In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Developmental Biology

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.

Introduction

Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.

Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.

Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.

Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.

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Protocol

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Perinatologa in Mexiko-Stadt (Registernummer 212250-21041) gebilligt. Alle in diesen Studien durchgeführten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Instituto Nacional de Perinatologa, der Erklärung von Helsinki und den Leitlinien des offiziellen mexikanischen Standards des Gesundheitsministeriums.

1. Vorbereitung

  1. Bereiten Sie eine Lösung von 1x PBS mit EDTA vor. Fügen Sie dazu 500 l 0,5 M EDTA-Bestand in 500 ml 1x PBS für eine Endkonzentration von 0,5 mM EDTA hinzu.
  2. Bereiten Sie das Kulturmedium für HAEC vor. Nehmen Sie 450 ml hochglucose-DMEM, ergänzen Sie es mit 5 ml Natriumpyruvat (100 mM), 50 ml hitzeinaktivem fetalem Rinderserum, das für Stammzellen qualifiziert ist, 5 ml nicht essentieller Aminosäuren (100x), 5 ml Antibiotikum (100x), 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 500 l Mercaptoethanol (1.000x).
  3. Sterilisieren Sie die Behälter für den Transport und die Verarbeitung des Gewebes: ein Edelstahlbehälter mit Deckel, um die gesamte Plazenta vom Operationssaal zum Labor zu transportieren, ein Tablett (20 cm x 30 cm x 8 cm), um Blut vor der ganzen Plazenta zu waschen und zu entfernen die Zerlegung der Fruchtwassermembran und ein Kunststoff-Schneidebrett, um die Fruchtwassermembran in die drei Regionen zu trennen.
  4. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (Skalpelle, Scheren, Zangen und Klemmen), 500 ml Becher, Baumwoll-Gauzunden und Eine Saline-Lösung.

2. Erhalt von Plazentagewebe

HINWEIS: Die Fruchtwassermembranen wurden von Frauen bei vollwertiger Trächtigkeit (37 bis 40 Wochen) unter Angabe der Kaiserschnitt-Entbindung ohne Anzeichen einer aktiven Arbeit und ohne mikrobiologische Infektionsmerkmale gewonnen. Die vollständigen Isolations- und Kulturverfahren wurden in einem Biosicherheitskabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

  1. Klemmen Sie im Operationssaal die Nabelschnur, um den Blutfluss zum Rest des Gewebes zu verhindern. Sammeln Sie die gesamte Plazenta mit der Nabelschnur, die im sterilen Behälter eingeklemmt ist.
  2. Fügen Sie 500 ml Salinelösung in den Behälter, um die Plazenta zu hydratisieren.
  3. Schließen Sie den Behälter und transportieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur ins Labor.
  4. Legen Sie den Behälter mit der Plazenta in den Biosicherheitsschrank.
    HINWEIS: Falls die Zerlegung nicht innerhalb von 15 min nach dem Sammeln der Plazenta durchgeführt wird, lagern Sie den Behälter mit der Plazenta auf Eis bis zur Verarbeitung. Vermeiden Sie mehr als 1 h verstrichene Zeit zwischen dem Erhalt der Plazenta und dem Beginn der Zerlegung.

