Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Biology

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Summary

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

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Duan, C., Tang, X., Hu, D., Zhang, S., Liu, J., Bi, F., Hao, Z., Suo, J., Yu, Y., Wang, M., Sun, P., Du, L., Suo, X., Liu, X. Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites. J. Vis. Exp. (156), e60552, doi:10.3791/60552 (2020).

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Abstract

Transfektion ist ein technischer Prozess, durch den genetisches Material, wie DNA und doppelsträngige RNA, in Zellen abgegeben werden, um das Gen von Interesse zu modifizieren. Derzeit wird die transgene Technologie zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung von Eimeria, den Erregern der Kokzidiose bei Geflügel und Vieh. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der stabilen Transfektion bei eimerischen Parasiten: Reinigung und Nukleofektion von Sporozoiten oder Merozoiten der zweiten Generation und in vivo Vermehrung transfizierter Parasiten. Mit diesem Protokoll erreichten wir die Transfektion bei mehreren Eimeria-Arten. Zusammengenommen ist die Nukleofektion ein nützliches Werkzeug, um genetische Manipulationen bei eimerischen Parasiten zu erleichtern.

Introduction

Eimeria spp. verursacht Kokziidiose, was zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Vieh- und Geflügelindustrie führt. Obwohl Antikokiside und in gewissem Maße abgeschwächte Antikokzien-Impfstoffe häufig zur Bekämpfung der Kokzidizien-Impfung eingesetzt wurden, gibt es immer noch Mängel in Bezug auf ihre Arzneimittelresistenz, Arzneimittelrückstände und die mögliche Diffusion von Impfstoffstämmen, die virulenz zurückgewinnen1. Mit der Entwicklung der Molekularbiologie ist die Transfektion zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Genfunktionen zu untersuchen, neuartige Impfstoffe zu entwickeln und neue Wirkstoffziele für Eimeriazu screening.

In den letzten Jahrzehnten wurde die Transfektion erfolgreich für apicomplexan Parasiten wie Plasmodium und Toxoplasma gondii2,3,4,5,6angewendet. Eine Studie, in der die Transfektion in E. tenella als Reporter für die Transfektion verwendet wurde, führte in Eimeria7auf solche Arbeiten. Die Transfektion von E. tenella8,9, E. mitis10und E. acervulina (Zhang et al., unveröffentlichte Daten) war bei Hühnern erfolgreich. Kürzlich erreichten wir die Transfektion mit Merozoiten von E. necatrix durch Nukleofection11.

Studien zeigten, dass Eimeria, die ein heterologes Antigen exizipieren, das Potenzial hat, als rekombinanter Impfstoff entwickelt zu werden, wie z. B. solche, die Campylobacter Jejuni-Antigen A (CjaA) oder Huhn interleukin 2 (chIL-2)12,13. Daher beschreibt dieses Protokoll eine Nukleofektionsstudie von Eimeria spp. bei Hühnern. Das Verfahren beschreibt die Reinigung von Sporozoiten oder Merozoiten, Die Nukleofektion mit Plasmid-DNA, die cloakale Inokulation/intravenöse Injektion und die In-vivo-Vermehrung, um Forschern zu helfen, Studien über transgene Eimeria-Parasiten zu beginnen.

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Protocol

Hühner für alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee untergebracht und gepflegt und folgten den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren. Die Experimente wurden vom Beijing Administration Committee of Laboratory Animals genehmigt.

