用于打印 3D 细胞-拉丹胰腺组织构造的胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水

* These authors contributed equally
Bioengineering

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Summary

去细胞化细胞外基质(dECM)可以提供合适的微环境线索,以在工程结构中重述目标组织的固有功能。本文阐述了胰腺组织去细胞化、胰腺组织衍生dECM生物油墨评价以及利用生物印刷技术生成3D胰腺组织构造的方案。

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Kim, J., Kim, M., Hwang, D. G., Shim, I. K., Kim, S. C., Jang, J. Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs. J. Vis. Exp. (154), e60434, doi:10.3791/60434 (2019).

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Abstract

胰腺胰岛移植是1型糖尿病患者有低血糖和继发性并发症的一种有前途的治疗方法。然而,胰岛移植仍然有几个限制,如移植胰岛由于贫困胰岛移植和恶劣环境而存活率低。此外,从人类多能干细胞中分化的胰岛素生成细胞具有有限的分泌足够的激素的能力,这些激素可以调节血糖水平;因此,迫切需要通过培养具有适当微环境线索的细胞来改善成熟。在本文中,我们阐明了制备胰腺组织衍生的细胞外基质 (pdECM) 生物墨水的协议,以提供一个可增加胰腺胰岛葡萄糖敏感性的有益微环境,然后描述使用基于微糊精的生物印版技术生成3D胰腺组织构建的过程。

Introduction

最近,胰腺胰岛移植被认为是对1型糖尿病患者的一种有前途的治疗方法。该手术的相对安全性和最小侵入性是这种治疗1的很大优势。然而,它有一些限制,如分离胰岛的低成功率和免疫抑制药物的副作用。此外,由于恶劣的环境2,移植后移植胰岛的数量稳步减少。各种生物相容性材料,如藻酸盐、胶原蛋白、聚(乳胶共甘油酸)或聚乙烯乙二醇(PEG)已应用于胰岛移植,以克服这些困难。

3D细胞打印技术以其巨大的潜力和高性能在组织工程中不断涌现。不用说,生物油墨被称为提供合适的微环境,并促成印刷组织结构中细胞过程改善的重要成分。大量的剪切变薄水凝胶,如纤维蛋白、藻酸盐和胶原蛋白被广泛用作生物油墨。然而,与原生组织3中的细胞外基质(ECM)相比,这些材料表现出缺乏结构、化学、生物和机械的复杂性。微环境提示,如胰岛和ECM之间的相互作用,是增强胰岛功能的重要信号。脱细胞化ECM(dECM)可以重新创建各种ECM成分的组织特异性组合物,包括胶原蛋白、糖氨基甘油(GAG)和糖蛋白。例如,保留其周围E意象带的初级胰岛(例如,I型、III型、IV型、V型和VI型胶原蛋白、拉米宁和纤维素)表现出低细胞凋亡和更好的胰岛素敏感性,这表明组织特异性细胞-基质相互作用对于增强其与原始组织4类似的功能能力非常重要。

在本文中,我们阐明了制备胰腺组织衍生的去细胞外基质(pdECM)生物油墨的方案,为增强胰腺胰岛的活性和功能提供有益的微环境提示,然后使用基于微糊精的生物印刷技术生成3D胰腺组织结构的过程(图1)。

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Protocol

猪胰腺组织是从当地的屠宰场收集的。动物实验得到了韩国首尔亚山医学中心机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

