무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Developmental Biology

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Summary

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

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Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

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Abstract

척추 동물 신경계의 발달은 복잡한 세포 행동 및 상호 작용의 정확한 조정을 요구합니다. 생체 내 이미징 기술에서 고해상도의 사용은 살아있는 유기체에서 이러한 과정에 명확한 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 세포와 그들의 자손을 나누는 것은 신경계가 형성될 때 실시간으로 따를 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다색 기술의 기술 발전은 조사 할 수있는 질문의 유형을 확장했다. 다중 색 Brainbow 접근법은 세포와 같은 것을 구별할 뿐만 아니라, 각각 하나의 전구 세포로부터 파생되는 관련 세포의 여러 가지 다른 클론을 색상 코드화하는 데 사용될 수 있습니다. 이를 통해 개발 중에 다양한 클론과 해당 동작의 멀티플렉스 계보 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다. 이것은 전통적인 프로모터 구동 색상을 사용하여 차별화하기 어려운 세포 들 간의 세포 상호 작용을 따르는 데 특히 유용합니다. 우리의 접근 방식은 동시에 여러 다른 클론 간의 계보 관계를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 생성된 대규모 데이터 세트는 유전적 또는 약리학적 조작에 걸쳐 정량적으로 비교할 수 있는 풍부한 정보를 제공합니다. 궁극적으로 생성 된 결과 신 경계 개발 방법에 대 한 체계적인 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다.

Introduction

발달의 초기 단계에서, 전문화한 선조 세포의 풀은 증식 지역에서 반복적으로 분할하여 딸 세포의 다양한 배열을 생성합니다. 이 발달 기간 도중 품어든 세포는 그 때 분화하고 초기 기관을 형성하기 위하여 여행할 것입니다. 신경계에서는 방사형 glia와 같은 선조가 심실 영역에서 미성숙한 뉴런을 발생시다. 뉴런이 심실에서 멀어지고 성숙함에 따라 확장 조직은 결국 뇌의 매우 복잡한 구조를 형성합니다11,2,3,34,45,,56. 선조의 분열과 뉴런의 분화 및 이동 사이의 조정은 뇌의 최종 크기, 모양 및 따라서 기능을 결정하며, 행동7,,8,,9,,10에직접적인 영향을 미칩니다. 이러한 프로세스에 대 한 엄격한 제어는 명확 하 게 정상적인 두뇌 개발에 대 한 중요 한 동안, 이러한 역학을 조절 하는 글로벌 메커니즘은 잘 이해 되지 않습니다. 여기에서 우리는 세포 해결책에 있는 신경계 발달을 공부하는 공구를 기술합니다, 연구원이 Brainbow를 가진 개발 제브라피시 두뇌에 있는 생체 내 선조 세포 및 신경세포를 구상하고 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 통해 그들의 행동을 추적하는 것을허용합니다 11. 접근은 또한 발전 태아의 그밖 부분을 구상하기 위하여 적응될 수 있습니다.

제브라피쉬 뇌의 세포를 관찰하고 구별하기 위해, 우리는 Brainbow 세포 라벨링 기술11을적용했습니다. Brainbow는 세포의 인구를 표시하기 위하여 3개의 명백한 형광성 단백질 (FPs)의 무작위로 결정된, 조합식 식을 이용합니다. Brainbow 발현에 대한 기본 발현은 적색 FP dTomato인 반면, 효소 Cre 재조합효소에 의한 재조합은 mCerulean(청색 형광 단백질, CFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)12,,13의발현을 초래한다. 세포에서 발현되는 각 FP의 결합된 양은 독특한 색조를 제공하여 인접한 세포와 명확한 시각적 구별을 허용합니다. 추가적으로, 선조 세포가 분할할 때, 각 딸 세포는 그것의 어머니 세포에서 색깔을 승계할 것입니다, 색깔 로 구분된 클론을 생성하고 연구원이 세포 계보를 추적하는 것을허용합니다 11,,14. 원래 마우스12에서뉴런 회로를 분석하는 데 사용되었지만, Brainbow는 이후 제브라피시15를포함한 다양한 모델 유기체로 표현되어 왔다.

