साथ Drosophila सीखने और स्मृति के संदर्भ में पूर्व और/या postsynaptic कैल्शियम कल्पना की जा सकती है. vivo कैल्शियम इमेजिंग में synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सेंसर का उपयोग कर एक शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग प्रतिमान इस तरह है कि synaptic प्लास्टिक साहचर्य सीखने के इस प्रकार अंतर्निहित निर्धारित किया जा सकता है के साथ संयुक्त है.

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Hancock, C. E., Bilz, F., Fiala, A. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (152), e60288, doi:10.3791/60288 (2019).

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Abstract

कई मॉडल जीवों में अनुसंधान के दशकों synaptic प्लास्टिक की वर्तमान अवधारणा के लिए नेतृत्व किया है सीखने और स्मृति गठन अंतर्निहित. synaptic संचरण में सीखने प्रेरित परिवर्तन अक्सर कई न्यूरॉन्स और मस्तिष्क में प्रसंस्करण के स्तर में वितरित कर रहे हैं. इसलिए, न्यूरॉन्स भर में सीखने पर निर्भर synaptic प्लास्टिक कल्पना करने के लिए तरीकों की जरूरत है. फल मक्खी Drosophila मेलेनोगैस्टर एक विशेष रूप से अनुकूल मॉडल जीव न्यूरॉन सर्किट अंतर्निहित सीखने का अध्ययन करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तरीका है जिसमें साहचर्य घ्राण यादों के गठन अंतर्निहित प्रक्रियाओं को दर्शाता है, यानी, synaptic गतिविधि और उनके परिवर्तन, vivo में नजर रखी जा सकती है. Drosophilaमें उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की व्यापक सरणी का उपयोग करना, यह विशेष रूप से निर्धारित सेल आबादी और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों व्यक्त करने के लिए संभव है. जगह में एक मक्खी फिक्सिंग, और सिर कैप्सूल खोलने से, यह घ्राण उत्तेजनाओं पहुंचाने whilst इन कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता कल्पना करने के लिए संभव है. इसके अतिरिक्त, हम एक सेट-अप प्रदर्शित करते हैं जिसमें मक्खी को एक साथ शरीर में बिजली के झटके के अधीन किया जा सकता है। यह एक प्रणाली है जिसमें मक्खियों शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग से गुजरना कर सकते हैं प्रदान करता है - जिससे एक पहले भोले गंध बिजली के झटके सजा के साथ जुड़े होना सीखा है - इस गंध के प्रतिनिधित्व के रूप में एक ही समय में (और अन्य अप्रशिक्षित गंध) है दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मस्तिष्क में मनाया जाता है। हमारी प्रयोगशाला पहले synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सेंसर की पीढ़ी की सूचना दी है, जो एक पूर्व या postsynaptic डिब्बों के लिए फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतों को सीमित करने के लिए सक्षम बनाता है. दो-फोटोमाइक्रोस्कोपी स्थानिक रूप से ठीक संरचनाओं को हल करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है। हम मशरूम शरीर, कीट मस्तिष्क के एक उच्च आदेश केंद्र से जानकारी को एकीकृत न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित करके इस उदाहरण. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स जिनकी गतिविधि घ्राण सीखने का एक परिणाम के रूप में संग्राहक है के बीच synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है.

Introduction

सीखने के माध्यम से मस्तिष्क में जानकारी कहाँ और कैसे प्राप्त की जाती है और बाद में स्मृति के रूप में संग्रहीत करने से तंत्रिका विज्ञान1में सबसे चुनौतीपूर्ण कार्यों में से एक का गठन होता है . तंत्रिका वैज्ञानिक अनुसंधान ने संग्रथित संचरण में परिवर्तन की अवधारणा को तंत्रिका उपस्तर के रूप में अभिनन्दन के रूप में लिया है जो सीखने और स्मृति निर्माण2,3को रेखांकित करता है . यह hypothesized है कि, सीखने के दौरान, न्यूरोनल पहनावा है कि एक उत्तेजना की धारणा के दौरान सक्रिय हैं के बीच synaptic कनेक्शन इस तरह संशोधित हो गया है कि उनके संयुक्त गतिविधि पैटर्न स्मृति याद के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, जिससे निर्देश भविष्य व्यवहार कार्रवाई4| ये "एनग्राम कोशिकाओं" और उनके synapses अक्सर मस्तिष्क क्षेत्रों और प्रसंस्करण के स्तर में वितरित कर रहे हैं, जो यह मुश्किल एक कार्य या एक उत्तेजना के सीखने के लिए synaptic संचरण में मनाया परिवर्तन आवंटित करने के लिए बनाता है. स्थानीयऔर उन synaptic परिवर्तन है कि कारण एक विशिष्ट सीखने के कार्य से जुड़े हुए हैं कल्पना करने के लिए एक एक उचित मॉडल प्रणाली है कि ठीक उन synapses सीमित करने के लिए अनुमति देता है की जरूरत है.