1. 组织去细胞化

  1. 准备脱细胞化的解决方案。
    注:所有溶液制剂中使用的1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过向10x PBS中加入蒸馏水稀释。
    1. 对于 1% Triton-X 100 溶液,使用磁搅拌棒在 150 rpm 下搅拌 6 小时,在 900 mL 的 1x PBS 中溶解 100 mL 的 100% Triton-X 100 溶液。使用 40mL 的 Triton-X 100 溶液和 360 mL 的 1x 溶液,使 400 mL 的 Triton-X 100 溶液PBS 在使用前准备。
      注:10% Triton-X 100 溶液可在室温下储存,直到需要为止。
    2. 对于0.1%的过乙酸溶液,在使用前将8.5 mL的4.7%过氧乙酸稀释成22.8 mL的70%乙醇,使用前使用368.7 mL蒸馏水。
  2. 在去细胞化之前,切除胰腺的周围组织并切片。
    1. 用自来水清洗被切除的猪胰腺,并用消毒剪刀去除周围组织。
    2. 将胰腺转移到塑料袋中,用钳子冷冻在-80°C下1小时,以帮助有效切割胰腺,为下一步。
    3. 使用搅拌机将冷冻胰腺切成 1 毫米厚的片件。
    4. 将50克切片组织转移到500 mL塑料容器中。
      注:此处推荐使用带盖子的塑料容器,以保护组织免受污染并防止溶液蒸发。
  3. 用试剂治疗。
    注:整个去细胞化过程应在4°C下在150rpm的数字轨道摇床上进行。在所有去细胞化步骤中,需要使用钳子进行物理分离,以防止胰腺切片粘在一起。使用蒸馏水清洗容器是彻底去除容器中残留试剂所必需的。
    1. 在进行任何试剂处理之前,使用摇床用 300 mL 蒸馏水清洗 50 克切片胰腺。
    2. 在 150 rpm 转速下连续搅拌组织,直到浑浊的水消失(大约 12 小时后)。每 2 小时更换一次蒸馏水。
      注意:建议每小时更换蒸馏水一次,以提高效率,以更快地去除浑浊的水。
    3. 丢弃水,用 400 mL 的 1% Triton-X 100 在 1x PBS 溶液中处理 50 g 组织,每次 84 小时刷新一次溶液。
      注:此时,组织量将减少,因为细胞成分开始被移除。
    4. 用400 mL的异丙醇 (IPA) 治疗 2 小时,从胰腺中去除剩余的脂肪。
      注:由于在这个过程中去除脂肪,组织变得坚韧是正常的。
    5. 2小时后,取出 IPA,用 400 mL 的 1x PBS 清洗组织 24 小时。每 12 小时刷新 1x PBS。
    6. 要对脱细胞组织进行灭菌,丢弃以前的溶液,用4%乙醇中的400 mL 0.1%的过乙酸处理2小时。
    7. 要去除残留洗涤剂,请用 400 mL 的 1x PBS 清洗组织 6 小时,每 2 小时刷新一次溶液。
    8. 将脱细胞组织与钳子一起收集在50 mL锥形管中。
    9. 将样品在-80°C冷冻1小时。用无绒抹布代替盖子盖住圆锥管,并用橡皮筋固定,以便有效冻干。
    10. 在-50°C下使脱细胞组织冻干4d。
      注:对于步骤1.3,1克非细胞化组织也应在相同条件下冷冻干燥。

2. 脱细胞组织评估

注:要评估脱细胞组织中dsDNA、甘油糖和胶原蛋白与原生组织相比的残留量,一个非细胞化组织(原生组织)和脱细胞组织至少需要1克一批评估。dsDNA、GAG 和胶原蛋白的量可以根据组织的干重计算。