우리의 기술은 살아있는 제브라피시에서 시간이 지남에 따라 여러 가지 색상 으로 구분 된 클론을 직접 이미지화하기 위해 이전의 다색 라벨링 및 이미징 방법을 기반으로합니다. 배아로서의 광학적 투명성으로 인해 제브라피쉬는 이미징 실험,16에적합하며, 이전 연구에서는 제브라피쉬의 Brainbow를 활용하여 신경계11, 15,,15,17,,18,19,,20,,21,22,,,23,,24,,25,, 26,27. 살아있는 유기체로 직접 이미지화 할 수있는 능력과 빠른 자궁 발달로 얼룩말은 척추 동물 발달의 귀중한 모델로 만듭니다. 포유류 뇌와 는 달리, 제브라피쉬 뒷뇌의 전체 증식 영역은 내인성 환경에 지장을 주지 않고 이미징을 위해 쉽게 사용할 수 있다6. 이것은 시험관 내 또는 고정된 조직 준비보다는 살아있는 유기체에서 실험이 실행될 수 있습니다. 고정 된 이미징 실험과는 달리 생체 내 연구는 세로 설계를 허용하여 패턴을 분석 할 수있는 몇 시간의 데이터를 생성하므로 상대적으로 드문 사건을 관찰 할 가능성이 높아집니다. 관심 있는 사건의 속도와 길이에 따라, 연구원은 짧은 (1-2 시간) 또는 긴 (~16 시간) 시간 경과 화상 진찰 실험을 능력을 발휘하도록 선택할 수 있습니다. 제브라피쉬 열충격프로모터(70)(hsp70, hsp)를 이용하여, 무지개발현은28,,29를시간적으로 조절할 수 있다. 부가적으로, 이러한 프로모터에 의해 유도된 모자이크 발현은 많은클론(11)에라벨링 및 추적에 적합하다.

살아있는 두뇌 내의 다중 클론을 시각적으로 확인하는 기능은 이 방법의 이점입니다. 신경계의 발달 내에서 클론의 역할을 조사한 중요한 이전 연구는 단일 전구 세포및 그 자손에게 단일 FP 또는 기타 쉽게 시각화된 단백질을 사용하여 라벨을 붙이기 위해 레트로바이러스 벡터를 활용하였다. 이러한 라벨링은 연구원이 생체 외 또는 생체 내2,,30, 31,,3231,,33,34,35,36,37,,38에서시간이 지남에 따라 단일 복제를 관찰 할 수 있게합니다. 하나의 클론 내에서 세포의 동작을 추적하는 방법과는 달리, Brainbow의 뚜렷한 색상은 연구원이 클론 중 역학을 관찰 할 수 있습니다. 추가적으로, 뇌 내의 많은 클론에 레이블을 Brainbow를 사용하여, 복제 동작에 대한 추가 데이터는 단일 클론11에레이블을 지정하는 기술에 비해 수집된다. 중요한 것은, 여기에 기술된 접근법은 상이한 유전적 또는 약리학적 조작을 겪은 물고기 들 사이의 발달 비교를 생성하기 위해 확장될 수 있다18. 전반적으로, 이러한 장점은 척추 동물 신경계의 개발을 탐구하는 연구자, 특히 클론의 역할에 관심이있는 연구자들에게 이상적인 Brainbow 표현 얼룩말의 생체 내 공초점 이미징에서 시간 경과를 만듭니다.

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Protocol

동물 과목과 관련된 절차는 루이스 & 클라크 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 얼룩말 어피 배아의 미세 주입

  1. 야생형, 성인용 제브라피쉬를 성분리형 짝짓기탱크에 설치하여 오후에미세주사39,,40을수행한다.
  2. 미세 주사의 아침에 DNA 용액을 준비하십시오. 희석 hsp:Zebrabow11 플라스미드 DNA는 0.1 mM KCl에서 ~ 10 ng/μL의 농도로, 2.5% 페놀 레드 및 3.75U 크레 재조합 효소와 함께.
  3. 수정39,,41의45 분 이내에 1 세포 얼룩말 배아에 DNA 용액의 미세 주입을 수행합니다. 이 용액의 약 4.2 nL를 각 배아에 주입하십시오, 플라스미드 DNA의 ~ 42 pg에 해당.
    참고: 미세주사 단계는 Tg(유비:Zebrabow)15Tg(neurod:Zebrabow)18과같이 형질전환, 무지개 발현 제브라피시 라인이 대신 짝짓기되는 경우 생략될 수 있다. 미세 주사를 수행하는 것은 연구원이 복사 수와 라벨 링 밀도를 적정 할 수 있기 때문에 유리할 수 있습니다. 더욱이, 특정 유전자 생성물들을 태그하거나 조작하는 제2 DNA 구성물은 원하는 경우 Brainbow와 함께 주사될 수 있다(예를 들어, Brainbow18을보완하는 원붉은 형광 단백질).
  4. 24시간 동안 28°C 인큐베이터에서 E3 배지39의 페트리 접시에 주입된 배아를 유지한다.

2. 무지개 표현을 유도하는 열 충격

참고: 플라스미드 DNA가 주입되거나 이식유전자가 hsp70 프로모터를 이용하여 발현을 유도하지 않는 경우, 열 충격 단계는 건너뛸 수 있으며, 건강한 배아는 즉시 24시간 후 수정(hpf)에서 페닐티우레아(PTU)로 옮겨져야 한다.