1. Extraktion und Reinigung von Sporozoiten von Eimeria spp. (z.B. E. tenella)

  1. Freisetzung von Sporozysten
    1. Zentrifuge 1 x 107sporulierte Oozysten in Kaliumdichromatlösung (2,5%, m/v) bei 2.300 x g für 5 min. Waschen Sie sie dreimal mit PBS (Phosphatpufferlösung).
    2. Die Pellets mit 1 ml PBS aussetzen und in ein 15 ml Rohr übertragen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Glasperlen (1 mm x 1 mm Durchmesserbereich) hinzu und oszillieren Sie die Oozystensuspension mit einem Wirbelmischer, um die Sporozysten freizusetzen.
    3. Überwachen Sie die Freisetzung von Sporozysten per Mikroskopie im Minutentakt. Stoppen Sie wirbeln, wenn mehr als 90% der Oozysten gebrochen sind.
      HINWEIS: Die meisten Oozysten (wie E. tenella, E. necatrixund E. acervulina) wurden nach 1 min mit dem Wirbelmischer gebrochen.
    4. Die Sporozystensuspension in neue 1,5 ml-Rohre und Zentrifuge bei 1.600 x g für 5 min übertragen.
    5. Den Niederschlag mit 1 ml 50% Dichtegradientenlösung aussetzen, in einem 1,5 ml Rohr kombinieren und zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
      ANMERKUNG: Für die Dichtegradientenzusammensetzung siehe Tabelle 1. Der Dichtegradient ist ein kolloidales Mittel auf Kieselsäurebasis, bestehend aus kolloidalen Kieselsäurepartikeln mit 15-30 nm Durchmesser (23% w/w in Wasser), die mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet wurden.
  2. Freisetzung von Sporozoiten
    1. Den Niederschlag mit dem Excystationspuffer (Tabelle 1) wieder aufbrechen und in einem 42 °C-Wasserbad für 40-60 min inkubieren, um die Sporozoiten freizusetzen. Stoppen Sie die Inkubation, wenn mehr als 90% der Sporozoiten freigesetzt werden. Dann Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Rohre einmal alle 5 Minuten während der Excystation.
    2. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml 55% Dichtegradientenlösung und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min aus.
    3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Sporozoiten mit einem Hämozytometer.

2. Sammlung und Reinigung von Merozoiten von E. necatrix

HINWEIS: Verwenden Sie Arbor Acre (AA) Masthähnchen im Alter von 7-14 d im Experiment. Kokzienfreie Hühner (n=3) wurden mit 2 x 105 Oozysten von E. necatrixgeimpft. Bei 109 h nach der Infektion wurden die Vögel durch zervikale Dislokation geopfert. Der Darm wurde für die Sammlung der2. Generation merozoites entfernt. Für verschiedene Eimeria-Arten gab es eine andere Zeit für die Sammlung der Merozoiten der2. Generation: E. necatrix bei 109 h und E. tenella bei 112 h nach der Impfung. Für die Transfektion von E. necatrixsind Merozoite die optimale Wahl, da die zweiten Merozoiten leicht zu reinigen sind.

  1. Sammlung der Merozoiten der zweiten Generation von E. necatrix
    1. Den Hühnerdarm längs schneiden, vom Dotterstiel (der Mitte des Dünndarms) bis zur ileocecal-Öffnung, und mit PBS oder HBSS (Hank es Balanced Salt Solution) in einer Petrischale dreimal sanft waschen.
    2. Den Darm in 0,5 cm x 0,5 cm Stücke schneiden und in einen konischen Kolben mit einem Verdauungspuffer legen (Tabelle 1). Legen Sie den Kolben auf einen Magnetmischer bei 37 °C mit einem Rührbalken für 30-60 min, um Merozoite freizusetzen. Nach 30 min Inkubation, überwachen Sie die Freisetzung von Merozoiten durch mikroskopische Untersuchung alle 5 min.
  2. Reinigen Sie die Merozoite durch Filtration und Zentrifugation.
    1. Filtern Sie die Suspension mit verdauten Merozoiten mit vier Schichten Gaze14und Zentrifuge bei 600 x g für 10 min.
    2. Nach der Zentrifugation den Überstand, der Darmablagerungen enthält, entsorgen. Übertragen Sie den Niederschlag mit gereinigten Merozoiten auf 1,5 ml Rohre.
    3. Setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml PBS wieder auf und zählen Sie die Merozoiten mit einem Hämozytometer.

