Author Produced

Sammenligning metastatisk klar celle renal celle karcinom model etableret i mus nyre og på Kylling Chorioallantoic Membran

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Metastatisk klar celle nyrecelle karcinom er en sygdom uden en omfattende dyremodel for grundig præklinisk undersøgelse. Denne protokol illustrerer to nye dyremodeller for sygdommen: den ortotopisk implanterede musemodel og kyllingchorioallantoic membranmodellen, som begge viser lungemetastase, der ligner kliniske tilfælde.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastatisk klar celle nyrecelle karcinom (ccRCC) er den mest almindelige undertype af nyrekræft. Lokaliseret ccRCC har et gunstigt kirurgisk resultat. Men, en tredjedel af ccRCC patienter vil udvikle metastaser til lungerne, hvilket er relateret til et meget dårligt resultat for patienterne. Desværre er ingen behandling tilgængelig for denne dødbringende fase, fordi den molekylære mekanisme metastase forbliver ukendt. Det har været kendt i 25 år, at tabet af funktion af von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor genet er patognomonic af CCRCC. Der er dog ikke genereret nogen klinisk relevant transgen musemodel af ccRCC. Formålet med denne protokol er at indføre og sammenligne to nyetablerede dyremodeller for metastatisk ccRCC. Den første er nyreimplantation i musemodellen. I vores laboratorium blev CRISPR-genredigeringssystemet udnyttet til at slå VHL-genet ud i flere RCC-cellelinjer. Ortopisk implantation af heterogene ccRCC populationer til nyrekapslen skabt nye ccRCC modeller, der udvikler robuste lunge metastaser i immunkompetente mus. Den anden model er kylling chorioallantoic membran (CAM) system. I forhold til musemodellen er denne model mere tid, arbejdskraft og omkostningseffektiv. Denne model støttede også robust tumordannelse og intravasation. På grund af den korte 10 dages periode med tumorvækst i CAM blev der ikke observeret åbenlys metastase af immunhistokemi (IHC) i det indsamlede embryonvæv. Men, når tumor vækst blev forlænget med to uger i udklækket kylling, mikrometastatisk ccRCC læsioner blev observeret af IHC i lungerne. Disse to nye prækliniske modeller vil være nyttige til yderligere at studere den molekylære mekanisme bag metastase, samt at etablere nye, patient-afledte xenografts (PDXs) mod udvikling af nye behandlinger for metastatisk ccRCC.

Introduction

Renal celle karcinom (RCC) er den 7th mest almindelige kræft i USA. Årligt, 74.000 amerikanere skønnes at være nydiagnosticeret, tegner sig for mere end 14.000 dødsfald (Clear-celle histologisk undertype, eller ccRCC, er den mest almindelige undertype, tegner sig for omkring 80% af RCC tilfælde. Patienter med lokaliseret malignitet behandles med nefrotomi og har en gunstig 5-årig overlevelsesrate på 73%1. Men, 25%-30% af patienterne udvikler fjerne metastaser til vitale organer såsom lungerne, hvilket resulterer i en dårlig gennemsnitlig overlevelse på 13 måneder og 5-årig overlevelsesrate på kun 11%1,2,3. Yderligere forståelse af den metastatiske mekanisme er nødvendig for at forbedre det dødelige resultat for metastatisk ccRCC.

Tabet af VHL tumor suppressor genet er et kendetegn en genetisk læsion observeret i et flertal af humane ccRCC tilfælde4,5,6,7. Den præcise onkogene mekanisme for VHL-tab i CCRCC er imidlertid ukendt. Også, VHL udtryk status er ikke forudsigende for resultatet i CCRCC8. Især, på trods af talrige forsøg på renal-epitel-målrettet VHL knockout, forskere har undladt at generere nyreabnormitet ud over de præneoplastiske cystisk læsioner observeret i mus9, selv når det kombineres med sletning af andre tumor suppressors såsom PTEN og p5310. Disse resultater understøtter tanken om, at VHL tab alene er utilstrækkelig til tumorigenese eller den efterfølgende spontane metastase.