3. Mechanische Trennung pro Bereich der Fruchtwassermembran

HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

  1. Entfernen Sie die gesamte Plazenta aus dem Behälter und legen Sie sie auf das Tablett mit der Nabelschnur nach oben.
  2. Reinigen Sie die Blutgerinnsel mit einer sterilen Baumwollgaze von der Oberfläche des Chorion-Amnions, das die Plazenta bedeckt.
  3. Identifizieren Sie die drei Regionen der Membran: das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die der Rest des Amnions ist, das nicht an der Plazenta befestigt ist (Abbildung 1).
  4. Sezieren Sie die Nabelamnionregion (Abbildung 2A).
    1. Halten Sie mit Sezieren von Zangen den Teil der Amnionmembran, der die Kreuzung von Plazenta und Nabelschnur bedeckt.
    2. Mit einem Skalpell sezieren Sie die Region, die die Schnur umgibt, während Sie sich strecken, um sie vom Chorion zu trennen.
    3. Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 ml Salinelösung ab.
  5. Sezieren Sie die Plazenta-Amnion-Region (Abbildung 2B).
    1. Mit einer sterilen Baumwollgaze, entfernen Sie die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorion-Amnion, das die Plazenta bedeckt.
    2. Halten Sie die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region mit sezierenden Zangen.
    3. Schneiden Sie entlang des Umfangs der Plazenta mit dem Skalpell.
    4. Trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden.
    5. Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Salinelösung.
  6. Trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta (d. h. dem reflektierten Teil) befestigt ist, von der Choreographie (Abbildung 2C).
    1. Sammeln Sie die reflektierte Region in einem anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Saline-Lösung.
      HINWEIS: Fügen Sie während der Zerlegung kontinuierlich eine Salinelösung hinzu, um das Austrocknen des Gewebes zu verhindern.

4. Waschen der Membranen

HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

  1. Entsorgen Sie die Salinelösung jedes Membranbereichs separat.
  2. Fügen Sie 100 ml frische Salinelösung in die Nabelregion.
  3. Fügen Sie 300 ml frische Salinelösung in die Plazenta- bzw. reflektierten Regionen ein.
  4. Rühren Sie die Membranen mit Hilfe von Sezieren Zangen, um Blutrückstände zu entfernen.
  5. Entsorgen Sie die Saline-Lösung.
  6. Wiederholen Sie die Wässer und die Rührung mindestens 3x, bis die Membranen durchscheinend sind.
  7. Legen sie die Membranen auf das Brett und verlängern Sie sie, um die Blutgerinnsel, die nicht mit den Wässen entfernt wurden, mit sterilem Gaze zu reinigen.
    HINWEIS: Es ist sehr wichtig, so viele Erythrozyten wie möglich zu entfernen, da ihre Anwesenheit die Trypsin-Funktion und die Lebensfähigkeit nachfolgender Zellkulturen beeinflusst.

5. Enzymatische Verdauung der Membranen aus verschiedenen Regionen

HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Schneiden Sie die reflektierten und plazentten Bereiche in zwei oder drei Fragmente.
  2. Schneiden Sie nicht die Nabelregion.
  3. Platzieren Sie die Fragmente jeder Region in Zentrifugenrohren. Fügen Sie 20 ml 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 5 ml mit 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die reflektierten und plazentten Bereiche in kleinere Stücke zu schneiden, da sie vollständig in die Trypsin-Lösung eingetaucht werden müssen.
  4. Die Zentrifugenrohre 30 s leicht schütteln. Trypsin entsorgen.
  5. Fügen Sie 30 ml neues 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 15 ml neuer 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein.
  6. Legen Sie die Rohre in einen Rotator im Inkubator.
  7. Inkubieren mit Drehung (20 Rpm) für 40 min bei 37 °C.
    HINWEIS: Wenn kein Rohrrotator verfügbar ist, schütteln Sie die Rohre alle 10 min leicht manuell.
  8. Übertragen Sie die Trypsin/Zelllösungen aus jeder Region in neue Zentrifugenröhrchen.
  9. Fügen Sie 2x das Volumen der HAEC-Medien bei 37 °C pro Tube vorgewärmt, um das Enzym zu inaktivieren.
  10. Die erste Verdauung auf Eis aufbewahren.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 x 5.8 für eine zweite Verdauungsphase.
  12. Halten Sie für jede Region ein Ende des Amnion-Anteils mit Sezieren von Zangen und mit einem anderen Paar, das entlang des Gewebes drückt, um Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während früherer Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten.
  13. Sammeln Sie die zweite Verdauung in einen anderen Satz zentrifugenröhren und inaktivieren Sie mit 2x dem Volumen von HAEC-Medien.
  14. Entsorgen Sie die verdauten Membranen in einen Biogefährdungsbehälter.