3. Nukleofektion von Merozoiten oder Sporozoiten

  1. Zubereitung vor Nukleofektion von Parasiten
    1. Bereiten Sie etwa 107 Merozoite oder Sporozoite in einer Röhre vor. Wenn Sie Merozoite transfizieren, bereiten Sie 3-4 Röhren vor.
    2. Bereiten Sie eine Menge an Plasmid-DNA oder gereinigtem PCR-Fragment vor, das größer oder gleich 10 g ist.
      HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Plasmid enthält 2 Gene: verbessertes gelbes fluoreszierendes Protein (EYFP) und Dihydrofolat-Reduktase Thymidylat-Synthase aus Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15.
    3. Bereiten Sie 25 U restriktionsenzym vor. Wenn Plasmide linearisiert werden, kann das Restriktionsenzym die Transfektionseffizienz verbessern. Wenn die Plasmide kreisförmig sind, lassen Sie das Restriktionsenzym weg.
    4. Bereiten Sie 85 l Nukleofektionspuffer vor: Mischen Sie 20 L Nukleofektionspuffer I und 1 ml Nukleofektionspuffer II, und verwenden Sie einen Teil der Lösung. Das Volumen des Gesamtpuffers beträgt 100 L.
  2. Nukleofection
    1. Zentrifugieren Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension bei 600 x g für 10 min. Dann entsorgen Sie den Überstand.
    2. In der folgenden Reihenfolge fügen Sie 85 l Kerntransfektionspuffer, 10 g Plasmid (PCR-Fragment) und 25 U Restriktionsenzym (in der Regel 5 l) in das 1,5 ml-Rohr mit Sporozoiten oder Merozoiten ein.
    3. Übertragen Sie die Suspension auf einen nuklearen Transfektionsbecher. Den Becher in eine nukleare Transfernut legen.
    4. Schalten Sie die Nahrektionsvorrichtung mit dem Netzschalter ein und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033. Wenn das Nukleofection-Gerät im Modus "Freie Programmauswahl" gestartet wird, beenden Sie diesen Modus, indem Sie die X-Taste drücken.
    5. Wenn das Programm abgeschlossen ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm sollte OKanzeigen, was darauf hinweist, dass die Nukleofektion erfolgreich ist.
    6. Fügen Sie 0,5-1 ml Von Dulbeccoes Modified Eagle es Medium (DMEM)8 in den Nukleofection-Becher, um die Reaktion zu stoppen und die Suspension nach dem sanften Mischen auf 1,5 ml Rohr zu übertragen.

4. Cloakalinokulation oder intravenöse Injektion

  1. Impfen Sie die Nukleofekten Parasiten zu 7 Tage alten Hühnern. Impfen Sie die Merozoiten von E. necatrix oder die Sporozoiten von E. tenella über den kloaken Weg, aber impfen Sie E. acervulina sporozoites durch intravenöse Injektion. Impfen Sie etwa 2 x 107 Millionen Sporozoiten in jedes Huhn und inkoluieren Merozoiten 107 für jeden Vogel.

5. Vermehrung und FACS-Sortierung

  1. Sammeln Sie Oozysten aus Kot 5-9 Tage nach der Impfung mit transfizierten Sporozoiten. Sammeln Sie die Oozysten am dritten Tag nach der Impfung mit transfizierten Merozoiten.
  2. Verwenden Sie fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und 150 mg/kg Pyrimethamin8, um das transgene Populationsverhältnis sukzessive zu erhöhen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Pyrimethamin, indem Sie es direkt in den Feed einfügen. Für eine bequemere Verwendung bereiten Sie wasserlösliches Pyrimethamin vor. 1 g Pyrimethamin in 0,2 ml pfH2SO4 und 9,8 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) auflösen und dann 1,5 ml dieser Stammlösung in 1 L Trinkwasser für Vögel geben.

6. Optionale Säulenreinigung

HINWEIS: Wenn mehr reine Sporozoiten oder Merozoite benötigt werden, gibt es eine optionale Methode, die sie durch eine Diethylaminoethyl-52-Zellulosesäule (DE-52-Zellulose) reinigt.