इस तरह के एक प्रयास के लिए, Drosophila melanogaster विशेष रूप से उपयुक्त है क्योंकि यह रिश्तेदार मस्तिष्क सादगी, व्यवहार समृद्धि, और प्रयोगात्मक पहुंच को जोड़ती है. अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीवों में, Drosophila सूत्रकृमि सी elegans और आनुवंशिक रूप से पथ्य स्तनधारियों के बीच न्यूरोनल जटिलता के संदर्भ में चूहों की तरह स्थित है. न्यूरॉन्स की स्टीरियोटाइप संख्या ($300) और सीमित व्यवहार प्रदर्शनों की सूची सी एलिगोंमें मनाया जाता है। Mammals, दूसरी ओर, न्यूरॉन्स और चौंका देने वाला व्यवहार जटिलता के लाखों है. फल मक्खी के मस्तिष्क है, इसके साथ $100,000, न्यूरॉन्स काफी सबसे कशेरुकियों के दिमाग की तुलना में छोटे, और न्यूरॉन्स के कई व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य हैं5. फिर भी, Drosophila जटिल व्यवहार की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का प्रदर्शन, मजबूत साहचर्य घ्राण सीखने और स्मृति गठन प्रदर्शन करने की क्षमता सहित, पहले 40 साल पहले6पर वर्णित . इस शास्त्रीय कंडीशनिंग प्रक्रिया के दौरान, मक्खियों के समूहों को वातानुकूलित उद्दीपक (सीएस+) के रूप में गंध के अधीन किया जाता है, जबकि उन्हें अप्रतिबंधित उद्दीपक (यूएस) के रूप में एक दण्डित विद्युत आघात प्राप्त होता है। एक दूसरी गंध (सीएस-) तो किसी भी सजा के बिना प्रस्तुत किया जाता है. इस तरह, जानवरों को सजा है, जो दो odors, सीएस+ और सीएस-के बीच एक बाद की पसंद की स्थिति में परीक्षण किया जा सकता है के साथ जुड़े गंध से बचने के लिए सीख लो. Drosophila में इस व्यवहार अंतर्निहित न्यूरॉन सब्सट्रेट विच्छेदन पर काम "एनग्राम"7,8,9,10 के प्राथमिक साइट के रूप में मशरूम निकायों (एमबी) की पहचान की है और, इसलिए, इस मस्तिष्क क्षेत्र के circuitry था और गहन अनुसंधान का विषय है जिसके द्वारा एक स्मृति engram अधिग्रहण और संग्रहीत है तर्क को उजागर करने के लिए (हाल ही में11में समीक्षा की,12).

Drosophila एमबी गोलार्द्ध प्रति 2,000 आंतरिक न्यूरॉन्स (Kenyon कोशिकाओं) के होते हैं, समानांतर axonal अनुमानों13में आयोजित . घ्राण प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के Axons पार्श्व protocerebra करने के लिए और एमबी calyces करने के लिए बढ़ा रहे हैं, एमबी के मुख्य डेन्ड्रिटिक इनपुट साइट और एंटीनाल लोब से घ्राण इनपुट प्राप्त करते हैं. केनियन कोशिकाओं का लंबा, समानांतर एक्सॉन बंडल पेंडकल और लोब का गठन करता है। अधिकांश केनिऑन कोशिकाएँ मस्तिष्क की मध्य रेखा की ओर एक संपार्श्विक का विस्तार करके क्षैतिज र्ण्ड/-लोब बनाने में विभाजित होती हैं, तथा पृष्ठीय-पूर्व दिशा में दूसरी संपार्श्विक प्रक्षेपित करके ऊर्ध्वाधर र्/ केनयॉन कोशिकाओं का अन्य समूह एमबी के क्षैतिज - लोब13 का निर्माण करता है जहां अधिगम प्रक्रिया और बाद में अल्पकालिक स्मृति निर्माण कोस्थानीयकृतकिया जा सकता है। एमबी लोबों में अफर इनपुट प्राप्त होता है और उत्कश निर्गत प्रदान करता है, दोनों आम तौर पर केनियन सेल एक्सॉन14,15,16के साथ अलग-अलग कंपार्टमेंटल उप-क्षेत्रों तक सीमित होते हैं। विशेष रूप से, afferent dopaminergic एमबी इनपुट न्यूरॉन्स मूल्य आधारित मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, दंडात्मक, साहचर्य घ्राण सीखने में प्रभाव मजबूत15,17. मशरूम शरीर lobes से त्रिविशात्मक और व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य efferent एमबी उत्पादन न्यूरॉन्स Kenyon कोशिकाओं की बड़ी संख्या में जानकारी एकीकृत, लक्ष्य विविध मस्तिष्क क्षेत्रों और भालू व्यवहार-अनुदेशक appetitive या versive जानकारी15 . इस न्यूरॉन वास्तुकला साहचर्य engram के संगठन की एक अवधारणा के लिए नेतृत्व किया गया है. Odors अपेक्षाकृत ठीक Kenyon कोशिकाओं के विरल सक्रिय पहनावा द्वारा इनकोडिंग कर रहे हैं. इन Kenyon सेल पहनावा और डोपामाइन की रिहाई की संयोग गतिविधि - उत्तेजनाओं को दंडित करके पैदा - MB उत्पादन न्यूरॉन्स पर Kenyon सेल presynapses से संचरण modulates इस तरह है कि जानवरों को बाद में इस विशेष गंध से बचना होगा10 ,12. हम यह बल्कि ठीक से परिभाषित और एक प्रतिमानात्मक मामले के रूप में स्थानीयकृत engram का उपयोग करने के लिए वर्णन कैसे synaptic गतिविधि में इन सीखने पर निर्भर परिवर्तन निर्धारित किया जा सकता है और निगरानी.

एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila का मूल्य एक की पहचान करने के लिए transgenes व्यक्त करने की अनुमति देता है बेजोड़ आनुवंशिक उपकरण बॉक्स पर दृढ़ता से निर्भर करता है, निगरानी, और जटिल सर्किट के भीतर एकल न्यूरॉन्स को नियंत्रित18. न्यूरॉन गतिविधि निगरानी के लिए तकनीक के आगमन - जैसे कैल्शियम इमेजिंग, यहाँ चर्चा - एक विशिष्ट उत्तेजना के जवाब में न्यूरॉन गतिविधि पैटर्न के निर्धारण के लिए अनुमति दी है. घ्राण उत्तेजना के साथ आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों (GECIs) की विशिष्ट Gal4-चालित अभिव्यक्ति के संयोजन से, एक ब्याज19के न्यूरॉन्स की गंध-evoked कैल्शियम गतिशीलता कल्पना कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कि आगे एक शास्त्रीय कंडीशनिंग प्रतिमान के साथ इस तकनीक युग्मन द्वारा, यह सीखने के संदर्भ में इन घ्राण प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए संभव है. सीखने प्रेरित plasticity आगे GECIs कि न केवल एक विशिष्ट न्यूरॉन के लिए स्थानीयकृत कर रहे हैं का उपयोग कर विच्छेदन किया जा सकता है, लेकिन यह भी एक न्यूरॉन के विशिष्ट subcompartments के लिए. Pech एट अल20 उपकरण है कि वास्तव में यह अनुमति की एक चयन की स्थापना की. GCaMP321 को लक्षित करके या तो पूर्व या postsynapse के लिए - कशेरुकी Synaptophysin या डीहोमर के लिए लिंकेज के माध्यम से, क्रमशः20- इन साइटों के अंतर मॉडुलन प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस स्थानीयकरण प्रदान करता है, इस संदर्भ में, सबसे GECIs है कि cytosol भर में सर्वव्यापी मौजूद हैं पर एक लाभ - उदाहरण के लिए, GCaMP22, GCaMP321, या GCaMP623 - क्योंकि इसका मतलब है कि पूर्व और पदों ynaptic परिवर्तनों हो सकता है समग्र एकीकृत कैल्शियम प्रवाह है कि न्यूरॉन सक्रियण का एक परिणाम के रूप में होता है से प्रतिष्ठित. यह स्थान और plasticity के प्रकार है कि का एक परिणाम के रूप में होते हैं या कि सीखने और स्मृति गठन के कारण के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं. एक उदाहरण के रूप में, यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल केवल postsynapse करने के लिए कैल्शियम सेंसर की अभिव्यक्ति को लक्षित करके घ्राण साहचर्य सीखने के दौरान एमबी उत्पादन न्यूरॉन्स के मॉडुलन को समझने में इस उपकरण के मूल्य से पता चलता है. निगरानी करके, एक व्यक्ति मक्खी के भीतर, गंध से पहले और घ्राण कंडीशनिंग के बाद गतिविधि evoked एक सीधा तुलना एक भोले गंध प्रतिक्रिया और एक सीखा गंध प्रतिक्रिया के बीच तैयार किया जा सकता है. एक ही इमेजिंग कक्ष में तय Whilst, मक्खियों odors के चयन के संपर्क में हैं. फिर, वे एक प्रतिकूल साहचर्य कंडीशनिंग प्रोटोकॉल जिसमें इन odors में से एक बिजली के झटके के साथ जोड़ा जाता है प्राप्त (सीएस+बनने ) और एक और गंध सुदृढीकरण के बिना प्रस्तुत किया जाता है (सीएसबनने -). अंत में, मक्खियों फिर से पहले कदम में के रूप में एक ही odors को उजागर कर रहे हैं. कैल्शियम गतिशीलता दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया जाता है।

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Protocol

1. ट्रांसजेनिक फल मक्खियों, Drosophila मेलेनोगैस्टर

  1. क्रॉस महिला कुंवारी और पुरुष मक्खियों (एक 12 एच प्रकाश / अंधेरे चक्र पर 60% सापेक्ष आर्द्रता में 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया) वांछित Gal4 और UAS निर्माण25ले जाने के लिए, क्रमशः मक्खियों का उत्पादन करने के लिए जिसमें ब्याज के विशिष्ट न्यूरॉन्स एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग व्यक्त कैल्शियम सूचक.
  2. उम्र उपरोक्त पार की महिला संतान जब तक वे 3-6 दिनों के बाद की सीमा में हैं. महिला मक्खियों उनके थोड़ा बड़ा आकार की वजह से बेहतर कर रहे हैं.