For nylig har vores laboratorium skabt en ny VHL knockout (VHL-KO) cellelinje ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret sletning af VHL genet i murine VHL + ccRCC cellelinje (RENCA, eller VHL-WT)11,12. Vi viste, at VHL-KO ikke kun er mesenkymale, men også fremmer tilnavn i forbindelse med mesenkymale overgang (EMT) af VHL-WT celler12. EMT er kendt for at spille en vigtig rolle i den metastatiske proces13. Vores arbejde viste yderligere, at fjerne lungemetastase kun forekommer med co-implantation af VHL-KO og VHL-WT celler i nyrerne, støtte en kooperativ mekanisme af metastase. Det er vigtigt, at vores ortotopisk implanterede VHL-KO og VHL-WT-modellen fører til robuste lungemetastaser, hvilket opsummerer de kliniske ccRCC-tilfælde. Denne spontane metastatiske ccRCC model kompenserer for manglen på en transgen metastatisk musemodel, især i udviklingen af nye anti-metastase lægemidler. Denne protokol viser renal kapsel implantation af de heterogene cellepopulationer af genetisk manipuleret RENCA celler.

Kylling CAM modeller har en lang historie i forskning for angiogenese og tumor biologi på grund af deres mange fordele, som opsummeret i tabel 114,15,16,17,18. Kort, tidsvinduet for CAM tumor vækst er kort, så højst 11 dage, indtil CAM er ødelagt ved udklækning afkyllingen 16. På trods af den korte væksttid muliggør kyllingefosterets rige ernæringsforsyning og immundefekttilstand meget effektiv tumorengraftment16,19,20,21. Endelig er omkostningerne ved hvert befrugtet æg ~ $ 1, sammenlignet med over $ 100 for en SCID mus. Sammen kan CAM-modellen fungere som en værdifuld alternativ dyremodel i etableringen af nye PDX'er til en stor besparelse i tid og omkostninger i forhold til musen. I denne protokol vurderede vi, om modellen var i stand til at opsummere biologien af metastatisk ccRCC observeret i musen ortotopmodel.

(SCID) Musen Cam Bemærk
Omkostninger >$100 hver ~$1 hver Levedygtighed fra 50-75%
Behov for barriereboliger Ja Nej Yderligere reducerer omkostninger & forenkler seriel overvågning af tumorer
Tumor direkte synlig Nej Ja Figur 3A
Tid til første indskrivning (RENCA) 2 uger 2-4 dage ref 14, 15
Vækstens slutpunkt (RENCA) 3-6 uger 10 dage ref 14, 15
Metastase (RENCA) observeret Ja Ja i kyllinger Figur 3D
Serielle passager Ja Ja ref 16-18
Passage til mus (RENCA) Ja Ja Hu, J., et al. under revision (2019)
Opretholde tumor heterogenitet Ja Ja Hu, J., et al. under revision (2019)

Tabel 1: Fordele og begrænsninger af muse- og CAM-modellerne. Denne tabel sammenligner de to modeller for deres fordele og begrænsninger i form af krævede tid, omkostninger, arbejdskraft, samt biologi. CAM-modellen har fordele i effektivitet, men den har også sine egne unikke begrænsninger på grund af de forskellige morfologier mellem fugle og pattedyr. Derfor er det vigtigt at bekræfte, at modellen kan bevare xenografts' biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Den Institutionelle Dyrepleje- og Brugskomité (IACUC), der er udpeget som UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 og ARC 2017-102-01A). 2002-049-53 protokollen er optimeret til implantation af ccRCC tumorceller i nyrekapslen af Nude eller BALB/c mus. Tumorimplantationseksperimenter i befrugtede kyllingeæg før udklækning kræver ikke IACUC-godkendelse. For at forlænge tiden for etablering af lungemetastase, embryoner med CAM tumor får lov til at luge og vokse til kyllinger. 2017-102-01A-protokollen dækker disse dyreforsøg.

1. Ortotopiske tumor undersøgelser i mus

BEMÆRK: Tidslinjen for dette eksperiment vises i figur 1A. Disse procedurer blev tilpasset fra tidligere publikationer11,12.