  1. 为生化检测准备解决方案。
    1. 准备木瓜溶液进行样品消化。
      注: 可以根据样本数量调整要制作的缓冲器量。
      1. 在10 mL的高压水中溶解119毫克的0.1M磷酸钠(单基),18.6毫克的0.5m Na2-EDTA,以及8.8毫克的5mM半胱氨酸-HCl。
      2. 通过添加 10 M NaOH 溶液,将溶液的pH量调整到 6.5。
      3. 在上述溶液和涡旋中加入125 μL的10mg/mL木瓜素溶液,使每个元素均匀混合。
    2. 为二甲基亚甲蓝 (DMMB) 测定准备解决方案。
      1. 要制造DMMB染料,在500 mL的高压水中溶解8毫克1,9-二甲基-二甲基蓝色氯化锌双盐、1.52克甘氨酸和1.185克NaCl。通过添加 0.5 M HCl 溶液,同时使用台式 pH 计测量 pH 变化,将 pHH 调整为 3。然后,通过 500 mL 瓶顶真空过滤器进行过滤。
      2. 使15μL的10毫克/mL软骨素硫酸软骨素一种溶液为标准。
    3. 为羟丙氨酸测定准备解决方案。
      1. 对于氯胺工作溶液,在24 mL蒸馏水中溶解2.4克醋酸钠、1克柠檬酸和0.68克氢氧化钠,加入240μL的冰川醋酸、10μL的甲苯和6 mL的IPA。
        注:使用涡旋混合器溶解溶液中的所有粉末。氯胺工作溶液可在4°C下储存长达三个月。
      2. 对于氯胺T溶液,在20 mL的氯胺工作溶液中溶解0.35克氯胺T,并加入2.5 mL的IPA。涡旋混合所有组件。
        注:在使用前立即准备。
      3. 对于P-DAB溶液,将3.75克P-DAB放入6.5 mL的高氯酸和15 mL的IPA中;把它包裹在铝箔里。
        注:在使用前立即准备。
  2. 在1.5 mL微离心管和涡流管中加入1mL的木瓜溶液到10mg的冻干组织中,以更好地消化样品。
  3. 将 1.5 mL 微离心管放入橡胶架中,在含有 300 mL 水的 500 mL 烧杯中消化样品,在 60°C 下 16 小时。
  4. 在9,500 x g下离心20分钟,收集上清液,并将其转移到新管中。
  5. 量化脱细胞组织中的残留DNA和主要蛋白质。
    1. 将1μL的消化样品加载到光谱仪中,并根据制造商的说明测量dsDNA的量。
      注:实验者应把头发系在背上,戴上口罩,以免污染样品。
  6. 执行 DMMB 测定,以量化非细胞化组织中残留的 GAG 量。
    1. 混合 1 μL 硫酸软骨素 A 溶液和 499 μL 的 1x PBS,以制定标准。用浓度为0、4、8、12、16和20 μg/mL的蒸馏水稀释硫酸软骨素溶液。
    2. 将标准浓度的50μL加载到96孔板中,并将样品消化成96孔板。
    3. 使用多通道移液器将 200 μL 的 DMMB 染料添加到每个井中。
    4. 立即读取微孔板读取器上 525 nm 处的吸光度。
  7. 执行羟基丙氨酸测定,以量化胶原蛋白的量。
    1. 为了进行羟基丙氨酸测定,在120°C下孵育250μL的消化样品,在120°C下孵育16小时。
    2. 在室温下干燥残留物 3 小时,冷却样品,然后将样品重新溶解在 1 mL 的 1x PBS 中。
    3. 在 2,400 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。
    4. 准备100微克/mL羟基丙氨酸溶液作为标准。
    5. 将羟基丙氨酸溶液与蒸馏水稀释,浓度为0、1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30 μg/mL,用于标准溶液。
    6. 将 50 μL 样品和标准溶液的三重装装入 96 孔板中。
    7. 加入50μL氯胺T溶液,然后在室温下孵育20分钟。
    8. 加入50μL的p-DAB溶液,在60°C下孵育30分钟。
      注:在黑暗的房间里,加后,用铝箔包裹板。
    9. 在室温下孵育30分钟。
    10. 冷却后,在微孔板读取器上测量 540 nm 处的吸光度。

3. 生物油墨制备

注:pdECM粉末可在-80°C下稳稳储存至少一年。在pH值调整之前,消化的pdECM溶液可以在-20°C下储存一个月。使用前,在4°C下解冻冷冻pdECM溶液样品过夜。pH 调节的 pdECM 溶液可在 4°C 下存储长达一周。消化的pdECM溶液可在4°C下储存至少几天,但不应超过1周。

