인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출

Genetics

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Summary

RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.

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Mancarella, A., Procopio, F. A., Achsel, T., De Crignis, E., Foley, B. T., Corradin, G., Bagni, C., Pantaleo, G., Graziosi, C. Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR. J. Vis. Exp. (153), e60511, doi:10.3791/60511 (2019).

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Abstract

레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3' 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.

Introduction

안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.

ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법은 유전자 특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 오른쪽 극성의 상보성 DNAs(cDNAs)를 합성합니다. 그러나 이러한 접근법은 초기 RNA 템플릿의 배향(감각 또는 안티센스)을 결정하는 것을 허용하지 않으며, RNA 헤어핀 또는 루프가프라이머(10)가없는 상태에서 양방향으로 RT를 프라임할 수 있기 때문에, RT 자체 프라이밍으로 알려진 현상이다. 대부분의 ASP 조사자들은 HIV-111,12와관련이 없는 시퀀스로 태그가 지정된 프라이머를 사용하여 RT 자체 프라이밍의 문제를 회피한다. 그러나 이러한 전략은 현상의 발생을 제거하지 않으며, 비특이적 cDNA를 PCR11로잠재적으로 이월시킬 수 있다.

우리는 최근에 안티센스 RNA의 연구 를 위한 새로운 가닥 특이적 RT-PCR 분석기를 개발하고 우리는 표 1에도시된 바와 같이 6명의 HIV 감염한 환자의 코호트에서 ASP RNA 검출을 위해 그것을 이용했습니다. 아래에 설명된 절차는 이전에 안토니오 만카렐라 외13에의해 출판되었습니다. 프로토콜에서는 이중 접근 방식으로 비특정 cDNA의 생산을 방지합니다. 첫째, 우리는 고온 (94 °C)에서 RNA를 분해하여 RNA 이차 구조를 제거하고, 둘째, 우리는 생체 별 ASP 특이적 프라이머를 사용하여 ASP RNA를 역전시키고 결과 cDNA를 정화합니다. 이 접근법에 의해, 우리는 다른 비특이적 RT 제품이 생성되는 것을 방지하거나 (RNA의 고온 변성) 또는 PCR (선호도 정제) 이전에 제거되기 때문에 우리의 목표 cDNA만 증폭할 수 있습니다.

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Protocol

이 연구는 센터 병원 대학 Vaudois의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (CHUV).

1. HIV-1HXB2 균주를 가진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감염

  1. 1일차: PBMC 자극
    1. 건강한 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리합니다.
    2. 전체 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니크를 포함하는 1640 배지에서 1x106/ mL의 농도로 PBMC를 카운트하고 다시 일시 중단하십시오. illin/연쇄상 구균 (R-10), 인터류핀-2 (IL-2) 및 3 μg/mL 피토헤마글루티닌 (PHA)의 50 U/mL를 첨가합니다.
    3. 양세포를 6웰 플레이트 2개(셀 서스펜션/웰 3mL)로 위아래로 피펫을 분리합니다.
    4. 37°C 및 5%CO2에서3일 동안 배양한다.
  2. 3일차: PBMC 감염
    참고: 1.1.3 단계에서와 같이 두 플레이트 중 하나를 음성 대조군으로 사용하십시오(이 세포를 감염시키지 마십시오).
    주의: 생체 안전 수준 III 실험실(P3)에서 전체 절차를 수행합니다.
    1. 한 접시에서 50 mL 팔콘 튜브와 원심 분리기를 300 x g에서 10 분 동안 풀.
    2. 상급체를 버리고 IL-2 의 20 U / mL 및 2 μg / mL 폴리브렌을 포함하는 R-10의 2.2 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
    3. HIV-1HXB2 바이러스를 함유하는 바이알을 해동하고 세포에 1.8 mL의 바이러스 성 현탁액 (0.376 ng/μL)을 추가합니다.
    4. 37 °C에서 2 시간 동안 세포를 배양하고 30 분마다 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오.
    5. 세포를 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상급체를 버리고 IL-2 (50 U /mL)를 포함하는 R-10에서 1x106/mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
    7. 세포 현탁액을 1 mL/well의 농도로 24웰 플레이트로 옮기고 37°C 및 5%CO2에서5일 동안 배양한다.
    8. 수확 1 잘 매일 과 전지 1.5 mL 튜브에 전송 (감염의 날로 표시).
      참고: 원심분리 전에, PBMC 감염 품질 관리를 위해 150 μL의 세포 현탁액을 유세포 측정 튜브로 옮기십시오(1.3단계 참조)
    9. 튜브를 400 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 상한체를 버립니다.
    10. 사용할 때까지 세포 펠릿을 -80°C에서 동결합니다.
  3. PBMC 감염: 품질 관리
    1. 감염의 매일, 감염된 PBMC의 150 μL를 수집하고 유세포 측정 튜브로 전송합니다.
    2. 인산염 완충 식염수 1mL(PBS)와 원심분리기를 400 x g에서 5분 동안 넣습니다.
    3. 상급물질을 버리고 아쿠아 라이브/죽은 염료 1μL을 함유한 PBS 50 μL을 추가합니다(이전에 는 PBS로 1:10 희석).
    4. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
    5. PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급을 폐기합니다.
    6. 250 μL의 고정/퍼메아빌화 용액을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
    7. 1mL의 1mL(FBS와 사포닌을 모두 함유한 10x 스톡 용액)과 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가합니다.
    8. 상판액을 버리고 HIV 개그 p24 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-공액 항체(희석 1:10)를 함유하는 PBS의 50 μL을 첨가한다.
    9. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
    10. PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급기를 버립니다.
    11. x CellFIX 150 μL (포름알데히드 10%, 메탄올 3.55%, 아지드 나트륨 희석 0.93% 1:10)를 넣고 유세포분석으로 세포를 분석합니다.