  1. Forberedelse af enkeltcellesuspension til podning
    1. Tag RENCA VHL-WT- og VHL-KO-cellerne af fra kulturretterne ved hjælp af trypsin/EDTA.
    2. Tæl cellerne med et hæmocytometer og ophæng igen i en forkølet 1:1 blanding af PBS og ekstracellulær matrixopløsning ved en koncentration på 1 x 105 celler/μL.
      BEMÆRK: Brug et 1:4-forhold mellem VHL-WT:VHL-KO-celler til heterogene implantater og VHL-WT alene til homogene implantater.
    3. Overfør de opslæluede celler til et mikrocentrifugerør på 1,5 ml, og hold på is, indtil implantationen implanteres.
  2. Implantation til nyrekapsel
    1. Anæstesi: Forvarm en varm pude til 37 °C og dæk den med et stykke tyk steril forhæng. Bedøve musen ved enten isofluran indånding via et induktionskammer eller intraperitoneal (IP) injektion af 1% pentobarbital natrium ved dosering af 10 ml/kg.
    2. Barber håret fra operationsstedet. Dette trin kan springes over for nøgne mus.
    3. Desinfektion og kirurgisk drapering: Desinficere bagsiden af musen helt med povidone-jod 3x efterfulgt af 70% ethanol 1x og tørre det tørre med sterile vatpinde. Derefter anvende tre sterile medicinske forbindinger sekventialtially, der dækker hele ryggen for at skabe et kirurgisk felt samt at immobilisere musen.
    4. Incision og nyre eksteriørisering: Før operationen, desinficere operatørens fingre med povidone-jod eller bruge et par sterile handsker. Placer musen i den udsatte position og bruge fingrene til at finde den venstre nyre lige under venstre flanke. Brug et par stumpe pincet og saks til at skære huden åben og muskellaget under det angivne sted. Brug sterile vatpinde og pincet til delvist at eksteriøre venstre nyre ud af maven.
    5. Tumorcelleimplantation: Læg celleaffjedringen forberedt i trin 1.1 i enten insulinsprøjter eller tilpassede Hamilton-sprøjter (se Tabel over materialer for specifikationer). Tilføres 20 μL af resuspenderede celler under nyrekapslen.
      BEMÆRK: Vellykket injektion bestemmes af dannelsen af en gennemsigtig bule på overfladen af nyrerne. Utilsigtet injektion i nyreparenkymresulterer i blødning og en postoperativ dødelighed helt op til 90 % på grund af dødelig blødning på injektionsstedet.
    6. Træk langsomt nålen ud for at gøre det muligt for den ekstracellulære matrixopløsning at størkne og forhindre blødning eller tumorcellelækage. Derefter, ved hjælp af en steril vatpind, skubbe nyrerne tilbage i maven.
    7. Sårsyning: Brug en 5-0 belagt VICTRYL sutur til at sy muskellaget. Desinficere huden med povidone-jod én gang og luk huden med sår autoclips.
    8. Recovery: Placer musen på den varme pad, indtil den vågner op. Hvis musen blev besaltet ved indånding, trække isofluran og holde musen på den varme pad, indtil det er vågen.
  3. Bioluminescensbilleddannelse (BLI) og vævsopsamling
    1. Seks uger efter tumor implantation, tage firefly-luciferase-baserede BLI billeder. Derefter aflive mus med isofluran indånding efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
    2. Indsamle blod til cirkulerende tumorcelle (CTC) påvisning ved flow cytometri.
    3. Høst tumor og organer af interesse (nyrer, lunger, lever, tarme, og milt) ved hjælp af en steril væv høst teknik22. Fix dem i 4% paraformaldehyd natten til paraffin-voks indlejring.

2. CAM tumor xenograft model

BEMÆRK: Disse procedurer blev tilpasset og ændret fra tidligere offentliggjorte protokol23,24. Tidslinjen for denne procedure er vist i figur 1B. Denne artikel indeholder kun den strømlinede protokol. For detaljerede protokoller, henvises til en anden JoVE artikel offentliggjort af vores gruppe25.