2. विवो कैल्शियम इमेजिंग में के लिए फल मक्खी की तैयारी

  1. एक एकल महिला मक्खी का चयन करें और अब से अधिक 5 मिनट के लिए बर्फ पर एनेस्थेटाइज़।
  2. ठीक संदंश का प्रयोग करके मक्खी को इमेजिंग कक्ष में रखें (चित्र 1में प्रदर्शित)। सुनिश्चित करें कि छाती और पैर कक्ष के नीचे बिजली के तारों के साथ संपर्क में हैं और यह कि सिर फ्लैट देता है। स्पष्ट चिपकने वाला टेप का उपयोग कर मक्खी की स्थिति को ठीक करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक कस्टम निर्मित कक्ष जिसमें मक्खियों तय कर रहे हैं की आवश्यकता है, सिर खोलने के लिए सुलभ कैप्सूल के साथ, और मक्खियों को दोनों गंध उत्तेजना ओंटा और छाती और पैर के लिए बिजली के झटके प्राप्त करने में सक्षम (चित्र 1).
  3. scalpel संभाल करने के लिए तय एक शल्य खोपड़ी ब्लेड का उपयोग करना (सामग्री की तालिकादेखें), मक्खी के सिर के चारों ओर टेप में एक खिड़की में कटौती, एंटीना कवर और उजागर छाती के केवल पूर्वकाल-सबसे भाग छोड़ने.
  4. पक्षों और नीले प्रकाश इलाज गोंद के साथ सिर के पीछे चारों ओर, ध्यान से अवतल-उत्तल जबड़े द्वारा आयोजित एक कीट पिन का उपयोग कर हेरफेर। गोंद एक नीले प्रकाश उत्सर्जक एलईडी दीपक का उपयोग कर सेट करें।
  5. जाँच करें कि गोंद पूरी तरह से सेट है और मक्खी सिर के पृष्ठीय सतह से किसी भी अवशिष्ट unhardened गोंद साफ है.
  6. सिर के उजागर क्यूटिकल को कवर करने के लिए रिंगर के समाधान24 की एक बूंद लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. एक बहुत ही ठीक ब्लेड चाकू का उपयोग करना, cuticle के माध्यम से काट दिया. क्यूटिकल के सबसे कुशल हटाने के लिए, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में ocelli का उपयोग कर सिर के पीछे भर में पहली कटौती। फिर, प्रत्येक पक्ष को काट, आंखों के लिए मध्यस्थ, cuticle है कि आसानी से बंद forceps का उपयोग कर फटे जा सकता है की एक फ्लैप बनाने के लिए.
  8. ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र ब्लॉक कर सकते हैं कि किसी भी अतिरिक्त क्यूटिकल निकालें.
  9. ध्यान से ठीक संदंश का उपयोग कर किसी भी श्वासनली की पृष्ठीय सतह को साफ, मस्तिष्क के ऊतकों के ही विघटन से बचने. निकालें और रिंगर समाधानताज़ा 24 (सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में ऊतक मलबे के क्षेत्र को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक.
  10. स्थिति में hypodermic गंध वितरण सुई प्लेस, मक्खी के सिर से लगभग 1 सेमी. सुनिश्चित करें कि वहाँ कुछ भी नहीं है कि एंटीना के लिए गंध वितरण में बाधा डाल सकता है.
  11. माइक्रोस्कोप पर, hypodermic गंध वितरण सुई के माध्यम से गंध वितरण प्रणाली के लिए इमेजिंग कक्ष कनेक्ट.
  12. मक्खी पूरी तरह से संज्ञाहरण और सर्जरी से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए, और हवा के प्रवाह के लिए अनुकूल करने के लिए, इस स्तर पर एक 10 मिनट आराम अवधि को लागू.

3. विवो कैल्शियम इमेजिंग में

  1. एक अवरक्त लेजर और एक पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक multiphoton माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें (सामग्री की मेजदेखें), एक कंपन अलग मेज पर स्थापित. GFP आधारित कैल्शियम संकेतकों के दृश्य के लिए, 920 एनएम की एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए लेजर धुन और एक GFP बैंड पास फिल्टर स्थापित करें.
  2. मोटे ] समायोजन घुंडी का उपयोग करना, मस्तिष्क के जेड अक्ष के माध्यम से स्कैन और ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र का पता लगाने. स्कैन समय को कम करने के लिए केवल इस क्षेत्र पर स्कैनिंग ध्यान केंद्रित करने के लिए, और स्कैन दृश्य को इस तरह घुमाने के लिए कि सिर के पूर्वकाल नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है, फसल समारोह का उपयोग करें।
  3. 512 x 512 पिक्सल के लिए फ्रेम आकार समायोजित करें, गति को स्कैन करें 4 हर्ट्ज, और स्कैन क्षेत्र (वाई आयाम में) ताकि ब्याज के न्यूरॉन्स को कवर किया जाता है।