2. 항 CD3/CD28 항체를 가진 인간 CD4+ T 세포의 자극

  1. HIV-1 감염 환자와 건강한 기증자 모두의 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분리하십시오.
  2. PBS에서 안티 CD3 (1:100) 및 안티 CD28 (1:50)을 희석하여 인간 항 CD3/CD28 항체 혼합을 준비합니다.
  3. 48-웰 플레이트를 적절한 수의 웰에 웰당 200 μL의 항체 혼합물을 첨가하고 2시간 동안 37°C에서 배양한다.
  4. 항체 용액을 흡인하고 1x10 6/mL에서 CD4+T 세포 1 mL을 항 CD3/CD28 항체 코팅 웰에 추가합니다.
    참고: CD4+ T 세포를 최대 5일까지 자극하십시오.

3. 역 전사

참고: 환자 특이적 프라이머를 얻기 위해, 각 환자로부터 CD4+T 세포로부터 분리된 프로바이러스 DNA를 HIV-1HXB2 팬 ASP 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 환자 특이프라이머는 팬 ASP 프라이머 내부에 프로바이러스 서열을 사용하여 설계되었다. 이 연구에 사용된 모든 프라이머및 프로브는 표 2에나열되어 있습니다.

  1. 세포에서 총 RNA를 분리
    1. RNA를 정량화하고 DNase로 샘플을 처리하여 DNA 오염을 제거합니다.
    2. 50 μL의 부피에서 RT 반응을 수행. 96 웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 총 RNA의 0.1-1 μg을 전송합니다. RNA에 다음 성분을 추가하여 RNA 혼합물을 준비합니다.
      5 μL의 생체측화 ASP 역프라이머 (20 μM)
      2.5 μL의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs) (10 mM)
      25 μL의 디에틸피로카보네이트 (DEPC) 처리 된 증류수 (dH2O).
      생체생리화된 ASP 역프라이머 대신에 5 μL의 뉴클레아제 없는 물을 첨가하여 내인성 RT 대조군을 준비한다.
    3. 96웰 PCR 플레이트를 열사이클러에 넣고 RNA 혼합물을 94°C로 5분 동안 가열합니다.
    4. 즉시 적어도 1 분 동안 아이스 워터에서 RNA 혼합물을 식힙니다.
    5. 1.5 mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가하여 반응 혼합물을 준비하십시오 (총 샘플 개수와 1 을 계산하십시오).
      5x RT 버퍼의 10 μL
      2.5 μL 의 0.1 M 의 1,4-디티오트레이톨 (DTT)
      2.5 μL 의 RNase 아웃(40 단위/μL)
      RT 효소 2.5 μL (200 단위/μL)
    6. 이 혼합물의 17.5 μL을 RNA 함유 웰각각에 전달한다. 역전사를 2.5 μL의 뉴클레아제 없는 물로 대체하는 RT-마이너스 대조군을 준비한다.
    7. 부드럽게 혼합하고 열사이클러를 사용하여 60 분 동안 55 °C에서 플레이트를 배양.
    8. 70°C에서 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다.