  1. 24 hpf에서, 주입된 배아군으로부터 죽은 배아와 변형된 배아를 컬라. 그런 다음 건강한 배아를 최대 20 개의 배아 / 튜브로 50 mL 튜브로 옮김을 옮김하십시오.
  2. E3의 10 mL로 튜브를 채웁니다. 각 튜브 위에 뚜껑을 씌우지만 단단히 닫지 마십시오.
  3. 50 mL 튜브를 포함하는 튜브 랙을 37°C 수조에 똑바로 놓습니다. 욕조의 수위가 튜브의 E3 수준보다 높은지 확인하고 80 ~ 90 분 동안 둡니다.
  4. 수조에서 배아와 튜브 랙을 제거하고 28°C 인큐베이터로 수직으로 되돌아갑니다. E3가 식고 배아가 온도에 점차적으로 다시 적응할 수 있도록 최대 1시간 동안 허용하십시오. 이어서, 배아의 색소침착을 방지하기 위해 인큐베이터에서 따뜻하게 한 E3에서 0.2 mM PTU의 페트리 접시로 배아를 옮깁니다.
    주의 사항: PTU는 주의 해서 취급 하 고 적절 하 게 폐기 해야 하는 독성 화학 물질. 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.

3. 무지개 발현을 위한 배아 선별

  1. 열 쇼크 후 2 ~4 시간에서, CFP 또는 YFP의 발현을위한 표준 형광 해부 현미경의 밑에 배아를 검사, 이는 성공적인 Brainbow 재조합을 나타냅니다 (dTomato의 기본 발현에서).
    참고: 여러 형광 필터 옵션을 사용할 수 있는 경우, CFP에 대 한 스크리닝 잘 재결합 된 물고기를 식별 하는 가장 효율적인 방법입니다. CFP 및 YFP 필터를 사용할 수 없는 경우, YFP는 스펙트럼 프로필의 중첩으로 인해 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 하에서 희미하게 시각화될 수 있습니다.
  2. 전체에 강력한 FP 발현을 가진 배아를 선택하고 PTU를 사용하여 별도의 접시로 옮깁니다. 1일 후 수정 후(dpf; 28 hpf 이상) 또는 PTU에서 배아를 2 또는 3 dpf에서 이미지로 유지한다.

4. 생체 내 이미징을 위한 배아 장착

  1. 실험 당일 에 이미징 챔버 및 배아 조작 도구를 준비하십시오.
    1. 60mm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 링을 조심스럽게 과대 로 하여 이미징 챔버를 준비합니다.
    2. 선택적으로, 맞춤형 배아 조작기를 준비하여 장착하는 동안 접시 내의 배아와 오리엔트 배아를 이동시다. 나일론 낚싯줄의 작은 길이 (~1/2 in, ~ 6 lb)를 나무 면봉 스틱 끝에 접착하여 조작기를 구성하여 길이가 ~4로 자른다.
  2. 필요한 경우(즉, 2 dpf 또는 그 이전의 이미징) 배아를 박리 현미경으로 주사기를 사용하여 데코리오네이트하는 배아를 장착하기 전에.
  3. 얼룩말 물고기 배아를 마취.
    1. E3로 60mm 페트리 접시를 반쯤 채우고 4 mg/mL MS-222 트리카인-S 5-6 방울을 ~0.2 mM의 최종 농도에 추가합니다. 소용돌이로 섞어보세요.
      주의 사항: 트리카인은 주의하여 취급하고 적당히 폐기되어야 합니다.
    2. PTU에서 트리카인 용액으로 배아를 옮겨 가능한 한 적은 PTU가 전달되도록 합니다. 물고기 반사는 1-2 분 후에 중단되어야 하는 동안, 시간 경과 화상 진찰 실험을 위한 철저한 마취를 지키기 위하여 트리카인에 있는 태아를 최대 10 분 동안 둡니다.
    3. 배아가 제대로 마취되어 있는지 확인하십시오. 배아 조작기와 함께 배아 꼬리를 부드럽게 만져 서 깜짝 놀랄만한 반사를 평가합니다. 반사 운동이 관찰되면, 가능한 한 배아에서 멀리 접시에 트리카인 한 방울을 추가하고 혼합 소용돌이. 해부 범위 하에서 배아 심박수를 관찰하십시오. 비정상적으로 느린 경우, 트리카인 농도를 줄이기 위해 접시에 E3 방울을 추가하십시오.
  4. 아가로즈에 마취 된 배아를 마운트합니다.
    1. 이미징 챔버 내의 플라스틱 링 중앙으로 물고기를 옮기고 미세 기울어진 이송 파이펫을 사용하여 가능한 한 과도한 E3를 제거합니다.
    2. 깨끗한 전사 파이펫을 사용하여 42 °C에 보관된 E3의 1.0% 저용융 아가로스(LMA)로 생선을 덮고 플라스틱 링 전체를 아가로즈의 얇은 층으로 채웁니다. 이송 피펫을 사용하여 배아를 파이펫 팁으로 부드럽게 당기고 기포를 도입하지 않고 아가로오스로 다시 당깁니다.
    3. 아가로스가 굳어지기 전에 배아 조작기를 사용하여 물고기를 적절하게 배향하십시오. 수직 현미경으로 화상 진찰하는 경우에, 가능한 한 아가로스의 상부 표면에 가깝게 태아를 놓습니다. 배아를 이미징 챔버의 바닥에 평행하게 꼬리를 똑바로 놓습니다.
      참고: 뒤뇌 화상 진찰을 위해, 태아는 등대 또는 시상 보기에서 위치될 수 있습니다. 아가로즈가 여전히 액체인 동안 배아의 머리가 가라앉지 않도록주의해야합니다. 그밖 방향은 화상 진찰을 위한 그밖 발전 조직을 표적으로 하기 위하여 적당의 적정할지도 모릅니다. 반전된 현미경의 경우, 장착은 다르게 수행되며, 일반적으로 유리 바닥페트리 접시의 바닥에 물고기를 배치합니다.
  5. 아가로즈가 굳어질 때까지 기다린 다음 이미징 챔버를 E3로 채웁니다. 이미징 과정에서 증발을 고려하기 위해 가능한 한 많은 E3을 추가하십시오.