  1. Preinkubation: Inkuber frisklagte, befrugtede kyllingeæg i en roterende ægkuvøse ved 37 °C og 55-65% fugtighed i 7 dage.
  2. Drop CAM og åbent vindue (udviklingsmæssige dag 7):
    1. Find og marker luftsækken og venerne.
      BEMÆRK: Normalt 10-15% af æggene fjernes, fordi de er enten ubefrugtede eller dør inden for 7 dage efter befrugtning.
    2. Opret en ny luftsæk oven på en markeret vene.
    3. Afgrænse den nye luftsæk, anvende pakning tape, og sætte æggene tilbage til kuvøse.
      BEMÆRK: Proceduren kan sættes på pause her. Det anbefales at genoptage procedurerne inden for samme dag, fordi luftsækken kan bevæge sig.
    4. Åbn et vindue: Brug et par buede mikrodissekere saks og et par nål-næse pincet, skære en 1,5 x 1,5 cm cirkulært vindue i skallen.
      BEMÆRK: Afbrydelse af CAM indikeres af blodet og et stykke CAM til stede på det afskårne skalstykke.
    5. Forsegle hullet med gennemsigtig medicinsk dressing og læg æggene i en stationær kuvøse ved 37 °C og 55%-65% fugtighed.
      BEMÆRK: Brug samme ægkuvøse som i trin 2.1. Sluk for rotatoren for at gøre den stationær.
  3. Helbredstjek (udviklingsmæssige dag 9): Fjern døde æg og derefter tilfældigt gruppere resten af æggene til tumorcelleimplantation.
    BEMÆRK: Ideelt set er overlevelsesraten på dette punkt ca. 80% af udviklingsdagen 0.
  4. Podning tumorcellerne på den nyligt eksponerede CAM (udviklingsmæssige dag 10)
    1. Fortynd den ekstracellulære matrixopløsning i dobbelt så stor volumen af forkølet RPMI 1640 (med L-glutamin). Tag RENCA-cellerne af og ophæng igen i ovenstående opløsning for at nå en koncentration på 2 x 104 celler/μL.
      BEMÆRK: Brug et 1:1-forhold mellem VHL-WT:VHL-KO-celler til heterogene implantater og VHL-WT alene til homogen implantation.
    2. For at forfastisere celleaffjedringen fyldes 100 μL af hver celleblanding i 200 μL pipettespidser og anbringes i en cellekuvøse i 15 minutter.
    3. Implanter 100 μL celleaffjedring for hvert æg på CAM-overfladen gennem vinduet.
      BEMÆRK: Nogle protokoller kræver ridser CAM før implantation23. Dette er ikke nødvendigt for RENCA celler, fordi de vokser meget hurtigt.
  5. Dyrk celler på CAM i 10 dage og fotografer hver 2.
  6. Aflivning og høst tumor, blod og organer.
    1. På udviklingsmæssige dag 20 (tumor dag 10), indsamle blod via chorioallantoic vene med en heparinized 10 ml sprøjte.
    2. Aflive embryonerne ved at lægge dem på is i 15 min.
    3. Høst og vejer tumorer. Dissekere lunger og lever ved hjælp af en steril vævhøstteknik svarende til den, der anvendes til mus22.
      BEMÆRK: Kyllinger lever har to lapper, som er de første organer ses i bughulen. Du må ikke forveksle disse med lungerne. Kyllinglungerne er placeret under hjertet og septum26. Den vellykkede samling af lungerne kan bekræftes af udsatte ribben.
    4. Fix tumorer og dissekeret organer i 4% paraformaldehyd natten til paraffin-voks indlejring.
  7. Udklække kyllingerne.
    1. For at muliggøre en længere periode med tumorvækst skal du fortsætte inkubationen gennem dag 21 og lade kyllingerne klække ved 37 °C og mindst 60% fugtighed.
      BEMÆRK: Kyllinger naturligt luge efter dag 21 over en 24 timer periode, men lejlighedsvis har problemer udklækning af sig selv. I dette tilfælde, revner æggeskaller nogle hjælper. Det er vigtigt for kyllinger at fuldføre rugeprocessen inden for 24 timer, fordi de vil dø af mangel på næringsstoffer efter da.
    2. Dyrk kyllingerne på et dyreanlæg (2017-102-01A) i 2 uger.
    3. På udviklingsmæssige dag 34 (tumor dag 24), aflive kyllinger med isofluran indånding efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
    4. Dissekere lungerne ved hjælp af en steril vævshøstteknik svarende til dem, der anvendes til mus22. Derefter fastsætte dem i 4% paraformaldehyd natten til paraffin-voks indlejring.

3. Immunhistokemi

BEMÆRK: Alle vævsskæringer og H&E farvning blev udført af Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) ved University of California, Los Angeles.