6. Isolierung des HAEC

HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 200 x g für 10 min bei 4 °C.
  2. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml vorgewärmte HAEC-Medien (bis 37 °C) pro Rohr und Pipette sanft hinzu, um jedes Pellet zu disaggregieren.
  3. Kombinieren Sie die zellulären Suspensionen der beiden Verdauungen in einer einzelnen Röhre für jede Membranregion.
  4. Filtern Sie die zellulären Suspensionen mit 100 m Zellsieben, um den extrazellulären Matrixmüll zu entfernen und einzelne Zellen zu erhalten.
  5. Bereiten Sie drei Aliquots mit 90 l Trypanblau in einem Mikrozentrifugenrohr vor.
  6. Fügen Sie 10 l jeder Zellsuspension pro Membranregion in die Mikrozentrifugenröhrchen ein und mischen Sie sie.
  7. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtfeldmikroskop.

7. Kultur der HAEC

  1. Säen Sie die HAEC aus den drei Regionen getrennt mit einer Dichte von 3 x 104 Zellen/cm2 mit vorgewärmten HAEC-Medien, ergänzt durch 10 ng/ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGF).
    1. Säen Sie die Zellen in 100 mm Platten, um sie in vitro oder in 24 Brunnenplatten für die immunchemische Analyse zu halten.
  2. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 °C unter normoxischen Bedingungen (5%CO2) in einem befeuchteten Inkubator.
  3. Fügen Sie eGF täglich hinzu und wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag.
    HINWEIS: Die Zellen werden nach 4 bis 6 Tagen konfluent.
  4. Verwenden Sie die Zellen für die konventionelle Immunhistochemie, Zellsortierungsanalyse, Kryokonservierung, RNA- und Proteinextraktion oder um den Durchgang fortzusetzen.

8. Passage von HAEC

  1. Entfernen Sie das HAEC-Medium und waschen Sie 2x mit PBS/EDTA 0.01M Lösung.
  2. Inkubieren Sie mit einer PBS/EDTA 0,01M Lösung für 15 min bei 37 °C.
  3. Entfernen Sie die PBS/EDTA und fügen Sie 1,5 ml 0,5% Trypsin/EDTA hinzu.
  4. 5 x 8 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Inaktivieren Sie das Enzym mit zwei Bänden HAEC-Medien.
  6. Sammeln Sie die gemischte Lösung und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
  7. Zählen Sie die Zellen und fahren Sie mit folgenden Passagen fort oder verwenden Sie die Zellen für die weitere Analyse.

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Representative Results

HAEC wurden aus jedem der drei anatomischen Regionen der Fruchtwassermembran isoliert und in vitro einzeln kultiviert. Nach 48 h Kultur hafteten Zellen mit einem epithelialen Phänotyp an der Oberfläche der Platte, obwohl die Medien auch Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthielten, die nach der Änderung des Mediums entfernt wurden(Abbildung 3).

Während der Verarbeitung der Primärkultur (Durchgang Null, P0) können einige Komplikationen auftreten, die die experimentelle Datenanalyse stören können (Abbildung 4): Es ist ratsam, die Kulturen zu verwerfen und eine andere Membran zu verarbeiten, wenn das Vorhandensein von Bakterien aufgrund der Kontamination der Reagenzien oder während des Isolationsprozesses identifiziert wird (Abbildung 4A); übermäßige Erythrozyten durch unzureichendes Waschen der Membranen (Abbildung 4B); Mangelhafte oder keine Haftung der Zellen an den Platten (Abbildung 4C); oder Zellen mit Fibroblastenmorphologie (Abbildung 4D), was darauf hindeutet, dass menschliche fruchtiotische mesenchymale Zellen (HAMC) anstelle von HAEC isoliert wurden.