4. घ्राण कंडीशनिंग के माध्यम से गंध-उत्क्रमित कैल्शियम यात्रियों का दृश्य

  1. एक गंध वितरण प्रणाली का प्रयोग करें19,26 कि एक लौकिक सटीक तरीके से कई गंध उत्तेजनाओं वितरित कर सकते हैं.
    1. डिवाइस को नियंत्रित करने के लिए, और प्रयोगों के दौरान छवि पर कब्जा के साथ गंध उत्तेजना समन्वय करने के लिए इमेजिंग माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ संवाद करने के लिए एक अतिरिक्त कंप्यूटर का उपयोग करें।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और गंध वितरण कार्यक्रम को जोड़ने में सक्षम एक पूर्व क्रमादेशित मैक्रो पैकेज आरंभ करें (उदा., माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्थापित VBA मैक्रो पैकेज, सामग्री की तालिकादेखें) जो किसी बाहरी इनपुट के लिए उत्तरदायी है एक अलग कार्यक्रम में एक गंध वितरण प्रोटोकॉल की शुरुआत द्वारा प्रदान की ट्रिगर).
  2. "पूर्व प्रशिक्षण" की निगरानी करके माप शुरू करें "पूर्व-प्रशिक्षण"/नावे गंध-उत्कृष कैल्शियम आरोट्राट्स के एक संकल्प पर 512 x 512 px और 4 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर. एक 2.5 s गंध उत्तेजना के लिए अतिरिक्त छवि अधिग्रहण द्वारा flanked उद्धार 6.25 के लिए पिछले गंध onset (एक एफ स्थापित करने के लिए 0 आधार रेखा मान) और 12.5 s गंध ऑफसेट के बाद। एक दूसरे odorant के साथ इस दोहराएँ और फिर एक तिहाई odorant के साथ.
  3. शास्त्रीय कंडीशनिंग के साथ इस माप के बाद 3 मिनट जारी रखें ("प्रशिक्षण") मक्खी.
    1. सीएस+ गंध और सीएस बनने के लिए एक और एक बनने के लिए "पूर्व प्रशिक्षण" चरण में प्रस्तुत odors में से एक का चयन करें- गंध. सीएस+ गंध बारह 90 वी बिजली के झटके के साथ 60 s के लिए कंप्यूटर नियंत्रित गंध वितरण प्रणाली का उपयोग कर प्रस्तुत करें.
    2. 60 के ब्रेक के बाद, सीएस- 60 एस के लिए अकेले गंध पेश करें 4-मेथिलसाइक्लोहेक्सेनॉल और 3-ऑक्टानोल के रूप में उपयोग करें। इस प्रशिक्षण के दौरान तीसरे गंधक (जैसे, 1-ऑक्टेन-3-ol) को पेश न करें क्योंकि इसका उपयोग केवल पहले (चरण 4.2.) और प्रशिक्षण चरण (चरण 4.4) के बाद नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
  4. उपाय "पोस्ट-प्रशिक्षण" गंध फिर से दोहरा द्वारा कैल्शियम यात्रियों को दोहरा "पूर्व प्रशिक्षण" गंध उत्तेजना प्रोटोकॉल (चरण 4.2.) 3 मिनट प्रशिक्षण चरण खत्म करने के बाद (चरण 4.3).
    नोट: इस चरण के समय स्मृति गठन के बाद ब्याज के समय को प्रतिबिंबित करना चाहिए (उदा., अल्पकालिक स्मृति की जांच करने के लिए कंडीशनिंग चरण के बाद इस चरण 3-4 मिनट बाहर ले जाने). आमतौर पर, मक्खियों इस तैयारी में कई घंटे के लिए जीवित रह सकते हैं।
  5. बाद में छवि विश्लेषण के लिए इमेजिंग फ़ाइलों को एक उपयुक्त स्वरूप (उदाहरण के लिए, Tiff) में सहेजें.