4. ASP 생체 정제 cDNA의 친화력 정제

참고: RT-마이너스 반응을 정화하지 마십시오.

  1. 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 및 2 M NaCl을 포함하는 2x 세척 /결합 완충제 1 L을 준비합니다. 솔루션을 필터링합니다.
    1. PCR 등급의 물을 사용하여 1x 세척/결합 버퍼 50mL를 준비합니다.
    2. 각 반응에 대해 스트렙타비딘 접합자 비드 10 μL을 사용하십시오. 반응 의 수에 따라, 1.5 mL 튜브에 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다.
    3. 15s에 대한 2 x 세척 / 바인딩 버퍼와 소용돌이의 동일한 볼륨을 추가하여 구슬을 씻어.
    4. 튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
    5. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 상류를 제거하고 구슬의 초기 볼륨과 같은 세척 / 바인딩 2x 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    6. 30s에 대한 소용돌이 및 10 μL의 비드 현탁액을 적당한 수의 1.5 mL 튜브로 이송한다.
    7. 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
    8. 상급제는 버리고 세척/결합 2x 완충액 50 μL을 추가합니다.
    9. 비드를 포함하는 해당 튜브에 50 μL의 생체 티니레이트 cDNA를 추가합니다.
    10. 실온에서 30분 동안 배양하여 부드럽게 회전합니다.
    11. 상판에서 비드를 자석 분리 랙으로 실온에서 3분 동안 분리합니다.
    12. 1x 세척/결합 버퍼의 200 μL을 추가하여 구슬을 세척합니다. 튜브를 자석 분리 랙에 실온에서 3분 동안 놓고 상판을 버립니다. 두 번 반복합니다.
    13. PCR 등급의 물 10 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.

5. 표준 PCR

참고 : 표준 PCR의 목적은 ASP 유전자의 전체 ORF를 증폭하는 것입니다. 증폭 제품은 pCR2.1 플라스미드로 복제되어 실시간 PCR에 의한 ASP RNA 정량화를 위한 표준 곡선을 개발합니다(단락 실시간 PCR 참조).

  1. 총 부피 50 μL에서 표준 PCR을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
    1 μL 10 μM ASP 프라이머(전진 및 후진)
    1μL 의 10 mM dNTP
    염화 마그네슘 (MgCl2)(농도는 사용되는 프라이머에 따라 다름)
    dH2O에서 49 μL의 최종 부피
    1. 잘 혼합하고 신속하게 내용물 스핀다운하고 PCR 마스터 믹스의 49 μL/well을 96웰 PCR 플레이트로 옮김을 더합니다.
    2. ASP cDNA 친화도 정제에 사용되는 비드를 함유하는 튜브를 15초 동안 조심스럽게 소용돌이치게 한다.
    3. 해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가하고 다음 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다: 2분 동안 95°C, 30s의 경우 95°C의 40사이클, 30초의 경우 55°C, 40초의 경우 68°C, 68°C에서 7분 동안 실행합니다.
    4. PCR 제품을 1 % 아가로즈 젤에 분리하고 밴드를 자르고 증폭 된 제품을 pCR2.1 플라스미드로 복제하십시오.
    5. 각 클론의 시퀀스를 시퀀스 및 분석합니다.

6. 실시간 정량적 PCR (qPCR)

참고: 3단계 "역전사"에 기재된 접근법을 사용하여 환자 별 프라이머 및 프로브를 개발한다. qPCR의 경우 표준 곡선에 대한 ASP 플라스미드 희석을 포함합니다. 환자 특이적 인서트를 함유하는 플라스미드는 5단계 "표준 PCR"의 시작 부분에서 노트에 언급된 바와 같이 개발된다.