  1. Bag dias ved 65 °C i 20 min og deparaffiniser3x ved hjælp af xylen og rehydrere riær seriel fra 100% ethanol til vand.
  2. Antigenerne hentes i en citratbuffer kogt i en grøntsagsdamper i 25 min.
  3. Anvend 1% BSA for blokering. Derefter anvendes de primære antistoffer (anti-VHL, anti-HA, anti-flag) fremstillet ved et 1:200 fortyndingsforhold i PBS. Inkuber natten over ved 4 °C.
  4. Efter vask 3x med TBST (7 min hver), inkubere dias med det sekundære antistof ved 1:200 fortynding. Vask 3x med TBST (7 min hver) og anvende DAB reagenser efterfulgt af hæmatoxylin counterstaining.

4. Flow Cytometri

  1. Proces musen eller kyllingblod med røde blodlegemer (RBC) lyseis buffer i henhold til producentens protokol.
    BEMÆRK: Tilstrækkelig RBC lyseis er især vigtigt, når man analyserer CAM blod, fordi kylling NBC'er er nukleret og ikke let kan skelnes i flow cytometri ved hjælp af frem og side scatter.
  2. Kør flow cytometri på blodet lysate og analysere data for mStrawberry og EGFP udtryk.
  3. Indstil de primære porte baseret på fremad- og sidespredningen eksklusive snavs, døde celler og ulyserede RBC'er.
  4. Indstil fluorescensportene baseret på de ufarvede prøver og enkeltfarvede kontroller. Brug blod lysate primet med VHL-WT, VHL-KO, eller umærkede RENCA celler som enkelt farvede kontroller og ufarvede kontrol, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hvert eksperiment blev udført mindst 3x medmindre andet er angivet. Data præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Betydning blev bestemt af en parret, Student's T-test, når der var to grupper eller af en envejs ANOVA, når der var tre eller flere grupper. En p-værdi cutoff på 0,05 blev brugt til at fastslå betydningen.

Ortopisk implanterede RENCA celler med succes voksede på mus nyrerne, som bekræftet af BLI og H & E farvning (Figur 2A-B). Selv om der ikke var nogen forskel i den primære vækst, kun den heterogene, metastatisktumor havde robust metastase til lungerne som angivet af den meget stærke BLI signal og metastatiskknuder i H & E farvning. På den anden side, homogene, ikke-metastatiske tumorer ikke metastasere til fjerne organer. CTC-tællinger var højere hos mus, der forsynet med metastatiske tumorer end dem, der forsynet med ikke-metastatiske tumorer (Figur 2C-D).