5. 제브라피쉬 힌드브레인 개발의 시간 경과 공초점 이미징

  1. 화상 진찰을 위한 준비에 있는 공초점 현미경에 화상 진찰 실을 놓습니다.
    1. 공초점 현미경에 물고기와 E3를 가진 화상 진찰실을 놓습니다.
    2. 20배 수몰입 목표(1.0 NA)와 같이 높은 수치 조리개와 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택합니다.
    3. 관심 있는 셀 유형의 적절한 조밀하고 밝은 라벨이 있는 영역을 찾습니다.
      참고: 현미경에 온도 제어 단계/장치는 또한 긴 화상 진찰 세션 도중 온도 및 습도를 통제하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이것은 증발을 감소시킬 수 있습니다.
  2. Brainbow 이미징을 위한 수집 매개변수를 설정합니다.
    1. 각 FP 채널을 순차적으로 이미지화합니다. 상용 소프트웨어(예: Zen 소프트웨어)를 사용하는 경우 세 개의 "트랙"을 준비하여 수행됩니다. 아르곤 레이저를 사용하여 458 nm에서 CFP를, YFP는 514 nm에서 흥분시킵니다. DPSS 561 nm 레이저를 사용하여 토마토를 자극하십시오. CFP의 경우 463-509 nm, YFP의 경우 519-555 nm, dTomato의 경우 566-691 nm 사이의 배출량을 수집합니다.
    2. 화면 표시의 경우 CFP를 파란색으로, YFP를 노란색으로, dTomato를 빨간색으로 코딩합니다.
      참고: 이러한 설정은 공초점 현미경에서 사용할 수 있는 레이저 라인 및 기타 기능에 따라 달라집니다. 이미징 속도를 높이기 위해 CFP 및 dTomato 채널을 현저한 블리드스루 없이 동시에 이미지화할 수 있습니다. 원홍색 FP와 같은 별도의 FP도 이미지화되는 경우 YFP와 순차적으로 또는 동시에 이미지화할 수 있습니다.
    3. 최소 1024 x 1024의 해상도와 평균 2회 평균으로 16비트 이미지를 촬영하도록 일반 이미징 매개 변수를 설정합니다. 관심 영역 및 셀 유형에 따라 줌을 조정합니다(즉, 20배 객관적인 뒷뇌 이미징의 경우 줌 범위가 1.0-2.5). 시간이 지남에 따라 물고기의 성장을 허용하기 위해 시야를 최대화합니다.
    4. 한 번에 하나의 트랙을 보고(그리고 광표백을 방지하기 위해 다른 레이저를 끄고), 각 FP의 수집 설정을 개별적으로 최적화합니다(예: 레이저 파워, 핀홀 크기, 광증선튜브 게인 등).
    5. 이미지에 대한 Z 스택 범위를 선택합니다.
      참고: 긴 이미징 세션(>2 h)의 경우, 물고기가 이미징 과정 내내 계속 성장할 것이라는 점을 고려하여 XY 필드와 Z 스택 범위 모두 여분의 공간을 가지고 이를 고려해야 합니다. 뒷뇌를 이미징하는 경우, 이미징 기간 동안 조직이 장밋빛으로 이동하는 필드에 공간을 포함합니다. Z 차원의 성장을 위해 공간도 포함되어야 합니다. 물고기가 시상 또는 등쪽 보기에 위치하는지 여부에 관계없이 관심 영역 위의 약 10-20 μm 의 이미지에 포함합니다.
  3. 타임랩스 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다.
    1. 시간 간격을 선택합니다. 간격 길이 사이 범위 10-30 개발 뒷뇌에서 유사 분열과 apoptotic 이벤트를 추적 하는 분. 간격 길이는 관심 있는 이벤트의 속도와 단일 Z 스택을 캡처하는 데 걸리는 총 시간에 따라 달라집니다.
    2. 이미징 세션의 길이를 선택합니다. 시간 경과 화상 진찰 세션은 일반적으로 밤새 생기고 적어도 16 시간 지속될 수 있습니다.
  4. 실험을 실행합니다.
    참고 :
    물고기는 이미징 직후 안락사하거나 주사기를 사용하여 아가로스에서 조심스럽게 해부하고 회복을 위해 E3로 돌아갈 수 있습니다. 복구 된 물고기는 나중에 다시 이미지 할 수 있지만, 세포 위치와 깊이는 전반적인 성장으로 인해이 기간 동안 이동합니다.