  1. 1:10 ASP 플라스미드 직렬 희석을 사용하여 표준 곡선을 3 x 106 복사/μL에서 3복사/μL까지 준비합니다.
    1. 첫 번째 라운드 PCR (프리 앰프). 총 부피 25 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
      ASP 또는 env 프라이머 믹스 0.5 μL (최종 농도 0.2 μM 각) (전진 및 후진)
      0.5 μL 의 dNTPs 혼합 (최종 농도 0.2 mM 각)
      MgCl2 (농도는 프라이머 쌍에 따라 다름)
      dH2O에서24 μL의 최종 부피
    2. PCR 마스터 믹스의 24 μL을 96웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 전송합니다.
    3. 조심스럽게 15 s에 대한 cDNA와 구슬을 포함하는 튜브를 소용돌이.
    4. 해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가합니다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.
    5. 다음 알고리즘을 사용하여 PCR을 실행 : 95 °C에서 2 분 동안 변성; 95°C에서 30s, 55°C에서 30s, 18사이클동안 68°C에서 40s; 68 °C에서 7 분 동안 연장하십시오.
    6. PCR 등급의 물로 1:5 의 첫 번째 라운드 PCR 반응을 희석합니다.
    7. 두 번째 라운드 qPCR. 총 부피 20 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
      1.8 μL 10 μM 프라이머(전진 및 후진)
      1 μL 의 5 μM 프로브
      6.2 μL 의 dH2O
    8. 19 μL의 qPCR 마스터 믹스를 96웰 qPCR 플레이트의 적당한 수의 웰로 옮기고 희석된 1라운드 PCR 반응의 1 μL을 해당 웰에 첨가한다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.
    9. 다음 알고리즘으로 qPCR을 실행: 95°C에서 10분 동안 변성; 95°C에서 15s, 40 사이클동안 60°C에서 1분.

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Representative Results

생체 연화 cDNA의 친화도 정제에 결합 된 고온 RNA 변성은 체외 및 환자로부터 분리 된 CD4 + T 세포에서 감염된 PBMC에서 PCR 동안 비 특이적 ASP 제품의 증폭을 방지합니다. RT 셀프 프라이밍은 안티센스 RNAs10,14,15,16,17의역전사 중에 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을 방지하기 위해, 우리는 원래 Heist et al.10에의해 설명된 기술을 사용하여 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 절차는 RT 이전에 RNA의 고온 변성을 포함하고 RT를 수행하기 위해 생체 용 프라이머를 사용하고, 스트렙타비딘 코팅 자기 비드(13)에생체 질화 된 cDNAs의 친화도 정제가 뒤따릅니다. 이 방법으로 얻은 cDNA는 표준 PCR 또는 qPCR을 포함한 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다.

안티센스 전사에 대한 실험 조건은 HIV-1HXB2로 시험관내감염된 건강한 공여자 1명으로부터 PBMC에서 먼저 시험되었으며, HIV-1 아형 B에 대한 기준 서열(모든 환자는 이 아류형의 분리물로 감염된다). 표 2는 본 연구에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다. 우리의 초기 RT 반응은 일반, 비 생체 정제 안티 센스 프라이머 (ASP R1)를 사용하여 수행하고 ASP (ASP F1-R1 프라이머 쌍)의 성공적인 증폭 결과(그림 1A,레인 1 - 3). 그러나, 이러한 접근법에 의해, 우리는 또한 프라이머-마이너스 RT 반응 대조군(Lanes 4-6)에서 동일한 분자량의 대역을 증폭시켰다. 우리의 부정적인 대조군 (차선 7 - 8)에 있는 신호의 완전한 부족은 비특이적인 템플릿이 견본의 교차 오염에서 온 것이 아니라 RT 반응에서 오고 있었다는 것을 표시했습니다.

RT 자체 프라이밍에 의해 생성 된 문제를 우회하기 위해, 우리는 특정 안티 센스 프라이머가 비오틴으로 표시되어 있는 Haist et al.10에의해 이전에 설명한 방법을 사용하기로 결정하여 안티센스 방향에 해당하는 생성된 생체 티니화 cDNA가 PCR 이전에 정제되고 선택적으로 증폭될 수 있도록 합니다. 이러한 접근법에 의해, 우리는 ASP 서열을 증폭시킬 수있었다(도 1B,레인 1-3)와 프라이머-마이너스 대조군에서 비특이적 cDNA로부터의 오염을 크게 감소하였다(도1B,레인 4-6).