Die HAEC-Morphologie hängt vom Ursprung dieser Zellen ab: Zellen aus der reflektierten Zone haben eine quaderförmige Morphologie und wachsen in einer gepflasterten Monoschicht, im Gegensatz zu Zellen aus den Plazenta- und Nabelregionen, die flacher und plattenförmiger sind (Abbildung 5). Diese Daten stützen, dass die Epithelschicht aus dem Amnion nicht gleichmäßig in der gesamten Membran ist. Während der Passagen nimmt die Größe der Zellen aus allen Regionen zu, aber sie behalten ihre epitheliale Natur bei und erwerben keine Fibroblastenmorphologie. Tatsächlich zeigte die Immunfluoreszenz gegen E-Cadherin, dass die Primärkulturen (P0) und Subkulturen (P1-P2) ihren epitheliaalen Phänotyp beibehalten (Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass es keine Kontamination eines anderen Zelltyps wie mesenchymaler Stromalzellen oder epitheliaal-mesenchymaler Übergang gibt. Darüber hinaus zeigen diese Zellen keine Hinweise auf den Zelltod nach dem TUNEL-Assay (Ergänzende Abbildung 1), sind aber positiv für den KI-67 Proliferationsmarker (Abbildung 6), obwohl unsere vorherigen Ergebnisse keine signifikanten Unterschiede für diesen Marker zwischen den einzelnen Passagen5gefunden haben.

Die Anzahl der erhaltenen Zellen variiert je nach Region: 61,6 x 106 und 71,8 x 106 Zellen aus den reflektierten und plazentten Regionen bzw. weniger als 1 x 106 pro Probe aus dem Nabelbereich (Tabelle 1). Es wurde mit diesem Protokoll berichtet, dass Plazenta- und Nabelregion in ihren Expressionsprofilen sehr ähnlich sind, im Gegensatz zu den reflektierten und plazentischen Regionen, insbesondere in Genen, die an der ECM-Rezeptor-Interaktion, der fokalen Adhäsion und dem PI3K-Akt-Signalweg durch RNA-seq6teilnehmen. In Übereinstimmung mit, eine vorherige Studie berichtet die differentiale Expression von Mitogen-aktivierte Proteinkinase und transformierenden Wachstumsfaktor Beta-Wege, sowie proinflammatorische Zytokine zwischen beiden Regionen17.

Obwohl die Beweise zeigten, dass sich die Subpopulationen des Amnions in ihrer Morphologie und physiologischen Eigenschaften unterscheiden, haben wir zuvor gezeigt, dass sich die Expression und das Vorhandensein des Kerns der Pluripotenzfaktoren in HAEC, die aus Plazenta- und reflektiertenRegionenabgeleitet sind, nicht ändert 6 . In diesem Zusammenhang sollten sich die nachfolgenden Studien neben der relativ begrenzten Anzahl von Zellen aus der Nabelregion auf isolierte HAEC aus der Plazenta konzentrieren und Amnion unabhängig unter Berücksichtigung der physiologischen Implikationen widerspiegeln, da die verschiedenen Subpopulationen nicht gleichmäßig auf bestimmte Ereignisse wie längere Schwangerschaft oder entzündliche Prozesse während der Arbeit reagieren würden, obwohl es keine spezifischen positiven Zellen für die wichtigsten Pluripotenzmarker gibt (Abbildung 7).