I overensstemmelse med musemodellen, cam-systemet held bevaret vækst og metastatisk adfærd RENCA tumorer. Mens der ikke var nogen vækstforskel mellem metastatiske og ikke-metastatiske tumorer, CTC tæller var betydeligt højere i æg med metastatiske tumorer end dem med ikke-metastatiske kolleger (Figur 3A-C). Udklækning af æg med CAM tumorer og gør det muligt for kyllingerne at vokse yderligere to uger forlænget perioden for metastatiske kræftceller til at etablere histologisk påviselige metastaser i lungerne af kyllinger, som vist i H & E og HA pletten af kylling lungevæv sektioner (Figur 3D). Størstedelen af de metastatiske knuder bestod af HA-mærkede VHL-WT-celler, mens flagmærkede VHL-KO sjældent blev set, som vi har observeret i mus.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over de to dyremodeller for metastatiske ccRCC xenografts. (A) Skematisk repræsentation af musen ortotopmodel. 3- eller 4 uger gamle mus er ortotopisk implanteret med enten ikke-metastatiske eller metastatiske tumorer. Seks uger efter implantation, tumor vækst og metastase blev visualiseret med BLI. Derefter blev tumor, blod og organer indsamlet til downstream-analyser. (B) Skematisk repræsentation af CAM-modellen, der viser følgende trin: Forinkubation, vinduesåbning, celleimplantation og dødshjælp før eller efter udklækning. De samme analyser som musemodellen udføres for de indsamlede prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tumorvækst og metastase i ortotopisk implanterede mus. (A) BLI af mus og udvindelige organer (nyre, lunge, lever, tarm og milt) 6 uger efter ortotopimplantation af RENCA-celler. Venstre: ikke-metastatisk (ikke-opfyldt), højre: metastatisk. B) Bruttoudsyn og stigende forstørrelse af H&E-farvning for nyrer og lunge (20x og 100x). Venstre: ikke-metastatisk (ikke-opfyldt), højre: metastatisk. (C) Repræsentativ flowanalyse til påvisning af mStraw+ og EGFP+-celler, der cirkulerer i blodet. (D) Procent befolkning graf af cirkulerende mStraw + og EGFP + celler. Ikke-opfyldt: ikke-metastatisk. Panel A blev tilpasset fra Hu et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tumorvækst og metastase i CAM-modellen. (A) RENCA tumorer dyrket i CAM. Der var 7 gentagelser for hver gruppe. Ikke-opfyldt: ikke-metastatisk. (B) Repræsentativ flowanalyse til påvisning af mStraw+ og EGFP+-celler, der cirkulerer i blodet. (C) Procent befolkning graf af cirkulerende mStraw + og EGFP + celler. **p < 0,01. (D) IHC farvning af lungerne fra en 2-ugers gammel kylling forsynet med en metastatisk tumor i sin embryonale fase. Fra venstre viser afsnittene H&E, HA og flagfarvning. #: kylling lungearterie; pilespids: metastatiske knuder. Dette tal blev tilpasset fra Hu J et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For mange patienter med epitelmaligniteter er metastase til vitale organer den primære årsag til dødelighed. Derfor er det vigtigt at finde den underliggende mekanisme og en ny mulighed for behandling for metastatisk sygdom. Desværre er der mangel på relevante metastatiske ccRCC dyremodeller. Udfordringen skyldes for en stor del den manglende evne til at genskabe ccRCC i mus på trods af dannelsen af talrige transgene nyre epitel-målrettede VHL knockout musemodeller9,10. Her demonstrerer vi metoderne til at etablere en implantabel metastatisk ccRCC tumor i to dyresystemer, musen og kylling CAM. Disse resultater valideret metastatisk adfærd af tumorer i to forskellige miljøer, og dermed give unikke muligheder for yderligere at undersøge den molekylære mekanisme metastase. I den første model blev den heterogene RENCA-population implanteret til immunkompetente mus ortotopisk til deres nyrekapsel. Efter 6 uger, disse mus viste grasserende lunge metastase. I overensstemmelse med musemodellen voksede implantationen af heterogene RENCA-celler på CAM med succes og intravasated i blodet af kyllingembryonerne. Ved at forlænge tumorvækstperioden til 2 uger efter udklækning, lunge metastaser ligner dem, der ses i musen blev observeret i kyllinger.

For begge modeller, omhyggelig opmærksomhed på de tekniske detaljer i hvert trin og praksis for at forbedre tekniske færdigheder er afgørende for at øge dyrs overlevelse og vellykket tumor engraftment og metastase. For musen model, omhyggelig valg af udstyr og nøjagtig injektion af tumorceller til nyre-kapsel maksimerer succesraten ved at reducere post-operative dødelighed og øge chancen for tumoren for at få en tilstrækkelig blodforsyning til at vokse og Metastaserer. CAM-modellen kræver mere optimering i opsætningen og teknikken. I vores undersøgelser var embryons levedygtighed under 30 % i begyndelsen. Det er vigtigt at holde både temperatur og fugtighed til det ønskede niveau på alle tidspunkter ved at have godt udstyr, hyppig overvågning, og hurtigere gennemførelse af procedurerne. Selv efter optimering, overlevelsesevne varierer fra 50-75% afhængigt af eksperimentatoren og det enkelte parti af æg. Det anbefales altid at bestille ekstra æg til backup. Det er vores erfaring, at mestre CAM teknikker kræver over 1 år. Droppe CAM membran og åbne vinduet er det kritiske trin, hvor utilsigtet, dødelig skade på fosteret oftest opstår. Kyllingefosterets levedygtighed kan forbedres ved at forebygge beskadigelse af CAM' en.