  1. Bereiten Sie die DE-52-Zellulosesäule mindestens einen Tag im Voraus vor.
    1. Vorbereiten des Glycin-Eluentenpuffers (Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert des Glycin-Eluentenpuffers von 7,6 auf 8,0 und auf 41 °C vorgewärmt an.
    2. 2,5 g DE-52-Zellulose in die Säule geben. Wasser hinzufügen und über Nacht einweichen. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Wasser hinzufügen und 1 h einweichen. Den Überstand entsorgen.
    4. 0,1 M NaOH hinzufügen und mindestens 2 Stunden einweichen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    5. Ersetzen Sie den Überstand durch Wasser. Nachdem sich die Zellulose vollständig auf den Boden (ca. eine halbe Stunde) gelegt hat, wiederholen Sie diesen Schritt.
    6. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 0,1 M HCl hinzu und tränken Sie ihn mindestens 2 Stunden lang. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und tränken Sie die Zellulose zweimal mit dem Glycin-Eluentenpuffer.
    8. Messen und einstellen Sie den pH-Wert von 7,6 auf 8,0, indem Sie 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH hinzufügen.
      HINWEIS: In diesem Teil hat die Flüssigkeit mindestens 5x mehr Volumen als die von DE-52 Cellulose.
  2. Stellen Sie den Durchfluss zwischen 40-50 r/min ein.
  3. Wenn die Sedimentation von Zellulose abgeschlossen ist, fügen Sie die Sporozoit- oder Merozoitsuspension in die chromatographische Säule ein. Stellen Sie den Durchfluss auf 30-40 r/min ein.
    HINWEIS: Setzen Sie die Sporozoit- oder Merozoitfällung mit Glycin-Eluentenpuffer aus, bevor Sie die chromatographische Säule hinzufügen.
  4. Mit Glycin-Eluentenpuffer in 50 ml-Rohre sammeln. Stoppen Sie die Sammlung gemäß den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung von Sporozoiten oder Merozoiten während des Elutionsprozesses.
  5. Zentrifuge den bei 600 x g gesammelten Glycin-Eluentenpuffer für 10 min. Übertragen Sie den Sporozoit- oder Merozoitniederschlag in neue 1,5 ml-Rohre.
  6. Zählen Sie die Sporozoiten oder Merozoiten mit einem Hämozytometer.

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Representative Results

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eimerian Parasiten zu transfekten. In dieser Studie wurden die Meronten und Merozoiten der2. Generation von E. necatrix in Abbildung 2A und Abbildung 2Bdargestellt, während Abbildung 2C und Abbildung 2D die Sporozysten und Sporozoiten von E. tenella nach Verwendung der Dichtegradientenlösungen zeigten. Die Oozysten von E. necatrix (Abbildung 3A) und E. tenella (Abbildung 3B) nach der Nukleektion der Merozoiten oder Sporozoiten wurden ebenfalls gezeigt. Die Transfektionseffizienz von Oozysten der ersten Generation nach nukleofektieren der Sporozoiten beträgt im Allgemeinen etwa 3-10%. Nach der Nukleektion der Merozoite beträgt die Transfektionseffizienz von Oozysten der zweiten Generation jedoch nur wenige Tausendstel (Transfektionseffizienz von Oozysten der ersten Generation konnte nicht berechnet werden).

Figure 1
Abbildung 1: Reinigung von Sporozoiten. (A) Reinigen Sie Sporozoite durch die Dichte-Gradientenzentrifugation mit Dichtegradientenlösungen. (B) Sporozoite durch die DE-52-Zellulosesäule reinigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Meronts und Merozoiten der2. Generation von E. necatrix zusammen mit den Sporozysten und Sporozoiten von E. tenella. (A) Reife2. Generation meronts von E. necatrix. (B) Die freigesetzten Merozoiten der2. Generation von E. necatrix. (C) Sporozysten von E. tenella nach der Reinigung. (D) Sporozoiten E. tenella nach der Reinigung. Die Maßstabsleiste ist 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Oozysten, die nach der Infektin mit den Nukleofekten Merozoiten oder Sporozoiten erhalten wurden. (A) Die Oozysten von E. necatrix nach der Infektierung mit den Nukleofekten Merozoiten. (B) Die Oozysten von E. tenella nach der Infizierung mit nukleofekten Sporozoiten. Die Maßstabsleiste ist 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Puffer Zusammensetzung
Verdauungspuffer 0,25 g Trypsin, 0,5 g Natriumtaurodeoxycholathydrat, 100 ml PBS oder HBSS
0,1 M NaOH 2 g NaOH, 500 ml Wasser
0,1 M HCl 4,3 ml konzentrierte Salzsäure, 500 ml Wasser
Glycin-Eluentenpuffer 0,75 g Glycin, 7,9 g NaCl, 500 ml Wasser
Excystationspuffer 0,75% Trypsin, 10% Hähnchengalle, PBS
1 - DG Gradientenstocklösung (Percoll) 90 % 1 x DG Gradientenlagerlösung (Percoll), 10 % PBS (10 X)
Nukleofection-Puffer I ATP-Dinatrium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml Wasser
Nukleofection-Puffer II KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, Glukose 0,2 g, 500 ml Wasser
*Wasser: destilliertes Wasser

Tabelle 1: Zusammensetzung der Puffer.