6. 타임랩스 파일 관리

  1. 이미지 파일을 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
    1. Zen 소프트웨어를 사용하는 경우 이미지 수집이 완료되면 파일을 .czi 형식으로 저장합니다. 피지42 및/또는 기타 소프트웨어와 호환되는 형식으로 원시 데이터를 저장해야 합니다.
    2. BioFormats 가져오기를 사용하여 피지 소프트웨어로 가져옵니다.
      참고: 시간 경과 파일은 크고 분석을 위해 열려는 데 상당한 시간과 메모리가 필요할 수 있습니다. 따라서, 그들이 저장하고 열수있는 방법에 전략적도움이된다. 눈으로 관심 있는 이벤트를 검색하기 위해 더 쉽게 열 수 있는 낮은 품질의 버전을 저장하는 것이 유용할 수 있습니다.
  2. 피지를 사용하는 경우 시간 경과 파일의 더 작고 관리하기 쉬운 하위 집합을 만듭니다. 이미지| 클릭을 클릭하여 시간별(예: 첫 번째 시점에서 전체 Z 스택 보기) 또는 깊이(예: 각 시점에서 처음 50개의 Z-섹션을 보는 것)별로 하위 집합을 생성합니다. 스택| 도구| 서브 스택을 확인합니다.

7. 무지개 이미지의 정량적 클로날 색상 분석

  1. 피지에서 관심 있는 셀에 대 한 평균 빨강, 녹색 및 파랑 (RGB) 강도 값을 측정 합니다.
    참고:
    이 지침은 피지의 이미지 분석에만 해당됩니다. 그러나 연구원은 대체 소프트웨어 프로그램에서 평균 RGB 강도 값을 얻는 것을 선호할 수 있습니다.
    1. 이미지 가장자리 주위에 검은 색 공간이 없도록 파일이 올바르게 자른지 확인합니다. 블랙 스페이스는 분석에 필요한 최소 강도 측정값을 인위적으로 낮춥습니다. 파일을 잘라야 하는 경우 사각형 선택 단추를 선택하고 모든 검은색 공간을 제외한 시야 주변에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이미지를클릭 | 자르기.
    2. 측정 도구가 평균, 최소 값 및 최대 회색 값 측정을 수행하도록 설정합니다. 분석 |클릭 측정값을 설정합니다. 최소 및 최대 회색 값및 평균 회색 값에 대한 확인란이 모두 선택되어 있는지 확인합니다.
    3. 피지에서 원시 데이터 파일 또는 하위 Z 스택을 보고 클론 색상 분석에 대 한 관심 있는 셀을 찾을 수 있습니다. 뒷뇌에서, 가설 클론은 시각적으로 자신의 공유 색조뿐만 아니라 방사형 방향에 의해 식별 될 수있다. 다른 색상의 인접 셀과 밀접한 접촉이 있어 해결하기 어려운 셀을 선택하지 마십시오. 색조를 정량화하는 것이 어려울 수 있습니다.
    4. Z 스크롤 막대를사용하여 관심 셀의 중심 Z 평면을 찾습니다. 타원형 선택 버튼을 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 타원형 선택 단추를선택합니다. 다른 선택 도구는 다른 셀 유형에 적합합니다. 세포체의 중앙 ~2/3 주위에 타원형 ROI를 그립니다.
    5. C-스크롤 막대를사용하여 빨간색(dTomato) 채널을 선택합니다. 분석| 선택하여 이 채널의 평균 강도 측정 측정. 녹색(YFP) 및 파란색(CFP) 채널에 대해 동일한 ROI 및 초점 평면으로 반복하고 모든 평균 강도 값을 저장합니다.
    6. 이미지의 아무 곳이나 클릭하여 관심 있는 셀의 타원형 ROI를 제거합니다.
    7. 정규화를 위해 배경 수준을 측정하려면 C-스크롤 막대를 사용하고 빨간색(dTomato) 채널을 선택합니다. 분석| 을 선택하여 이 채널의 전체 필드에 대한 최소 강도 측정을 수행합니다. 측정. 녹색(YFP) 및 파란색(CFP) 채널에 대해 동일한 초점 평면으로 반복하고 모든 최소 강도 값을 저장합니다.
  2. 관심 셀에 대한 상대 RGB 채널 가중치를 계산합니다.
    참고 :
    이러한 강도 값에서 상대 RGB 채널 가중치의 계산은 마이크로 소프트 엑셀 또는 R43과같은 다양한 소프트웨어 프로그램에서 수행 할 수 있습니다.
    1. 해당 채널 및 초점 평면의 전체 필드에서 최소 강도를 빼서 각 채널에 대한 셀 ROI의 평균 강도 측정을 정규화합니다.
    2. 각 채널의 정규화된 평균 RGB 강도 값을 합산하여 셀의 총 정규화된 RGB 강도를 찾습니다.
    3. 해당 채널의 정규화된 평균 강도 값을 정규화된 RGB 강도로 나누어 각 채널의 상대 채널 중량을 계산합니다.
  3. R43,,44에대한 삼차 패키지를 사용하여 상대 RGB 채널 가중치를 삼차 플롯으로 표시합니다. 삼차 플롯은 3D RGB 공간에서 유사한 색상의 군집을 시각화하는 데 유용합니다.
  4. 셀 색상 간의 차이를 정량화하기 위해 색상 분산 계수를 계산합니다.
    1. 다음 방정식을 사용하여 3D RGB 공간의 두 색상 사이의 유클리드 거리를 계산합니다.
      Equation 1
      여기서 R, G 및 B는 7.2에서 계산된 상대 RGB 채널 가중치입니다.
    2. 이해하기 쉽도록 색상 간 가능한 최대 거리인 √2로 나누어 색상 거리를 정규화하여 0과 1 사이의 색상 분산 계수를 얻으려면 0과 1 사이에 색상 분산 계수를 얻었으며, 여기서 0은 정확히 동일한 색상을 나타내고 1은 완전히 다른 색상을 나타냅니다(예: 순수한 빨간색과 순수한 파란색).