  1. 用胰蛋白酶消化冷冻干燥的pdECM。
    1. 为了有效消化生物墨水,使用砂浆和虫子用液氮粉碎冻干pdECM。
    2. 在 50 mL 锥形管中收集 200 mg 的 pdECM 粉末,加入 20 mg 的胰蛋白酶和 8.4 mL 的 0.5 M 醋酸(最终浓度为 2 w/v%)。
    3. 将磁力搅拌棒放入 50 mL 锥形管中,在 300 rpm 下搅拌 96 小时。
  2. 调整消化的 pdECM 溶液的 pH。
    注:为了避免在pH调整前凝胶化,应在冰上进行此过程。
    1. 使用 40 μm 细胞过滤器在冰上使用正位移移液器过滤出 pdECM 溶液中的未消化颗粒,以获得部件的最佳消化。
    2. 在使用 NaOH 之前,添加 1mL 的 10x PBS 和涡流。
    3. 将 pH 调整为 7,使用 pH 指示器条检查 pH。
      注:每次添加 NaOH 时,涡旋,以便生物墨水与其他试剂彻底混合。

4. 学变分析

  1. 实验设置
    1. 准备 pdECM 生物墨水的 1.5%(w/v)以评估变菌特性。
    2. 在流速计速率控制模式下建立 20 mm 锥形板几何形状(圆锥直径 20 mm,角度为 2°)。
    3. 在已安装的软件 (TRIOS) 中创建实验序列,以测量 pdECM 生物墨水的粘度、凝胶动力学和动态模量。
      1. 粘度:将 pdECM 生物墨水放在板上。在 15°C 的恒温下,在剪切速率从 1 到 1,000s-1的剪切速率下测量 pdECM 生物油墨的复杂粘度 (Paμs)。
      2. 凝胶动力学:将 pdECM 生物墨水放在板上。通过测量 pdECM 生物墨水在 4-37 °C 下的存储和损耗模量,以 5 °C/min (时间扫描模式) 的增量增长率计算复模量 (G+)。
      3. 动态模量:在测量前将 pdECM 生物墨水置于 37°C 的板上 60 分钟。测量 pdECM 生物油墨的频率相关存储模量 (G') 和损耗模量 (G''),在 2% 应变时,频率依赖存储模量 (G'') 在 0.1-100 rad/s 范围内。

5. 使用胰岛进行胰腺组织构造的三维细胞打印

  1. 准备隔离小岛
    1. 根据先前工作5中描述的协议,从大鼠中分离出主胰岛。
    2. 要将碎片和死细胞从隔离的小岛中分离出来,请通过70μm细胞过滤器将细胞悬浮液通过。直径小于70μm的胰岛被认为是死岛或异常的。
    3. 在 RPMI-1640 介质中悬浮隔离的小岛,并将其放在培养皿上。在生物安全柜中使用显微镜下的 P200 体积移液器(4x 物镜)去除直径大于 300 μm 的小岛。
  2. 滑入 pdECM 生物墨水的岛
    1. 准备pH调整的pdECM生物墨水和隔离小岛。
      注:为了避免在pH调整前凝胶化,应在冰上执行此过程。
    2. 使用正位移移液器将 pdECM 生物墨水和悬浮介质与胰岛(比 3:1)轻轻混合,直到均匀混合。
      注:pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%,pdECM生物墨水中的细胞密度为3,000 IEQ/mL。
  3. 胰腺组织构造的3D细胞打印
    1. 准备消毒注射器和 22 G 喷嘴。
      注:此仪表选用于打印直径为 100-250 μm 的小岛。
    2. 将装有小岛的 pdECM 生物墨水装入注射器中。
    3. 以格子形状在 18°C 下打印具有优化打印条件的生物墨水(进给率:150 mm/min;气动压力:15 kPa)。
    4. 要将生物墨迹交错,将打印的构造置于培养箱中 30 分钟。
    5. 将印刷结构浸入小岛培养基中,即 RPMI-1640 介质,辅以 10% 胎儿牛血清 (FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素。