이 방법의 최적화는 94°C에서 RT 이전에 RNA를 완전하게 변성한 다음, 아이스 워터상에서 즉시 냉각함으로써 달성되었다. 그림 2A, B에도시된 바와 같이, ASP 대역은 효과적으로 증폭되는 반면, 비특이적 제품은 사라졌다.

ASP RNA는 항 CD3/CD28를 가진 자극에 따라 검출 가능한 viraemia및 치료의 부재에서 CD4+ T 세포에서 검출됩니다. ASP RNA는 HIV 환자로부터 분리된 비자극된 PBMC 또는 비자극된 CD4+ T 세포에서 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 3개의 HIV 양성 과목, MP135, MP140 및 MP148(표1)으로부터분리된 CD4 세포에서 쉽게 검출될 수 있으며, 반대로 CD3/CD28로 자극을 받았다. 이들 3명의 환자에서 qPCR에 의해 측정된 ASP RNA 발현의 역학은 도 3에나타내고 있다.

CD4 세포는 ART를 겪고 있는 환자로부터 분리되고 검출할 수 없는 바이러스혈증을 가지고, 항 CD3/CD28로 자극될 때 소량의 ASP RNA를 생성할 수 있다. 이들 환자 중 2개에서 ASP RNA 수준의 정량화(MP071, MP146)는 이러한 조건에서 ASP RNA가 3-5일 후 자극 후 낮은 수준(10-15 카피/백만 CD4+ T 세포)에서 검출된다는 것을보여준다(그림 4). 그러나 한 환자에서 (MP069), 어떤 ASP RNA는 어떤 시간 시점에서 검출될 수 없었다 (데이터는 도시되지 않음).

ASP 및 env RNA는 검출 가능한 viraemia (MP140)를 가진 1개의 치료되지 않은 환자에 있는 표현의 유사한 패턴을 가시합니다. 2명의 환자를 분석하였고, 1명은 치료되지 않은(MP140) 및 1명의 치료(MP146)를 분석하였다. MP140에서 우리는 ASP와 env를 모두 감지 할 수 있습니다. 이들의 전사 수준은 서로 유사했지만(도5A),시간이 지남에 따라 이들 두 유전자의 발현 곡선은 동일했으며, 이는 로그계 척도상에서 플롯 데이터를 가시화할 수 있다(도5B). 환자 MP146에서, 치료되고 그의 viraemia가 검출 수준 이하인, ASP 및 env는 겨우 검출할 수 있었고 자극의 며칠 후에만(그림 5C).

Figure 1
도 1: 표준 및 수정된 RT-PCR에 의한 HIV-1HXB2로 시험관내감염된 1개의 HIV 음성 개인으로부터의 PBMC에서의 ASP RNA의 발현. (A)표준 RT-PCR을 사용하여 ASP RNA 검출. ASP는 비생체화 된 ASP 특이적 안티센스 프라이머 ASP R1 (레인 1-3)의 존재에서 합성 된 cDNA로부터 증폭된다. 같은 밴드는 프라이머 마이너스 RT 컨트롤 (레인 4-6)에서 발견된다. (B)안티센스 프라이머 및 cDNA 정제의 생체화에 의한 ASP RNA의 가시화(Lanes 1-3). 감소 된 강도의 밴드는 여전히 프라이머 마이너스 컨트롤에서 감지 (레인 4-6). 부정적인 컨트롤에는 밴드가 없습니다. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: ASP RNA는 HIV-1HXB2를가진 감염 다음 1개의 HIV 음성 개별의 PMBC에서 표현됩니다. (A)ASP 대역은 생체 용 RT 프라이머 (ASP R1)(레인 1-3)를 사용하여 완전히 변성되고 역전사된 RNA를 쉽게 검출하지만 프라이머-마이너스 제어(Lanes 4-6)에서 정제된 cDNA에서는 검출되지 않는다. (B)ASP에 대응하는 신호는 감염된 PBMC, 감염되지 않은 PBMC 또는 물로부터의 RNA의 RT-마이너스 제어에서 검출되지 않지만, 명확한 밴드는 ACH-2 세포로부터 개그 양성 대조군에서 볼 수 있다. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 3명의 치료되지 않은 환자로부터 분리된 항 CD3/CD28 자극 CD4+ T 세포에서, ASP RNA 생산은 쉽게 검출가능하고 자극 후 2일과 4일 사이에 피크를 갖는다. MP135 및 MP140에서는 ASP의 발현이 4일째에 정점에 달했으며 MP148에서는 2일째에 정점을 찍었습니다. ASP 수준은 RNA 사본/백만 CD4+ T 세포로 발현된다. 시간 코스의 포인트는 PCR 반응의 평균 값에 해당합니다. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: ART를 겪고 있는 2명의 항공 환자에서, ASP는 자극의 며칠 후에만 거의 검출할 수 있습니다. 두 환자 모두에서, ASP는 0일째에 검출될 수 없었다. 환자 MP071에서, ASP의 낮은 수준은 3 일째에 검출될 수 있었습니다, 반면 참을성 있는 MP146에서는, 우리는 RNA의 몇몇 수준을 보기 위하여 5일까지 기다려야 했습니다. ASP 수준은 RNA 사본/백만 CD4+ T 세포로 발현된다. 시간 코스의 포인트는 PCR 반응의 평균 값에 해당합니다. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 치료(MP146) 및 치료되지 않은(MP140) 환자에서 항 CD3/CD28 자극 CD4+ T 세포에서 ASP 및 env의 발현. (a)치료되지 않은 환자(MP140)에서, env는 ASP보다 더 높은 수준으로 발현된다; (B)로그 스케일에 플롯된 동일한 데이터는 ASP 및 env 표현식이 시간 초과에 유사한 프로파일을 특징으로 한다는 것을 보여준다; (C)ASP의 발현 역학및 검출할 수 없는 비라혈증을 가진 1명의 환자에서 ENV 및 ART(MP146)를 겪고 있다. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