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Representative Results

이 섹션은 여기서 설명된 생체 내 다색 타임랩스 이미징 접근법을 사용하여 얻을 수 있는 결과의 예를 예시한다. 우리는 개발 제브라피쉬 뒷뇌의 증식성 심실 영역에서 세포의 Brainbow 색코딩클론이 14 (도 1)임을보여준다.

전형적으로, Brainbow 표지된 세포가 특정 방사형 섬유를 따라 배열되었을 때, 그들은 상대적인 RGB 채널 가중치로 정량화될 수 있는 동일한색상(도 1D)을공유했다(도1E). 이것은 이 방사형 단이 분할 세포의 클론이고 그들의 유사한 색깔이 제브라피시, 마우스 및 병아리14,,15에있는 이전 연구 결과에서 관찰된 것과 같이 클로나 관련되는 것으로 그(것)들을 확인하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 건의합니다. Brainbow 라벨링 밀도가 상대적으로 희박할 때, 이 색 코딩은 살아있는 척추동물 뇌의 증식 영역 내에서 많은 뚜렷한 방사형 클론을 명확하게 시각화하고 추적하는 데 사용될 수 있습니다.

정량적 색 분석은 딸 세포가 어머니(전구) 세포와 동일한 색상을 발현하는 것으로 나타났지만(도1F),인접한 방사형 세포 군집은 서로 구별될 수있음(도 1E). Figure 1E 이것은 관련 세포의 수많은 클론이 생체 내에서 몇 시간 동안 동시에 수행 될 수 있음을 의미합니다(그림 2),멀티 플렉스 계보 분석 및 비교를 허용. 2 dpf에서 클론에서 색 발현의 정량화 후 다시 3 dpf(도 2A-B)에서Brainbow 발현도 생체 내 2-3 일에서 상대적으로 일정하게 유지된 것으로 나타났다11. 따라서 개별 셀은 개발 도중 상대적으로 긴 기간 동안 실시간으로 확인되고 추적될 수 있습니다.

시간 경과 화상 진찰은 세포 주기의 허용 연구 결과, 1-2 dpf(그림 2CF)11에서기간 도중 운동핵 이동 및 세포 분열을 겪고 있는 수많은 세포를 밝혔습니다. 30 분의 시간 경과 간격을 사용하여, 우리는 항상 세포 분열 동안 유사분열 그림을 캡처하지 않았다. 이것은 세포 분열의 할당된 시간에 최대 30 분의 잠재적인 오류를 소개했습니다. 추가적으로, 우리는 2개의 전구 세포를 포함하는 것처럼 보이는 몇몇 클론을 관찰했습니다 (예를 들어, 도 2F). 이러한 제약 조건 내에서 셀 사이클의 길이를 측정할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 개별 Brainbow 표지 된 전구를 추적하여 우리는 제브라피시1,,45,,46의이전 측정에 비해 8.4 ± 1.5 h의 평균 세포 주기를 계산했습니다. 더욱이, Brainbow 타임랩스 이미징 기술을 사용하여, 우리는 또한 세포사멸과 관련된 정형화된 형태학적 변화를 겪고 있는 개별 세포를 관찰할 수있었다(도 3)11,예를 들어 막 블리핑 및 세포 단편화47,,48.