6. 具有图案结构的胰腺结构的三维细胞打印

  1. 两种生物油墨的制备
    1. 为了验证使用多种生物油墨的印刷多功能性,准备两组 pdECM 生物油墨,并在每个 pdECM 生物油墨中分别添加 0.4% 的 Trypan 蓝和玫瑰孟加拉溶液,比例分别为 1:20。
      注:为了避免在pH调整前凝胶化,应在冰上进行此过程。
    2. 使用正位移移液器将 pdECM 生物墨水和悬浮介质与胰岛(比 3:1)轻轻混合,直到均匀混合。
      注:pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%,pdECM生物墨水中的细胞密度为3,000 IEQ/mL。
  2. 多物质胰腺组织构造的三维细胞打印
    1. 准备消毒注射器和25G喷嘴。
    2. 将每个生物墨水(蓝色和红色)分别装入两个不同的注射器中。
    3. 在 18°C 下以蓝色和红色交替线的晶格形状打印具有优化打印条件的生物墨水(进给率:150 mm/min;气动压力:15 kPa)。
    4. 要将生物墨迹交错,将打印的构造置于培养箱中 30 分钟。
    5. 将印刷结构浸入小岛培养基中,即 RPMI-1640 介质,辅以 10% 胎儿牛血清 (FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素。

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Representative Results

胰腺组织的去细胞化
我们开发了制备 pdECM 生物墨水的工艺,以提供胰腺组织特定的微环境,以增强 3D 生物打印组织结构中的胰岛功能(图 2A)。脱细胞化过程后,97.3%的dsDNA被去除,胶原蛋白和GAG等代表性ECM成分与原生胰腺组织相比分别保持在1278.1%和96.9%(2B)。

生物油墨制备
为了在印刷过程中应用pdECM,将pdECM粉末用薄酸与胰蛋白酶溶解,并使用10M NaOH溶液中和。然后,通过与细胞培养基或1x PBS混合,可以稀释消化的pdECM溶液。在这项研究中,我们准备了pdECM生物墨水,最终浓度为1.5%,供进一步研究。pdECM生物墨水在室温下放置时维持溶液阶段,在37°C孵育30分钟后立即转化为凝胶相。为了研究pdECM生物墨水对胰岛的影响,分离的小岛被封装在pdECM、藻酸盐和胶原蛋白生物油墨中,浓度为1.5%。葡萄糖刺激胰岛素分泌试验结果表明,pdECM生物油墨中的胰岛在实验组中是最高的指数(约3.174),表明比广泛应用的胰岛封装5水凝胶具有更高的功能。

学变分析
在考虑可打印生物材料时,粘度是关键特征之一。我们测量了pdECM生物墨水的粘度,频率范围从1到1000赫兹在15°C印刷各种dECM生物油墨6,7,8。pdECM生物墨迹显示剪切变薄行为,在剪切速率为1/s时值约为10帕μs,表明pdECM生物墨水具有适当的流变特性,可通过喷嘴挤出(3A)。温度在4至37°C的凝胶动力学表明pdECM生物油墨在生理相关温度下的凝胶化行为。当温度达到15°C时,复合模量开始增加,当温度保持在37°C时,复合模量迅速增加,表明pdECM生物油墨的溶胶过渡(3B)。pdECM生物油墨的动态G'和G"在生理相关温度下进行了研究,以确保其印刷过程后的稳定性,从而在频率扫描条件下具有稳定的模量(3C)。