5. छवि विश्लेषण

  1. छवियों का विश्लेषण करने के लिए, फिजी27जैसे छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में Tiff (या समान) फ़ाइलें खोलें.
  2. X और Y दिशाओं में न्यूनतम आंदोलन सुनिश्चित करने के लिए एक आंदोलन सुधार एल्गोरिथ्म का उपयोग कर ढेर संरेखित करें। किसी भी रिकॉर्डिंग है कि जेड अक्ष में मजबूत आंदोलन दिखाने के त्यागें.
  3. जाँच की जानी है जो क्षेत्र के आसपास ब्याज (ROI) के एक क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के उपकरण का चयन करें। यह पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के प्रभाव को सीमित करने के लिए संभव के रूप में सटीक होना चाहिए.
  4. चयनित ROI से डेटा फ़ाइलों के रूप में अस्थायी फ्लोरोसेंट तीव्रता डेटा निकालने के लिए सॉफ्टवेयर के संबंधित उपकरण का उपयोग करें, जैसे कि एक मूल्य रिकॉर्डिंग के प्रत्येक फ्रेम के लिए उत्पन्न होता है।
  5. प्रत्येक गंध ट्रेस के लिए $F/F0 मानों की गणना करने के लिए डेटा विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करके डेटा खोलें. F0 - गंध शुरुआत से पहले 2 s में औसत फ्लोरोसेंट. [F ] किसी दिए गए फ्रेम में कच्चे फ्लोरोसेंट और एफ0के बीच का अंतर। इन मानों से, प्रत्येक फ्रेम के लिए एक $F/F0 मान की गणना करें जिसे गंध प्रोत्साहन अवधि में सापेक्ष फ्लोरोसेंट को प्रतिबिंबित करने के लिए समय के विरुद्ध प्लॉट किया जा सकता है।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल के साथ अधिगृहीत की गई छवियों का एक उदाहरण चित्र 2में देखा जा सकता है। होमर-GCaMP3 एक एमबी उत्पादन न्यूरॉन में व्यक्त किया जाता है जिसका dendrites MB के डिब्बे 1 innervate - लोब (न्यूरॉन MVP228,29कहा जाता है ) और आनुवंशिक रूप से विभाजित-Gal4 लाइन MB112C16का उपयोग कर लक्षित है. इसके अलावा, प्रदर्शन एक cytosolic के subcellular स्थानीयकरण में अंतर है और बाद synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सूचक. जब चित्र 2a और चित्रा 2fकी तुलना, एक स्पष्ट रूप से dHomer-GCaMP3 सेंसर14 के विशिष्ट, commentalized अभिव्यक्ति का निरीक्षण कर सकते हैं - न्यूरॉन के axonal डिब्बों में कोई अभिव्यक्ति के साथ, और एक punctuated संकेत दिखाई डेन्ड्रिटिक डिब्बे में। स्पष्ट - हालांकि कम आयाम गंध प्रतिक्रियाओं dहोमर-GCaMP3 व्यक्त मक्खियों में देखा जा सकता है (चित्र 2, कम पैनलों), cytosolic GCaMP6f23 व्यक्त मक्खियों की तुलना में (चित्र 2, ऊपरी पैनलों). यह दर्शाता है कि उपकरण postsynapse के स्तर पर घ्राण प्रतिक्रियाओं के दृश्य के लिए प्रभावी है, और, इसलिए, अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट की परीक्षा के लिए एक अतिरिक्त विशिष्टता प्रदान करता है, इस मामले में, गंध एन्कोडिंग और घ्राण अधिगम.

उत्तरार्द्ध का एक उदाहरण चित्र 3में देखा जा सकता है। इस प्रयोग में, dहोमर-GCaMP3 चित्र 2 में के रूप में व्यक्त किया है - मशरूम शरीर उत्पादन न्यूरॉन MVP2 में. यह एक न्यूरॉन घ्राण सीखने के माध्यम से संग्राहक होने के लिए जाना जाता है इस तरह है कि versive घ्राण कंडीशनिंग का एक परिणाम के रूप में presynaptic अवसाद प्रशिक्षित गंध के लिए एक मृत postsynaptic प्रतिक्रिया में परिलक्षित होता है28,29 और यहाँ एक इस परिणाम की पुष्टि विवो कैल्शियम इमेजिंग प्रोटोकॉल में इस का उपयोग कर दिखाया गया है. चित्र 3 में दिखाए गए कैल्शियम के निशान एक व्यक्ति के मक्खी से अनुकरणीय डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। ध्यान दें कि शोर स्तर और आयाम अलग-अलग तैयारीकेपन के बीच भिन्न हो सकते हैं (उदा., चित्र 2e और चित्र 3c-eकी तुलना करें)। इसलिए, पूर्व बनाम बाद प्रशिक्षण के एक भीतर पशु तुलना अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के लिए खाते के लिए एक रास्ता प्रदान करता है. बेशक, प्रोटोकॉल ब्याज के अन्य न्यूरॉन्स की इमेजिंग के लिए स्थानांतरित किया जा करने के लिए उपयुक्त है.