Figure 1
그림 1: 개발 제브라피쉬 뒷뇌에서 세포를 분할하는 클론 관련 클러스터를 표지한 Brainbow. (A)hsp의 회로도 :얼룩말 (무지개) DNA는 일시적으로 컬러 코드 클론에 표현. (B)생체 내에서 1 및 2 dpf에서 제브라피시 개발의 광 이미지를 전송; 화살표는 이미징을 대상으로 하는 일반적인 뒷뇌 영역을 나타냅니다. 배아의 반투명성은 각 물고기 아래에 배치 된 마이크로 미터에 의해 입증된다. 1 세포 단계에서 주사를 보여주는 실험 타임 라인, 열 충격 (HS) 24 hpf에서, 그리고 1-3 dpf에서 이미징. (C)29 hpf 제브라피쉬 뒷뇌의 등도뷰는 레인보우로 표시되어 있다. 투과된 광 채널은 165 μm를 나타내는 Brainbow 표지 클론의 최대 강도 투영과 중첩된 뒷뇌 및 심실의 형태를 보여주었다. 로스트랄이 올라와 있습니다. (D)뒷뇌에서 의 생체 내 무지개 발현, 희소하게 표기된 51 hpf 제브라피쉬(D1)에서 41 μm을 나타내는 최대 강도 투영액으로 나타났으며, 63.5 hpf 제브라피쉬(D2)에서 81 μm을 표시하였다.D1D2 두 패널 에서 등도가 위로 올라가고 로스트랄은 왼쪽에 있습니다. (e)D1D2의 셀의 색은 상응하는 삼차 플롯에서 상대 채널 가중치로 정량화하였다(n= 54 셀E1;461 셀E2). (F)세포 분열 다음 딸 세포에서 세포 색은 상대적으로 일정하게 유지되었다. 29 hpf Brainbow 라벨 제브라피쉬의 뒷뇌에서 생체 내 유사체 이벤트를 보여주는 일련의 시간 포인트는 1 시간(F1,최대 강도 프로젝션, 30 μm 깊이)을 초과합니다. F1의 블랙박스로 표시된 어머니와 딸 세포의 색상은 FF2의삼차 플롯에서 상대 채널 가중치로 표현된다.1 인세트는 단단히 클러스터된 셀 색상을 표시하기 위해 동일한 플롯의 확대/축소를 표시합니다(M은 어머니입니다. D1과 D2는 30 분 / 사각형, 60 분 / 삼각형의 딸입니다. 스케일 바 = 30 μm (C), 20 μm (D1),16 μm (D2),및 5 μm (F1). C, D 및 F에서 dTomato는 빨간색으로 코딩되고 YFP는 녹색으로 코딩되고 CFP는 파란색으로 코딩됩니다. 브록웨이 등의 허가를 받아 재인쇄된 이미지11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Brainbow 컬러 코딩과 결합된 생체 내 시간 경과는 운동간 핵 이동 및 분할을 겪고 있는 세포의 여러 이웃 클론을 구별했습니다. (A)2 dpf (55 hpf)에서 무지개를 표현하는 한 물고기의 뒷뇌에 표시된 색으로 구분된 방사형 클러스터; A1)및 3 dpf(71 hpf; A2); 각각 62 μm와 47 μm을 나타내는 최대 강도 투영. 세 개의 색상으로 구분된 방사형 클러스터는 각 시점에서 화살촉으로 식별됩니다. (b)A1A2의 모든 Brainbow 표지 된 셀의 색상은 B1 및 B2의 해당 삼차 플롯에서 상대 채널 가중치로 정량화되었습니다 (n = 106 셀, 119 셀). (C)35 hpf에서 제브라피쉬 뒷뇌 (24 μm를 보여주는 최대 강도 프로젝션); 파선 흰색 상자로 표시된 인세트는 C에서 뒷뇌에서 30 분 간격으로 찍은 시간 포인트의 D.(D)시리즈에 표시되는 첫 번째 시간 포인트입니다. >9.5h의 마침표가 표시됩니다. 표지된 세포는 운동간 핵 이동을 겪었다; 흰색 화살표촉은 정점 표면에 셀을 나타냅니다. 정점 표면에서 세포 소종의 반올림 및 클론 수의 상응하는 증가(예를 들어, 5.5 시간 및 그 후 8시간)에서 의 적혈구는 유사분열 사건으로 간주되었다. (E)30.5 hpf의 제브라피쉬 뒷뇌의 등쪽 뷰는 Brainbow로 표시되어 있으며, 여기서 흰색 파선 및 점선은 머리의 대략적인 경계를 나타내고, 흰색 파선 상자는 F의 첫 번째 시점에서 나타난 인세트를나타낸다. 