3D 细胞打印
3D细胞载胰腺组织结构是使用基于微糊精的印刷工艺制造的。为了构建一个包含至少 3,000 个岛当量 (IEQ) 的构造,对应于直径为 150 μm9的完美球形小岛的组织体积,我们设计了尺寸为 10 mm x 10 mm x 3 mm 的构造(图 4A)。选择印刷胰腺胰岛的过程参数和条件来封装胰岛,小岛是直径为100-250 μm的大型细胞簇(4B)。使用多头打印系统,使用开发的 pdECM(图 4C)制造各种类型的 3D 结构,例如具有蓝色和红色交替线的晶格形状,表明 pdECM 在 3D 生物打印中具有多功能性,以组织状排列两种或多种类型的活细胞。

Figure 1
图1:脱细胞胰腺组织发育图、pdECM生物油墨评价和3D胰腺组织构造图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:pdECM脱细胞化和生化表征的代表性图像。A) 猪胰腺组织去细胞化概述.(B) 原生组织和pdECM的生化测定结果.误差条显示标准偏差。版权所有 (2019) 英国皇家化学学会5.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:pdECM生物油墨的学序分析。A) deCM 和胶原蛋白生物油墨的粘度,表现出剪切变薄行为.(B) 在温度变化期间,pdECM和胶原蛋白生物油墨的凝胶动力学。(C) 交联pdECM和胶原蛋白生物油墨的复杂模量。版权所有 (2019) 皇家化学学会5.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:3D胰腺组织构造的细胞载pdECM生物墨水的3D细胞打印。A) 3D 胰腺组织的尺寸构造.(B) 胰腺胰岛载载和 (C) 多物质的 3D 胰腺组织构造.版权所有 (2019) 皇家化学学会5.请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

该协议描述了pdECM生物油墨的开发以及使用3D细胞打印技术构建3D胰腺组织结构。要概括3D工程组织构造中目标组织的微环境,生物油墨的选择至关重要。在以前的研究中,我们验证了组织特异性的dECM生物油墨有利于促进干细胞分化和增殖10。与合成聚合物相比,dECM可以作为一个有利于细胞的环境,因为组织特异性的组成和结构11。因此,在dECM中主要部件的高保留率时,应认真考虑去细胞化过程。

胰腺组织去细胞化的不同洗涤剂的选择改变残留的ECM成分12。在去细胞化过程中,我们注意到使用硫酸钠(SDS)会影响ECM蛋白13的流失。因此,我们修改了以前的协议,取消了SDS溶液的处理步骤,SDS溶液是一种离子表面活性剂,用于许多清洁和去细胞化过程,与其他产品(如Trion-X 100)或3-*(3-巧克力-拉米多丙基)二甲基-拉米尼欧-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)相比,具有相对苛刻的特征。在此协议中,我们使用 1% Triton-X 100 溶液用于 84 小时而不是 SDS 解决方案,这种解决方案能够有效地去除细胞成分,同时保留 GAG 和胶原蛋白。此外,我们注意到,通过IPA治疗去除残留脂质也是诱导pdECM生物油墨交联的一个非常关键的过程,它可以理解在相同的上下文,因为以前发表的第4条。用氧乙酸溶液治疗也应用于脱细胞组织的灭菌。此外,去除脱细胞组织中剩余的洗涤剂和化学物质是防止炎症宿主反应的关键步骤。但是,我们没有在本议定书中讨论该问题。在去细胞化结束时包括消毒过程的协议将提高脱细胞物质的生物相容性。此外,应考虑评价标准,以确保完全去除洗涤剂和化学品。

用胰蛋白酶对pdECM生物油墨进行消化,通过胶原蛋白中端肽区域的裂解,实现pdECM粉末在酸性溶液中的均质混合。在pH调节过程中,将pdECM生物油墨留在冰上对于保持凝胶化至关重要。之后,我们可以生产物理上可交交的pdECM预凝胶生物油墨,通过在37°C孵育进入凝胶状态,这是基于dECM的生物油墨的主要优势之一。选择适当浓度的pdECM生物墨水也很重要10。理想的生物墨水应保护细胞免受印刷过程中的外部损坏,如气动压力和温度变化。众所周知,施加的剪切力可能对细胞造成损伤,降低印刷结构10中的细胞生存能力。此外,提高生物墨水的浓度可以诱导细胞死亡5。相比之下,低浓度的生物油墨会导致低粘度,这意味着印刷过程中的印刷性和形状保真度较差。有必要检查生物油墨的粘度,优化其浓度。