Figure 1
चित्र 1: एक बढ़ते कक्ष का निर्माण और इमेजिंग के लिए एक मक्खी की तैयारी. (क)मक्खी बढ़ते चैम्बर के निर्माण के लिए कदम. आधार एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड (1) एक ठीक प्लास्टिक जाल (2) के साथ कवर का गठन किया है. विरोध के आरोप ों को ले जाने वाले दो बिजली के तार (3) दोनों तरफ स्लाइड से चिपके हुए हैं। तारों छीन लिया और स्लाइड पार करने के लिए तुला (4) एक दूसरे के साथ समानांतर चल रहा है लेकिन संपर्क में नहीं. स्पष्ट चिपकने वाला टेप की परतें (5) एक मक्खी की ऊंचाई तक पहुँचने तक जोड़ रहे हैं (लगभग 1 मिमी). एक चैनल टेप खड़ी (6) के माध्यम से काटा जाता है, लगभग 1 मिमी चौड़ा एक मक्खी की चौड़ाई फिट करने के लिए। स्पष्ट चिपकने वाला टेप से बना एक ऊंचा मंच (7) बिजली के तारों के ऊपर बनाया गया है ताकि उड़ते हुए छाती तारों के शीर्ष पर है। (ख)दो-फोटोन सूक्ष्मदर्शी के नीचे स्थित मक्खी का योजनाबद्ध चित्रण। गंध उत्तेजना मक्खी के सिर के सामने तैनात एक hypodermic सुई के माध्यम से प्राप्त की है (टेप में चैनल के माध्यम से डाला (6) और मंच के शीर्ष पर (7) एंटीना के लिए odors प्रत्यक्ष करने के लिए). (ग)-(ज ) मक्खी के सिर को ठीक करना और खोलना। (ग)इमेजिंग चैम्बर के अंदर, चैनल के अंदर स्थिर एक मक्खी (स्केल बार ़ 1 मिमी) और पूरी मक्खी के ऊपर स्पष्ट चिपकने वाला टेप के एक ताजा टुकड़े द्वारा जगह में आयोजित किया जाता है। (घ)स्थिति में मक्खी का बढ़ाया हुआ दृश्य। स्केल बार - 0ण्1 मिमी () एक खिड़की मक्खी के सिर के चारों ओर टेप में काट दी जाती है। (च)सिर को नीले प्रकाश-करिंग गोंद के साथ और स्थिर किया जाता है। () सिर कैप्सूल रिंगर के समाधान से ढका होता है और खोला जाता है। () अतिरिक्त ऊतक और श्वासनली के साथ मस्तिष्क की तैयारी पूरी (सफेद ऊतक () हटा दिया जाता है । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Postsynaptically-स्थानीयकृत कैल्शियम dहोमर-GCaMP3 का उपयोग करके कल्पना की गई। (क)कनफोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को एमबी आउटपुट न्यूरॉन एमवीपी2 में साइटोसोली स्थानीयकृत जीसीएएमपी6एफ (i) और पोस्ट्स की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। हरा तीर एमबी के 1 उपक्षेत्र को इंगित करता है- लोब. स्केल बार्स ] 15 m. (b)- (d) ऊपर जीनोटाइप्स की दो-फोटोन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैप्चर की गई छवियां, संबंधित कैल्शियम सेंसरों के विवो फ्लोरोसेंट को दर्शाती हैं। (ख) एफ0 (बेसलाइन फ्लोरोसेंट) छवियों, गंध शुरुआत से पहले 2 एस की एक औसत तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में प्रदर्शित. स्केल बार्स - 10 डिग्री मी.(ग) एफगंध छवियों (गंध उत्तेजना के दौरान प्रवाह), गंध प्रतिक्रिया अवधि (2.5 s) पर एक औसत तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में प्रदर्शन किया। (घ)वास्तविक गंध प्रतिक्रिया संकेत दिखाने के लिए, F0 छवि को एफगंध छवि से घटाकर उत्पन्न की गई छवियों को। (म्)गंध उद्दीपन (ग्रे छड़) के माध्यम से संबंधित जीनोटाइपों की उपरोक्त मक्खियों से ख्फ्फ्फ्फ्0 निशान ों से पता चलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लर्निंग-प्रेरित पोस्टिनैप्टिक प्लास्टिकलिटी डीहोमर-जीसीएएमपी3 के माध्यम से कल्पना की गई। (क) इन प्रयोगों में प्रयुक्त अनुकूलन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। नाज़ गंध प्रतिक्रियाओं, कंडीशनिंग से पहले ("पूर्व") पहले मापा जाता है. फिर प्रत्येक मक्खी तीन संभव कंडीशनिंग प्रोटोकॉल में से एक अनुभव: "जोड़ी", जहां एक गंध (सीएस+) बिजली के झटके के साथ जोड़ा जाता है (अमेरिका) और एक अन्य (सीएस- )प्रबलित नहीं है; "केवल Odors", जहां केवल odors प्रस्तुत कर रहे हैं, दोनों सुदृढीकरण के बिना, गंध जोखिम प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए; और "शॉक केवल", जहां केवल बिजली के झटके किसी भी गंध उत्तेजनाओं के बिना प्रस्तुत कर रहे हैं, सदमे जोखिम प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए. इस कंडीशनिंग चरण के बाद, मक्खियों तो "पूर्व" odors को फिर से संपर्क कर रहे हैं बदल गंध के लिए परीक्षण करने के लिए गतिविधि ("पोस्ट"). (ख)युग्मित गंध/शॉक प्रस्तुति के परिणामस्वरूप गंध अनुक्रिया मॉडुलन का एक उदाहरण। सीएस+ गंध के लिए प्रतिक्रिया के मजबूत दमन $ 1 उपक्षेत्र (डॉटेड लाइन) में देखा जा सकता है। ( ग)-(ई ) गंध प्रतिक्रिया उसी मक्खी से पता चलता है (), यह दर्शाता है कि यह दमन प्रभाव केवल प्रशिक्षित गंध के मामले में ही देखा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