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Discussion

In den 1990er Jahren wurde ein Transfektionssystem für apicomplexan Parasiten entwickelt, und es wurde für Studien über eimerische Parasiten verwendet. Kürzlich wurde eine stabile Transfektion in E. tenella8,9 und E. nieschulzi15durchgeführt. Wir erreichten die stabile Transfektion von E. necatrix durch transfizierende Merozoiten der zweiten Generation11. Die Impfung der transfizierten Sporozoiten von E. acervulina durch die Flügelvene löste die Unfähigkeit von Sporozoiten von E. acervulina auf, über den Kloakalweg geimpft zu werden (Zhang et al., unveröffentlichte Daten). Hier beschrieben wir ein detailliertes Transfektionsverfahren, um Forschern zu helfen, eimerianische Parasiten zu nukleofect.

Frühere Studien zeigten, dass es möglich war, transfizierte Sporozoiten in das Darmlumen von Kaninchen in einer Laparotomie zur in vivo stabilen Transfektion von E. magna16 und E. intestinalis17zu injizieren. Nach unserer Erfahrung gab es eine höhere Effizienz beim Sortieren von Sporozysten durch FACS anstelle von Oozysten. Es gab auch Berichte über die Transfektion von ungeporulierten Oozysten von E. maxima mit einem Gengewehrsystem oder eine erfolgreiche Elektroporation von sporulierten Oozysten mit eGFP-Ham-OTU RNA18,19. So untersuchen unsere zukünftigen Studien die Transfektion von Oozysten oder Sporozysten, um die Transfektionsverfahren bei Eimeria-Parasiten zu vereinfachen.

Der Transfektionserfolg bei eimerischen Parasiten könnte es ermöglichen, gentechnisch veränderte Eimeria als Impfstoffvehikel für heterologe Antigene wie CjaA von C. jejuni13zu verwenden. Obwohl die Transfektionseffizienz in Eimeria deutlich verbessert wurde, hat die Gen-Editing-Technologie weiterhin Einschränkungen bei eimerischen Parasiten. Mit der Entwicklung der Transfektion in Eimeriakönnte die CRISPR/CAS9-Technologie in Eimeria (Hu et al., unveröffentlichte Daten) zu einer genetischen Manipulation von Eimeriaführen.

Abschließend enthält dieses Protokoll ein detailliertes Verfahren für die Nukleofektion bei Hühnereimeria. Die Transfektion von Sporozoiten oder Merozoiten ist wertvoll für die Untersuchung der Genfunktion in Eimeria.

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Disclosures

nichts.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) und der National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 und 31873007) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP-disodium Sigma A26209
Cellulose DE-52 Solarbio C8350
Constant Flow Pump SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. HL-2B
DMEM MACGENE CM15019
Glass beads Sigma Z250473-1PAK
Glucose Sigma No. V900116
Glycine Biotopped G6200
HBSS MACGENE CC016
KH2PO4 Sigma No. V900041
Low Speed Centrifuge BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. DT5-2
Magnetic Mixer SCILOGEX MS-H280-Pro
MgCl2 Sigma 449164
MoFlo cell sorter BeckMan Coulter, US 201309995
NaHCO3 Sigma 144-55-8
Nucleofection device LONZA/amaxa 90900012 (Nucleofector II)
PBS Solarbio P1010
Percoll (DG gradient stock solution) GE Healthcare 17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate Sigma T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin Solarbio T8150
Vortex Mixer Beijing North TZ-Biotech Develop.co. HQ-60-II
Water Bath Thermostat Grant Instruments (Cambridge), Ltd. GD120,GM0815010

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References

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