目前,研究人员正在积极研究开发用于印刷3D组织构造的各类组织衍生生物油墨14、15、16。这些研究结果表明,生物墨水可以为细胞提供组织特异性微环境。这些独特的条件可以促进干细胞的分化或成熟和细胞的增殖。此外,利用多头配备的 3D 细胞打印系统,可以同时打印多种生物墨水。使用这种技术,可以生成具有特定图案的结构,从而显示设计的多功能性。此外,将不同类型的细胞封装到每个生物墨水中以模拟原生细胞排列17是可行的。这些模式结构可以通过改善细胞与细胞的相互作用来诱导血管化或共培养效应,这可能是特定细胞长期存活的关键因素18,19。

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Disclosures

没有。

Acknowledgments

这项研究得到了韩国政府资助的国立研究基金会(NRF)的生物与医疗技术开发项目(2017M3A9C6032067)和"ICT康力创意计划"(IITP-2019-2011-1-00783)的支持。由IITP(信息与通信技术规划与评估研究所)监督。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinets CRYSTE PURICUBE 1200
Deep Freezer Thermo Scientific Forma 957
Digital orbital shaker DAIHAN Scientific DH.WSO04010
Dry oven DAIHAN Scientific WON-155
Freeze dryer LABCONCO 7670540
Fridge SANSUNG CRFD-1141
Grater ABM 1415605793
Inverted Microscopes Leica DMi1
Microcentrifuge CRYSTE PURISPIN 17R
Microplate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan GO
Mini centrifuge DAIHAN Scientific CF-5
Multi-Hotplate Stirrers DAIHAN Scientific SMHS-6
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-LITE-PR
pH benchtop meter Thermo Fisher Scientific STARA2110
Rheometer TA Instrument Discovery HR-2
Vortex Mixer DAIHAN Scientific VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 ml glass vial Scilab SL.VI1243
40 µm cell strainer Falcon 352340
5 L beaker Dong Sung Science SDS 2400
50 mL cornical tube Falcon 352070
500 mL beaker Korea Ace Scientific KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter Corning 431118
500 mL plastic container LOCK&LOCK INL301
96well plate Falcon 353072
Aluminum foil DAEKYO
Kimwipe Kimtech
Magnetic bar Korea Ace Scientific BA.37110-0003
Mortar and pestle DAIHAN Scientific SC.MG100
Multi-channel pipettor Eppendorf 4982000314
Petri Dish SPL 10100
pH indicator strips Sigma-Aldrich 1095350001
Sieve filter mesh DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs Hyclone SH30258.01
4.7% Peracetic acid Omegafarm
70% ethanol SAMCHUN CHEMICALS E0220 SAM
Distilled water
IPA SAMCHUN CHEMICALS samchun I0348
Triton-X 100 Biosesang T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt Sigma-Aldrich 341088
10 N NaOH Biosesang S2018
Chloramine T Sigma-Aldrich 857319
Chondroitin sulfate A Sigma-Aldrich C4384
Citric acid Supelco 46933
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Glacial acetic acid Merok 100063
Glycine Sigma-Aldrich 410225
HCl Sigma-Aldrich H1758
Na2-EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaCl SAMCHUN CHEMICALS S2097
Papain Sigma-Aldrich p4762
P-DAB Sigma-Aldrich D2004
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421
Sodium acetate Sigma-Aldrich S5636
Sodium hydroxide Supelco SX0607N
Sodium phosphate(monobasic) Sigma-Aldrich RDD007
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Bioink
Charicterized FBS Hyclone SH30084.03
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich P7215
Rose bengal Sigma-Aldrich 198250
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154

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References

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