환자 ID 연령 섹스 HIV 감염의 단계 클래드 (미국) 바이러스 부하(사본/ml) CD4 카운트(셀/μl) 아트 상태
MP135 44 M C3 B 1.6x105 176 치료
MP140 23 M A2 B 3.6x104 427 치료
MP148 37 M A1 B 2.0x104 717 치료
MP069 42 M A1 B <20 1309 처리
MP071 47 M C3 B <20 167 처리
MP146 59 M C3 B <20 385 처리

표 1: 환자의 특징. 이전에 기사에 게시 된 "안티 센스 단백질의 검출 (ASP) 인간 면역 결핍 바이러스 유형에 감염 된 개인에서 RNA 전사체 (HIV-1)", Mancarella 외13 (J Gen Virol 100 (5):863-876. doi: 10.1099/jgv.001244).

프라이머/프로브 이름 프라이머 시퀀스(5' ~ 3')
ASP F1 타그가그카카카카카카
ASP R1 가카아가아카아카아아악
팬 ASP F ACCAGCCTTATATATAtAtTAtG
팬 ASP R 가카트타아카타타가카
ASP MP135, 146, 071 F CCCAAGAACCAACATAG
ASP MP135, 146, 071 R 카타가타그카카카카카
ASP MP135, 146, 071 프로브 FAM/탐라 TCTCTGCCTCTTTGCC
ASP MP140 F CCCATAGTGCTTTTTTTC
ASP MP140 R 아가가그트GCA가가가가가
ASP MP140 프로브 FAM/탐라 AGCTTTTCCCCTCTCT
ASP MP148 F CTCTGCACCACTCTCTTT
ASP MP148 R AGACCTGGAGGAGATATG
ASP MP148 프로브 FAM/탐라 TGGGGGTGCTACTTTTTTTTTTTTT
ENV MP140 F 아가가그트GCA가가가가가
ENV MP140 R CCCATAGTGCTTTTTTTC
ENV MP140 프로브 FAM/탐라 AGCTTTTCCCCTCTCT
ENV MP146 F 카타가타그카카카카카
ENV MP146 R CCCAAGAACCAACATAG
ENV MP146 프로브 FAM/탐라 TCTCTGCCTCTTTGCC

표 2: RT-PCR 프라이머 및 프로브

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Discussion

이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 '끝에서 역 프라이머를 태그하는 것은 가닥 특이적 증폭6,8,9를달성하는 데 효과적임이 입증되었습니다. 그러나, 이 접근은 단지 비특이적인 DNA 제품의 증폭을 일으키는 원인이 되는 PCR 반응으로 새는 그것의 리스크와 함께 그것을 피하기 보다는 오히려 그것을 피하기 위하여 거짓 프라이밍 된 cDNA를 검출할 수 있게 합니다 (즉, ASP 대신 env).

ASP RNA검출에 대한 우리의 초기 RT-PCR 시도는 표준 안티센스 프라이머를 사용하여 수행되었다. 우리는 올바른 분자량의 밴드를 얻은 대로 증폭은 성공적이었지만, 같은 크기의 밴드는 우리의 프라이머 마이너스 컨트롤에도 존재했다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는 다른 접근법을 사용, 생물학적으로 RT를 수행, Haist 외10에의해 설명된 바와 같이. 우리의 예비 실험은 RT 자체 프라이밍의 급격한 감소를 초래했지만, 우리는 완전히 증폭의 비 특정 제품을 제거 할 수 없습니다. Haist 및 동료들은 비특이적 cDNA 제품을 높은 응력 조건에서 세척하여제거한다 10. 우리의 방법에서는, 우리는 RNA 템플릿을 완전히 선형화하기 위하여 높은 변성 온도를 사용하여 RNA 이차 구조물의 양식에 있는 자기 프라이밍의 근원을 완전히 제거했습니다.

우리는 ASP RNA가 반대로 CD3/CD28 자극된 CD4+ T 림프톨에서 표현된다는 것을 보여줍니다. ASP의 검출은, 그러나, 자극의 부재에 있는 세포에서 달성될 수 없습니다. 우리의 데이터는 ART9를겪고 있는 환자에게서 격리된 CD4+ 세포에 있는 ASP의 낮은 수준의 표현을 보고한 Zapata와 동료에 의해 그것과 다소 유사합니다. 이러한 결과에 기초하여, 그들은 ASP RNA가 HIV 대기 시간을 조절하는 역할을 할 수 있음을 제안한다. 동일한 개인에서 ASP 및 env의 발현의 역학이 동일한 프로파일을 특징으로하는 것을 발견하는 것은 Zapata의 모델9와일치하지 않습니다. 실제로 ASP가 대기 시간 조절에 관여했다면, 그 표현 프로필은 env18에대해 관찰된 것과 반대여야 합니다.

우리는 또한 env 전사 수준이 ASP의 그것 보다는 더 높은 2 로그 이상, 적어도 치료의 부재에 있는 환자에서 관찰했습니다. 이들 데이터는 Laverdure et al.8에 의한 연구에 의하면 체외에서 감염된 1차 CD4+ 세포에서 3' LTR 안티센스 전사가 5' 감각 전사보다 훨씬 낮다는 것을 보여준다. 우리의 결과는 세포가 제대로 자극되는 한 ASP가 질병의 단계에 관계없이 감염된 CD4 림프톨에서 표현된다는 것을 나타냅니다. 또한 우리의 데이터는 ASP가 ART 치료를 받는 환자로부터 세포에서 발현된다는 것을 보여 주지만, 이러한 세포에서의 발현 수준은 치료가 없는 환자의 세포보다 낮습니다.

요약하면, 우리는 프라이머 독립적 인 cDNA 합성을 방지하기위한 신뢰할 수있는 가닥 특정 RT 분석을 제안한다. ASP와 env는 반대 방향으로 서로 겹치는 두 개의 유전자이며, 연구를 매우 어렵게 만드는 기능입니다. 음성 및 양성 극성을 모두 가진 RNA에서 회역된 cdNAs를 선택적으로 포착할 수 있는 우리의 접근법은 특히 이 두 유전자의 연구 결과, 그리고 그들의 안티센스에서 중첩되는 유전자를 위한 최적이고 효과적인 공구를 나타냅니다 일반적으로 방향을 정합니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR II Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4337450
dNTP Set (100 mM) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19052
Fetal Bovine Serum Biowest S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit Becton Dickinson 554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC Beckman Coulter 6604665
Human IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma-Aldrich 61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen, Thermo Fisher Scientific L34967
Mouse Anti-Human CD28 Becton Dickinson 55725
Mouse Anti-Human CD3 Becton Dickinson 55329
Primers and Probes Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma-Aldrich TR-1003-G
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells Invitrogen, Thermo Fisher Scientific K450001
TURBO DNase (2 U/µL) Invitrogen, Thermo Fisher Scientific AM2238
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4375786

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References

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