तंत्रिका circuitry अंतर्निहित सीखने और स्मृति के विच्छेदन तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक प्रमुख लक्ष्य है. Drosophila की आनुवंशिक पहुंच और व्यापकता और व्यवहार परीक्षण की आसानी इस तरह की घटनाओं की जांच करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाता है. यहाँ, एक विधि है जिसके साथ यह कल्पना करने के लिए संभव है प्रस्तुत किया है, व्यक्तिगत मक्खियों के भीतर, मॉडुलन कि घ्राण कंडीशनिंग का एक परिणाम के रूप में एक subcellular स्तर पर होता है. दोनों पूर्व प्रशिक्षण और गंध के बाद प्रशिक्षण दृश्य बाहर ले जाने से कैल्शियम गतिशीलता, पहले हमारे समूह द्वारा स्थापित17,यह एक प्रत्यक्ष आकर्षित करने के लिए संभव है, के बीच पशु तुलना भोले और सीखा गंध प्रतिक्रियाओं और, इसलिए, ब्याज के न्यूरॉन्स की प्लास्टिकता की जांच. यह सामूहिक मूल्यांकन पर इस प्रोटोकॉल के लिए एक लाभ प्रदान करता है (क्लासिक घ्राण कंडीशनिंग में इस्तेमाल किया) क्योंकि पूर्व और बाद प्रशिक्षण राज्यों मात्रात्मक व्यक्तियों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, जो एक अंतर व्यक्तिगत निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है परिवर्तनशीलता. इसके अलावा, प्रशिक्षण प्रक्रिया माइक्रोस्कोप के तहत सीधे प्रदर्शन काफी हद तक शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग प्रतिमान आम तौर पर व्यवहार प्रयोगों में इस्तेमाल करने के बराबर है और न्यूरॉन्स के कृत्रिम optogenetic उत्तेजना शामिल नहीं है. बेशक, छोटी मक्खियों से निपटने और ध्यान से मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना सिर कैप्सूल खोलने जबकि संवेदी अंगों को बरकरार रखने विशेषज्ञता का एक स्तर है कि जटिल और दोहराया प्रशिक्षण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है की आवश्यकता है, हद तक देखा के विपरीत नहीं इस तरह के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में शारीरिक आकलन।

इसके अतिरिक्त, एक न्यूरॉन स्तर पर plasticity की जांच करने के लिए स्थानीयकृत कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है - न्यूरॉन सर्किट विच्छेदन के लिए अधिक से अधिक परिशुद्धता जोड़ने. यह एक अच्छी तरह से जांच एमबी उत्पादन न्यूरॉन28,29में एक postsynaptic प्रतिक्रिया के एक सीखने प्रेरित अवसाद दिखा कर उदाहरण है. यूएएस नियंत्रण के तहत synaptically स्थानीयकृत फ्लोरोसेंट सेंसर की एक किस्म व्यक्त Drosophila उपभेदों उपलब्ध हैं, उदाहरण के लिए, presynaptically स्थानीयकृत सेंसर Synaptophysin-GCaMP3 या synaptic के लाल फ्लोरोसेंट सेंसर व्यक्त संचरण सिन्पोफिसिन-फाटोमा20| बेशक, फ्लोरोसेंट सेंसर प्रोटीन की विविधता ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर लागू किया जा सकता है.

ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक सामान्य सूक्ष्म छवि अधिग्रहण प्रणाली (उदा., एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप) और सेंसर के लौकिक संकल्प (उदा., कैल्शियम सेंसर की गतिजविज्ञान) के लौकिक संकल्प द्वारा सीमित सामान्य रूप में कर रहे हैं। Electrophysiological रिकॉर्डिंग, उदाहरण के लिए, Drosophila मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के सोमा से पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर, अभी भी एक बेजोड़ लौकिक संकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन किसी भी स्थानिक परिशुद्धता प्रदान किए बिना. सेंसर के subcellular स्थानीयकरण के साथ संयुक्त ब्याज के न्यूरॉन्स में जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता के कारण, ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक संभावित न्यूरॉन प्लास्टिक अंतर्निहित को उजागर करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों के पूरक कर सकते हैं सीखने और स्मृति गठन. फ्लोरोसेंट सेंसर के विकास में निरंतर प्रगति शायद तेजी से गतिकी या उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ सेंसर प्रोटीन फ्यूज करने की संभावना प्रदान करेगा (उदाहरण के लिए, GCaMP6 वेरिएंट23)synaptically स्थानीयकृत प्रोटीन के साथ डीहोमर की तरह. इसके अलावा, तेजी से अधिग्रहण दर या उच्च स्थानिक संकल्प के साथ सूक्ष्म तकनीक ों की स्थापना में हाल ही में अग्रिम हमारे दृष्टिकोण के आगे ठीक ट्यूनिंग में अमूल्य साबित होगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB 889 के माध्यम से जर्मन अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था "संवेदी प्रसंस्करण के तंत्र" और अनुसंधान इकाई के लिए 2705 "एक मस्तिष्क सर्किट के विच्छेदन: संरचना, प्लास्टिक और व्यवहार समारोह के Drosophila मशरूम शरीर".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape Tesa SE, Norderstedt, Germany Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 10053-09 Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 11412-11 Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany 4665120 1.20x40mm
Insect Minutien pins Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 26002-10 Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK 953683 Blue light-curing glue
Microscope slide Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany 0656.1 Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution n.a. n.a. 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA 72-1551 5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK 0303 Product No. 11
Surgical scalpel handle Swann-Morton, Sheffield, UK 0907 Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger
from the odor-delivery device and the electric shock
application device (power supply) to interact with the
ZEN software from Zeiss that controls the microscope.
Custom-written and available upon request n.a. n.a.

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References

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