Figure 1
Abbildung 1: Anatomische Regionen aus der Fruchtwassermembran beim Term. Nabelfruchtwassermembran (gelb), plazentale Fruchtwassermembran (weiß) und reflektierte Fruchtwassermembran (schwarz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Mechanische Zerlegung der Fruchtwassermembran. (A) Umbilical-Region, (B) Plazentaregion und (C) reflektierte Region. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Primärkultur von HAEC, abgeleitet von der Fruchtwassermembran. Kultur 48 h nach Isolation ohne (A) und mit (B) ein Medienwechsel. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Mikrographien negativer Ergebnisse der Primärkultur von HAEC. (A) Überschuss an Erythrozyten. (B) Bakterielle Kontamination. (C) HAEC nach 48 h Isolation nicht eingehalten. (D) Primärkultur bestehend aus Zellen mit Fibroblastenmorphologie. Skalenbalken = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Morphologie von HAEC aus verschiedenen anatomischen Regionen in vitro. Repräsentative Mikrographien von konfluenten HAEC aus reflektierten (oberen Panel), Plazenta (mittleres Panel) und Nabel (unteres Panel) Regionen kultiviert durch P0-P2. Skalieren Sie Balken 200 = m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Ausdruck von E-Cadherin und KI-67 in HAEC. Repräsentative Epifluoreszenzmikroskopiebilder von E-Cadherin+ und KI-67+ HAEC aus reflektiertem (linkem Panel) und Plazenta (rechtes Panel) Amnion, das durch P0-P2 kultiviert wird. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: HAEC aus verschiedenen anatomischen Bereichen zeigen ein Pluripotenz-Marker-Panel. Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder von Doppelimmunfluoreszenz-Amnion für NANOG mit TRA-1-60, OCT4 mit E-Cadherin und SOX2 mit SSEA-4 in HAEC (P1) aus reflektierten (oberen Panel) und Plazenta (unteres Panel) Regionen. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

• Membran Reflektiert Plazenta Nabelschnur KOMPLETTE MEMBRAN
1 75 X 106 130 X 106 0,2 X 106 205.2 X 106
2 38,5 X 106 52 X 106 0,53 X 106 91.03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0,2 X 106 112,2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0,36 X 106 69,36 X 106
5 44,8 X 106 22,3 X 106 Np 76,1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
Durchschnittliche 61,6 X 106 71,8 X 106 0,45 X 106 133,8 X 106

Tabelle 1: Anzahl der HAEC isoliert pro Region aus Fruchtwassermembranen. (NP = nicht verarbeitet).

Ergänzende Abbildung 1: TUNEL Färbung in HAEC (Passage 2) aus der reflektierten Region und in positiven Kontrollzellen (HL-60-Zellen mit Camptothecin behandelt). Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen.

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Discussion

Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.

Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann dies dazu führen, dass eine Primärkultur mit übermäßigen Erythrozyten und wenigen anhaftenden Epithelzellen entsteht. Wenn in den ersten 24 bis 48 h nach dem Aussaat der Zellen keine Anhaftung beobachtet wird, empfehlen wir, die Kultur zu verwerfen. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Inkubationszeit für die enzymatische Verdauung. Wenn die Inkubationszeit zu lang ist, kann die Zelllebensfähigkeit abnehmen und/oder Zellkulturen mit mesenchymaler statt epitheliale Morphologie erhalten werden (Abbildung 4). Auch, wenn MembranVerdauung nicht mit der richtigen Agitation getan wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, eine geringe Anzahl von Zellen pro Membran zu erhalten.

In diesem Protokoll können wir Populationen von HAEC in vitro beibehalten, ohne ihren epitheliale Phänotyp zu verlieren, wie das Vorhandensein des spezifischen Epithelzellmarkers E-Cadherin für die meisten Zellen entlang der Passagen zeigt (Abbildung 6). Unserer Erfahrung nach kann der HAEC jedoch nur um drei Passagen erweitert werden (P1-P3). Die begrenzte Anzahl von Passagen sollte bei Experimenten berücksichtigt werden, die lange Zeiträume der Kultur oder mehrere Passagen erfordern. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Zellen nach P3 beginnen, ihre Morphologie zu ändern und die Expression von E-Cadherin zu reduzieren, so dass die verlängerte Kultur epitheliaal-mesenchymalen Übergang (EMT)18induzieren könnte. Kürzlich wurde gezeigt, dass Progesteron EMT in den amniozytischen Epithelzellen19,20verhindert, so dass es interessant wäre, die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Progesteron im HAEC-Kulturmedium zu analysieren, um den mesenchymalen Phänotyp nach dem dritten Durchgang zu vermeiden.