Der er flere begrænsninger for CAM tumor model. Første er anvendeligheden af modellen til alle tumor celletyper. Vi har haft en 100% succesrate indponing forskellige etablerede tumor celle linjer på CAM, herunder nyre, blære, og prostata tumor celle linjer (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) og kræft i æggestokkene celle linjer (ID8 og SKOV3). To yderligere undersøgelser fra vores gruppe giver yderligere oplysninger om disse CAM tumorer25,27. Men, væksten af nogle kræft i æggestokkene celler på CAM er forstærket af tilskud af vækstfaktor eller tumor-associerede celler25. Optimering af celletal eller væsentlige vækstfaktorer for hver cellelinje eller type er vigtig. Vi inkorporerer også reporter- eller markørgener, såsom luciferase, proteintags (f.eks. HA eller flag) eller fluorescenstags (f.eks. mStrawberry eller EGFP), for at lette overvågningen af tumorens vækst og metastase hos dyrene25,27. Baseret på vores erfaring, et stort flertal af prolifererende kræft cellelinjer kan etableres på CAM. En vigtig begrænsning for engraftment kan være den korte 10 dages vindue tilladt for tumor vækst, som kunne være særligt udfordrende for en langsom voksende cellelinje til at etablere tilstrækkelig masse i så kort tidsramme.

En anden mangel ved CAM-modellen er forskellen i fysiologi mellem det aviærembryo og pattedyr. Metastase fra CAM tumor til større organer såsom leveren eller lungerne af fosteret er blevet påvist overvejende ved følsomme PCR teknikker28. Den korte vækstperiode i CAM ville være utilstrækkelig til at etablere store metastatiske læsioner, der kan verificeres ved histologiske analyser. Desuden er den reducerede vaskulære perfusion af den uoppustede embryo lunge ikke gunstig for at etablere eller støtte væksten af lungemetastaser. For at overvinde disse begrænsninger, en godkendelse fra vores institutionelle dyr brug udvalg (IACUC) blev opnået for at luge kyllinger fra CAM tumor forsynet med embryoner og hus dem yderligere 2 uger efter udklækning. Udvidelse af tidspunktet for tumor vækst på denne måde gjorde det muligt for os at opdage fjerne lunge metastaser af IHC. Selv om de udklækkede kylling undersøgelser kræver den ekstra IACUC godkendelse, CAM tumor undersøgelser ikke, denne tilgang giver en værdifuld mulighed for at studere den metastatiske kaskade hos kyllinger som tidligere gjort i mus. Kylling immunsystemet er blevet rapporteret til at udvikle starter på dag 12 post befrugtning20. I betragtning af den høje effektivitet af engrafting murine afledt RENCA tumorer rapporteret her og mange andre menneskelige kræft cellelinjer og PDXs i CAM på dag 10 efter befrugtning24,25,27,kunne vi udlede, at immunsystemet i fosteret ikke er fuldt udviklet på dette punkt. Samspillet mellem kyllingens immunsystem og CAM tumor eneog nast berettiger klart yderligere undersøgelse.

Vores arbejde giver stærke støttende beviser for, at CAM tumor model kunne være en simpel indledende in vivo model til at studere kræftbiologi, herunder metastase. På grund af de begrænsninger, der er nævnt ovenfor, cam-modellen bør ikke erstatte musemodellen, men supplere den. Vores igangværende forskning tyder på, at signalkrydsning mellem heterogene cellepopulationer i ccRCC er medvirkende til at styre metastatisk progression11,12. Brugen af både CAM og mus modeller kan være et værdifuldt middel til at validere den metastatiske krydstale på spil i CCRCC. Vi mener, at de mange fordele ved CAM-modellen, der præsenteres her, kan fremskynde opdagelsen af nye metastatiske mekanismer og effektive behandlinger for at afhjælpe denne dødelige fase af kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af UCLA JCCC frø tilskud, UCLA 3R tilskud, UCLA CTSI, og UC TRDRP (LW). Vi takker Crump Institute's Preclinical Imaging Facility, TPCL, og UCLA's Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) for deres hjælp med eksperimentelle metoder. Flow cytometri blev udført i UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, der støttes af National Institutes of Health awards P30 CA016042 og 5P30 AI028697, og af JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine på UCLA, UCLA kanslerkontor, og UCLA Vice Chancellor's Office of Research. Statistik rådgivning og dataanalyse tjenester blev leveret af UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiologi, og Research Design (BERD) Program, der støttes af NIH / National Center for Fremme Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353, (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23, (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15, (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15, (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45, (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19, (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31, (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5, (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8, (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328, (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14, (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32, (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182, (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136, (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16, (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2, (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33, (2), 255-268 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics