에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

Biology

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Summary

여기서, 우리는 포자조이트 또는 2세대 메로조이트에 의한 닭에이메리아 기생충의 안정적인 형질변환을 달성할 수 있는 방법을 제공했다. 이종 항원 유전자를 발현하는 유전자 변형 에이메리안 기생충은 백신 전달 차량으로 사용될 수 있었다.

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Duan, C., Tang, X., Hu, D., Zhang, S., Liu, J., Bi, F., Hao, Z., Suo, J., Yu, Y., Wang, M., Sun, P., Du, L., Suo, X., Liu, X. Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites. J. Vis. Exp. (156), e60552, doi:10.3791/60552 (2020).

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Abstract

형질감염은 DNA와 이중 가닥 RNA와 같은 유전 물질이 관심있는 유전자를 수정하기 위해 세포로 전달되는 기술적 과정입니다. 현재, 형질전환 기술은 가금류 및 가축에서 coccidiosis의 원인 인 Eimeria의연구를위한 필수 도구가되고있다. 이 프로토콜은 에이메라체 기생충의 안정적인 형질 감염에 대한 자세한 설명을 제공합니다 : 포자형 또는 2 세대 메로 조이의 정제 및 핵, 형질 감염된 기생충의 생체 전파. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 Eimeria의여러 종에서 형질 감염을 달성했다. 종합하면, 핵은 에이메리안 기생충의 유전자 조작을 촉진하는 유용한 도구입니다.

Introduction

Eimeria spp. 가축 및 가금류 산업에 상당한 경제적 손실로 이어지는 coccidiosis를 일으키는 원인이 됩니다. 항구균 약물, 그리고 어느 정도, 감쇠된 항구균 백신은, cocciiosis의 통제를 위해 널리 이용되고 있더라도, 그들의 약 저항, 약 잔류물 및 독성을 되찾는 백신 긴장의 잠재적인 확산에 관하여 아직도 결점이 있습니다1. 분자 생물학의 발달과 함께, 형질감염은 유전자 기능을 연구하고, 새로운 백신을 개발하고, Eimeria를위한 새로운 약 표적을 검열하기 위한 중요한 공구가 되었습니다.

지난 수십 년 동안, 형질감염은 플라스모듐과 톡소플라즈마 곤디2,3,4,5,6과같은 복합기생충에 성공적으로 적용되었다. E. 테넬라에서 형질 감염에 대한 기자로 β-gal을 사용하여 연구는 에이메리아에서이러한 작업을 조종7. E. tenella8,9, E. 미염10,E. acervulina (장 외, 미공개 데이터)의 형질감염은 닭에서 성공적이었다. 최근에는핵11을통해 E. necatrix의 메로조이스를 사용하여 형질혈을 달성했습니다.

연구 결과에 따르면 이종항균을 발현하는 에이메리아는 캄필로박터 제자니 항원 A(CjaA) 또는 닭인터류친 2(chIL-2)12,13을 발현하는 것과 같은 재조합 백신으로 개발될 가능성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이 프로토콜은 닭에 있는 Eimeria spp. 의 핵 제거 연구 결과 기술합니다. 절차는 포자형 Eimeria 기생충에 대한 연구를 시작하는 연구원을 돕기 위하여 포자조이트 또는 merozoites의 정화, 플라스미드 DNA를 가진 핵, cloacal 접종/정맥 주입 및 생체 내 전파를 기술합니다.

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Protocol

모든 동물 실험을 위한 닭은 중국 농업 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 보관 및 유지되었고 동물과 관련된 생물 의학 연구를 위한 국제 지침 원칙을 따랐습니다. 실험은 실험실 동물의 베이징 관리위원회에 의해 승인되었다.

1. 에이메리아 종의 포자화체 추출 및 정제(예: 테넬라)

  1. 스포로시스트 의 출시
    1. 원심 분리기 1 x 107칼륨 디크롬산염 용액 (2.5 %, m / v)에서 2,300 x g에서 5 분 동안 산발화 된 우모 낭포체를 PBS (인산 완충액)로 3 회 씻으십시오.
    2. 1 mL의 PBS로 펠릿을 다시 중단하고 15 mL 튜브로 옮김. 동일한 부피의 유리 비드(1mm x 1mm 직경 범위)를 추가하고 소용돌이 믹서를 사용하여 oocyst 현탁액을 진동하여 스포로시스트를 방출합니다.
    3. 매 분마다 현미경 검사법에 의해 포자화의 방출을 모니터링하십시오. 난모낭의 90 % 이상이 부러졌을 때 소용돌이를 멈추십시오.
      참고 : oocysts의 대부분 (예 : 테넬라, E. necatrix,E. acervulina)소용돌이 믹서를 사용하여 1 분 후에 깨졌다.
    4. 스포로시스트 서스펜션을 새로운 1.5mL 튜브와 원심분리기를 1,600 x g에서 5분 동안 옮긴다.
    5. 50% 밀도 그라데이션 용액의 1 mL로 침전지를 다시 중단하고 1.5 mL 튜브에 결합하고 1 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리기를 결합하십시오.
      참고: 밀도 그라데이션 컴포지션의 경우 표 1을참조하십시오. 밀도 구배는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 사용하여 코팅된 15-30 nm 직경(물에서 23% w/w)의 콜로이드 실리카 입자로 구성된 실리카 기반 콜로이드 배지입니다.
  2. 스포로조이의 방출
    1. 엑시스테이션버퍼(표 1)로침전물을 재중단하고 42°C 수조에서 40-60분 동안 배양하여 포자화물을 방출한다. 포자이의 90 % 이상이 방출 될 때 배양을 중지하십시오. 그런 다음 600 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를.
      참고: 임신 중에는 5분마다 한 번씩 튜브를 흔들어 주세요.
    2. 10,000 x g에서 10,000 x g의 55% 밀도 그라데이션 용액과 원심분리기의 1mL로 1mL로 1분 동안 강수량을 다시 중단합니다.
    3. PBS의 1 mL로 강수량을 다시 중단하고 혈세포계를 사용하여 포자화수를 계산합니다.

2. E. 네카트릭스의 메로조이트 수집 및 정화

참고: 실험에서 7-14d의 아버 에이커(AA) 육조를 사용하십시오. 코시디아가 없는 닭(n=3)은 E. necatrix의2 x 105 난모낭으로 접종하였다. 감염 후 109 시간에서, 조류는 자궁 경부 탈구에 의해 희생되었다. 장은 2세대 메로 조이의 수집을 위해 제거되었습니다. 다른 Eimeria 종에 대 한,2 세대 merozoites의 수집에 대 한 다른 시간이 있었다: E. necatrix 에서 109 시간, 그리고 E. 테넬라 에서 112 시간 후 접종. E. necatrix의형질감염에 대 한, 두 번째 merozoites 정화 하기 쉬운 최적의 선택.

  1. E. 네카트릭스의 2세대 메로조이트 컬렉션
    1. 닭장줄기(소장 의 중간)에서 일레오세칼 오리피스까지 닭장나무줄기를 세로로 자르고, 페트리 접시에 PBS 또는 HBSS(행크의 균형 잡힌 소금 용액)로 세 번 부드럽게 씻습니다.
    2. 소장을 0.5 cm x 0.5 cm 조각으로 자르고 소화 완충액으로 원추형 플라스크에 넣습니다(표 1). 플라스크를 37°C의 마그네틱 믹서위에 놓고 교반 막대를 30-60분 동안 저어메로조이트 방출합니다. 배양 30분 후, 5분마다 현미경 검사로 메로조이산의 방출을 모니터링합니다.
  2. 여과 및 원심 분리에 의해 메로 조이트 정제.
    1. 거즈14의4 층을 사용하여 소화 된 메로 조이트 함유 현탁액을 걸러내고 600 x g에서 원심 분리기를 10 분 동안 걸러내다.
    2. 원심 분리 후 장 파편이 들어있는 상한자를 버리십시오. 정제된 메로조이트로 침전물을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김.
    3. PBS의 1 mL로 강수량을 다시 중단하고 혈세포계를 사용하여 merozoites를 계산합니다.

3. 메로조이트 또는 포자형의 핵

  1. 기생충의 핵형성 전에 준비
    1. 한 튜브에 약 107 개의 메로 조이또는 포자형염을 준비하십시오. 메로조이스를 트랜스페팅하는 경우 3-4개의 튜브를 준비하십시오.
    2. 10 μg 보다 크거나 같은 플라스미드 DNA 또는 정제된 PCR 단편의 양을 준비한다.
      참고: 본 연구에 사용된 플라스미드는 2개의 유전자를 포함합니다: 향상된 황색 형광 단백질 (EYFP) 및 톡소플라즈마 곤디(TgDHFR-TS)15에서유래한 디하이드로폴레이트 환원효소 신타제.
    3. 제한 효소 25U를 준비합니다. 플라스미드가 선형화되면, 제한 효소는 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다. 플라스미드가 원형이면 제한 효소를 생략하십시오.
    4. 85 μL의 핵 형성 완충액을 준비: 20 μL의 핵형성 완충제 I 및 1 mL의 핵형성 완충제 II를 혼합하고, 용액의 일부를 사용한다. 총 버퍼의 부피는 100 μL입니다.
  2. 핵 형성
    1. 10 분 동안 600 x g에서 스포로 조이트 또는 메로 조이트 현탁액을 원심 분리기. 그런 다음 상급을 버리십시오.
    2. 다음 순서로, 핵 형질전환 완충제 85 μL, 플라스미드 10 μg (PCR 단편), 그리고 25 U의 제한 효소 (보통 5 μL)를 스포로조이트 또는 메로조이스를 함유하는 1.5 mL 튜브에 추가합니다.
    3. 서스펜션을 핵 형질전환 컵으로 옮김을 옮김으로 옮김. 컵을 핵 이송 홈에 넣습니다.
    4. 전원 버튼을 사용하여 핵 형성 장치를 켜고 형질 전환 절차 U-033을선택합니다. 핵 제거 장치가 자유 프로그램 선택 모드에서 시작되면 X 버튼을 눌러이 모드를 종료합니다.
    5. 프로그램이 완료되면 핵 형성 장치의 X 버튼을 누르면 화면이 확인되어핵이 성공했음을 나타냅니다.
    6. Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)8의 0.5-1 mL을 핵 패드에 추가하여 반응을 멈추고 부드럽게 혼합 한 후 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮니다.

4. 클로아칼 접종 또는 정맥 주사

  1. 핵에 감염된 기생충을 7일 된 닭으로 접종합니다. Cloacal 경로를 통해 E. necatrix 또는 E. tenella의 포종자체의 메로조이스를 접종하지만 정맥 주사를 통해 E. acervulina sporozoites를 접종합니다. 각 닭에 약 2 x10 7백만 개의 포자를 접종하고 각 새에 대해 메로조이107을 접종합니다.

5. 전파 및 FACS 분류

  1. 형질 감염된 포자화염으로 접종 후 5-9 일 동안 대변에서 난모낭을 수집하십시오. 형질 전환 된 메로 조이트 (merozoites)로 접종 한 후 3 일째에 난모낭을 수집하십시오.
  2. 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 및 150 mg /kg 피리메타민8을 사용하여 형질전환 인구 비율을 연속적으로 증가시다.
    참고: 피리메타민을 피드에 직접 추가하여 사용하십시오. 보다 편리하게 사용시 수용성 피리메타민을 준비하십시오. 0.2 mL pf H2SO4 및 N-메틸 피롤리돈 (NMP)의 9.8 mL에 피리메타민 1 g을 녹인 다음 이 스톡 용액 1.5 mL을 조류용 식수 1L에 넣습니다.

6. 선택적 컬럼 정화

참고 : 더 순수한 스포로 조이또는 메로 조이가 필요한 경우, 디에틸 아미노 에틸 -52 셀룰로오스 (DE-52 셀룰로오스) 컬럼을 통해 그들을 정화하는 선택적 방법이 있다.

  1. DE-52 셀룰로오스 컬럼을 적어도 하루 전에 준비하십시오.
    1. 글리신 용리화 완충제를 준비한다(표1). 글리신 용리액 완충액의 pH를 7.6 에서 8.0으로 조정하고 41°C로 미리 따뜻하게 한다.
    2. 열에 DE-52 셀룰로오스 2.5 g을 추가합니다. 물을 넣고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 상급제는 버리십시오.
    3. 물을 넣고 1시간 동안 담그세요.
    4. 0.1 M NaOH를 넣고 적어도 2시간 동안 담가 둡니다. 이 단계를 반복합니다.
    5. 상급물을 물로 바꿉습니다. 셀룰로오스가 바닥에 완전히 정착 한 후 (약 반 시간), 이 단계를 반복하십시오.
    6. 상급제는 버리고 0.1 M HCl을 추가하고 적어도 2 시간 동안 담가 둡니다. 이 단계를 반복합니다.
    7. 상온제를 버리고 글리신 용리온 완충제로 셀룰로오스를 두 번 담급니다.
    8. 0.1 M HCl 또는 0.1 M NaOH를 추가하여 pH를 7.6에서 8.0으로 측정하고 조정합니다.
      참고 :이 부분에서 액체는 DE-52 셀룰로오스보다 적어도 5 배 더 많은 부피를 가지고 있습니다.
  2. 유량을 40-50r/min 사이로 조정합니다.
  3. 셀룰로오스의 침전이 완료되면, 크로마토 그래피 컬럼에 스포로 조이트 또는 메로 조이트 현탁액을 추가하십시오. 유량을 30-40r/min로 조정합니다.
    참고: 크로마토그래피 컬럼을 추가하기 전에 글리신 용리산 완충제으로 스포로조이트 또는 메로조이트 침전물을 다시 일시 중단합니다.
  4. 50 mL 튜브에 글리신 용리액 버퍼로 수집합니다. 용출 과정에서 포자이트 또는 메로조이의 현미경 검사 결과에 따라 수집을 중지하십시오.
  5. 600 x g에서 10분 동안 수집된 글리신 용리액 완충액을 원심분리기. 스포로조이트 또는 메로조이트 침전물을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
  6. 혈세포계를 사용하여 포자형 또는 메로조이트 수를 계산합니다.

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Representative Results

이 프로토콜은 에이메라 기생충을 트랜스펙트하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서,2세대 메론트 및 E. 네카트릭스의 메로조이트는 도 2A도 2B에나타내었으며, 도 2C도 2D는 밀도 그라데이션 용액을 사용한 후 E. 테넬라의 스포로조이스트 및 스포로조이스를 나타내보였다. E. 네카트릭스(그림 3A)E. 테넬라(그림 3B)의난모낭은 메로조이트 또는 포자형염을 핵세포화한 후 또한 나타내보였다. 포자형염을 핵소조한 후 1세대 난모낭의 형질감염 효율은 일반적으로 약 3-10%이다. 그러나, merozoites를 핵소두피한 후에, 2 세대 난모낭의 형질감염 효율은 단지 몇 천분의 일 뿐입니다 (1 세대 난모낭의 형질 전환 효율은 계산될 수 없었다).

Figure 1
그림 1: 포자화체의 정화. (A)밀도 그라데이션 용액으로 밀도 구배 원심분리를 통해 포자를 정화합니다. (B)DE-52 셀룰로오스 컬럼을 통해 포자를 정화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: E. necatrix의 2세대 메론과 메로조이트는 E. 테넬라의스포로시스트 및 스포로조이트와 함께. (A) E. 네카트릭스의성숙한2 세대 메론 . (B) E. 네카트릭스의2세대 메로조이트 출시. (C)정화 후 E. 테넬라의 스포로시스트. (D)정화 후 스포로조이트 E. 테넬라. 눈금 막대는 10 μm입니다.

Figure 3
도 3: 핵감염 메로조이또는 포자형염에 감염된 후 수득된 난모낭체. (A)핵감염 메로조이에 감염된 후 E. 네카트릭스의 난모낭. (B)핵감염 된 스포로 조이에 감염 된 후 E. 테넬라의 난모낭. 눈금 막대는 10 μm입니다.

버퍼 구성
소화 버퍼 트립신 0.25 g, 타우로도옥쇼레이트 나트륨 0.5 g, PBS 또는 HBSS 100 ml
0.1 M NaOH NaOH 2 g, 물 500ml
0.1 M HCl 농축 염산 4.3 ml, 물 500ml
글리신 용리화 완충제 글리신 0.75 g, NaCl 7.9 g, 물 500ml
설명 버퍼 0.75% 트립신, 10% 닭담, PBS
1 × DG 그라데이션 스톡 솔루션(퍼콜) 90% 1 × DG 그라데이션 스톡 솔루션 (퍼콜), 10 % PBS (10 X)
핵방출 완충제 I ATP-디소듐 2g, MgCl2-6H2O 1.2 g, 물 10ml
핵형성 완충제 II KH2PO4 6g, NaHCO3 0.6 g, 포도당 0.2 g, 물 500ml
*물: 증류수

표 1: 버퍼 의 구성.

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Discussion

1990 년대에, 형질 전환 시스템은 apicomplexan 기생충을 위해 개발되고, eimerian 기생충에 대한 연구를 위해 이용되었습니다. 최근에는 E. 테넬라8,9E. nieschulzi15에서안정적인 형혈이 수행되었다. 2세대 메로조이트11을트랜스펙팅하여 E. 네카트릭스의 안정적인 형혈을 달성했습니다. 날개 정맥을 통해 E. acervulina의 형질 감염 된 포자형의 접종은 Cloacal 경로를 통해 접종 될 E. acervulina의 포자 졸의 무능력을 해결 (장 외, 게시되지 않은 데이터). 여기에서, 우리는 연구원이 에이머리안 기생충을 핵을 돕기 위하여 상세한 형질감염 절차를 기술했습니다.

이전 연구는 E. magna16E. 내장의생체 내 안정적인 형질 감염에 대한 개복술에서 토끼의 장 내루에 형질 감염된 스포로조이를 주입하는 것이 가능하다는 것을보여주었다. 우리의 경험에 따르면, oocysts 대신 FACS에 의해 sporocysts를 분류 할 때 더 높은 효율성이 있었다. 또한 eGFP-Ham-OTU RNA18,19를이용한 유전자 총 시스템 또는 산발화된 난모낭의 성공적인 전기포공을 이용한 E. maxima의 비포식 우모낭의 형질감염에 대한 보고가 있었다. 따라서, 우리의 미래 연구는 Eimeria 기생충에 있는 형혈 절차를 단순화하기 위하여 난모낭또는 sporocysts의 형질혈을 탐구합니다.

에이메리안 기생충의 형질전환 성공은 C. jejuni13에서CjaA와 같은 이종 항원을 운반하기 위해 백신 차량으로 사용될 수 있는 유전자 변형 에이메리아를 가능하게 할 수 있었다. Eimeria에 있는 형혈 효율성이 현저하게 향상되었더라도, 유전자 편집 기술은 eimerian 기생충에 있는 한계가 계속있습니다. 에이메리아에서의한 형질전환의 발달로, 에이메리아의 CRISPR/CAS9 기술(Hu et al., 미공개 데이터)은 에이메리아의유전자 조작으로 이어질 수 있다.

결론적으로,이 프로토콜은 닭 에이메리아의 핵 에이메리아의핵에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 포자이트 또는 메로조이족의 형질감염은 에이메리아의유전자 기능 연구에 매우 중요합니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFD0501200)과 중국 국립 자연 과학 재단 (31572507, 31772728 및 31873007)에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP-disodium Sigma A26209
Cellulose DE-52 Solarbio C8350
Constant Flow Pump SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. HL-2B
DMEM MACGENE CM15019
Glass beads Sigma Z250473-1PAK
Glucose Sigma No. V900116
Glycine Biotopped G6200
HBSS MACGENE CC016
KH2PO4 Sigma No. V900041
Low Speed Centrifuge BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. DT5-2
Magnetic Mixer SCILOGEX MS-H280-Pro
MgCl2 Sigma 449164
MoFlo cell sorter BeckMan Coulter, US 201309995
NaHCO3 Sigma 144-55-8
Nucleofection device LONZA/amaxa 90900012 (Nucleofector II)
PBS Solarbio P1010
Percoll (DG gradient stock solution) GE Healthcare 17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate Sigma T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin Solarbio T8150
Vortex Mixer Beijing North TZ-Biotech Develop.co. HQ-60-II
Water Bath Thermostat Grant Instruments (Cambridge), Ltd. GD120,GM0815010

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References

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