In allen früheren Berichten, in denen HAEC isoliert wurden, wurde angenommen, dass das Amnion trotz der möglichen Heterogenität der Epithelpopulationen, die die gesamte Membran umfassen, ein einheitliches Gewebe ist. Im Gegensatz dazu teilt dieses Protokoll die Membran in ihre drei anatomischen Bereiche, um HAEC unter Berücksichtigung der vorherigen morphologischen und Genexpressionsberichte, die funktionelle Unterschiede nahelegen, getrennt zu isolieren und zu kulturieren. Es ist auch unnötig, durch Zellsortierung zu reinigen, um nur Epithelpopulationen zu erhalten, wie der Nachweis des E-Cadherin-Markers während der Passagen bis P2 zeigt.

Es hat sich gezeigt, dass isolierte HAEC aus jeder der Membranregionen einen ähnlichen Ausdruck von PluripotenzKern haben, da es sich um ein latentes Reservoir von Zellen mit Stammkraft handelt. In diesem Zusammenhang können diese Zellen in vitro verwendet werden, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, wie die dynamische Lokalisierung von pluripotenzbedingten Transkriptionsfaktoren oder ihre Fähigkeit, trotz des Ausdrucks krebsassoziierter Gene still zu bleiben, unabhängig von ihrer anatomischen Ursprungsregion. Zukünftige Forschungen müssen jedoch molekulare Unterschiede berücksichtigen , die zwischen den einzelnen Regionen gemeldet werden (globale Expressionsgene, metabolische Aktivität, Signalwege), was Auswirkungen auf ihre Anwendung in der regenerativen Medizin hätte. Wir berichteten zuvor über eine andere Expression von Genen, die an PI3K/AKT beteiligt sind, und fokalen Adhäsionssignalwegen zwischen den verschiedenen Fruchtwasserregionen durch RNA-seq6. PI3K/AKT reguliert die Selbsterneuerung und behält die Pluripotenz in HPSC bei, während die Aktivierung der fokalen Adhäsionskinase ihre Differenzierung fördert21,22. Daher schlagen wir vor, die Rolle beider Bahnen in HAEC zu charakterisieren, die aus verschiedenen anatomischen Regionen während linienspezifischer Differenzierungsprotokolle isoliert sind. Darüber hinaus zeigen mehrere Studien die Unterschiede zwischen beiden Regionen in Bezug auf zelluläre Komponenten, molekulare Funktion und biologische Prozesse. So wurden beispielsweise die regionsspezifische Genexpression und Proteinverteilung von Aquaporinen, die am Transportprozess der intramembranösen Absorption beteiligt sind,23berichtet. Eine andere Studie verglich das miRNome nach Mikroarrays und zeigte die regionsspezifische Expression von miR-145 und miR-143, wobei letztere in der Lage war, die Prostaglandin-Endoperoxidase-Synthase 2 unter bestimmten Bedingungen wie Arbeit am Semester16posttranscriptativ zu regulieren. Darüber hinaus bietet die Plazentaregion eine höhere mitochondriale Atmung, aber einen niedrigeren Erkennungsgemäße für reaktive Sauerstoffspezies im Vergleich zu reflektiertem Gewebe15. Die Sezieren des Amnions in reflektierten und plazentaten Regionen wird ermutigt, HAEC zu isolieren und ihre besonderen Eigenschaften getrennt zu analysieren, wie die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, ihre geringe Immunogenität, die Produktion von extrazellulärer Matrix, die Wirkung ihres konditionierten Mediums in der Kokultur mit anderen Zelltypen und neuartige Funktionen wie ihre Fähigkeit, HPSC-Linien als Feederschicht zu erhalten24.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

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References

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