1.5 h의 기간 동안, 백색 화살촉에 의해 표시된 2개의 청색 세포는 정점 표면으로 이동하고 2개의 전구 세포를 포함하는 클론을 건의하는 mitosis를 겪고 관찰될 수 있었습니다. 배율 막대 = 20 μm (A), 25 μm (C) 및 20 μm (F). A-D에서는 등도가 올라가고 로스트랄은 왼쪽에 있습니다. E와 F에서 로스트랄은 왼쪽에 있습니다. 모든 이미지에서 dTomato는 빨간색으로 코딩되고 YFP는 녹색으로 코딩되고 CFP는 파란색으로 코딩됩니다. 브록웨이 등의 허가를 받아 재인쇄된 이미지11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 타임랩스 무지개 이미징은 생체 내에서 세포 사멸을 겪는 심실 영역의 세포를 나타낸다. (A)31 hpf의 제브라피쉬 뒷뇌에 무지개(최대 강도 투영은 36 μm를 나타임). 흰색 파선 상자는 B.(B)30분 간격으로 A에서 뒷뇌를 나타내는 일련의 시간 포인트의 첫 번째 타임 포인트에 표시된 인세트를 나타냅니다. 첫 번째 패널의 흰색 화살촉은 후속 패널에서 와 같이 세포 사멸을 겪은 라벤더 세포를 보여주고, 세포 단편화로 표시된 다음 세포 자멸 체의 점진적인 클리어런스를 보여줍니다. 이웃 표지된 세포는 전반적으로 건강하게 나타났습니다. 등살은 위로, 로스트랄은 왼쪽에 있습니다. 배율 막대 = 20 μm (B). 모든 이미지에서 dTomato는 빨간색으로 코딩되고 YFP는 녹색으로 코딩되고 CFP는 파란색으로 코딩됩니다. 브록웨이 등의 허가를 받아 재인쇄된 이미지11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 발달하는 제브라피쉬 뒷뇌에서 전구 세포 및 뉴런의 클론을 시각화하고 이를 뇌무지개 및 타임랩스 공초점 현미경 검사법11을사용하여 생체 내에서 따르는 방법을 설명한다. 생체외 또는 생체외 연구에 비해 이 프로토콜의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 자연 적인 milieu에서 척추 동물 뇌의 증식 영역을 직접 관찰 하는 기능. 이 기술은 retroviral 벡터를 사용하여 단일 복제본에 레이블을 붙인 이전 연구를 기반으로 합니다. 대조적으로, hsp:Zebrabow의 사용은 동시에 많은 클론을 컬러 코드를 구성, 멀티 플렉스 계보 추적및 클론 중 역학에 초점을 허용11. 이 프로토콜은 다른 시스템 또는 세포 유형의 개발에 초점을 맞추기 위해 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 무지개 구조는 제브라피시 배아에서 발현될 수 있다. hsp:Zebrabow에서 제브라피쉬 hsphsp70 프로모터를 사용하면 신경 전구체 및뉴런(11)을포함한 열 쇼크 에 따른 다양한 세포 유형의 모자이크 라벨링을 초래하고, 연구자들에게 유전자발현(29)을시간적 제어를 제공한다. 열 충격 프로모터의 사용은 지속적으로 색상 코드 클론을 라벨, 다른 프로모터는 명확하게 이러한 방식으로 세포 계보를 묘사하지 않을 수 있지만. 클론 정체성이 관심 요인이 아닌 경우, 다른 프로모터를 활용한 구성은 특정 세포 유형에 라벨을 붙이는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, neuroD 프로모터는 미성숙한뉴런(18,,49)에라벨을 붙이도록 사용될 수 있다. 또한, 미세 주사를 수행하는 대신, 연구원은 Tg (유비 : Zebrabow)15 및 Tg (신경 : 얼룩말)18과같은 라인을 포함하여 형질 전환 된 무지개 얼룩말피시를 활용하도록 선택할 수 있습니다. 이 경우, Tg(hsp:Crea134)와)같은 Cre 재조합아제(15)를 발현하는 라인으로 교차하여, 유사한 방식으로 수집 및 유지되는 주입되지 않은 배아를 생성한다.15 이 프로토콜은 1-3 dpf 사이의 물고기를 이미지화하도록 설계되었지만, 발달 신경 발생의 주요기간(50)과일치하기 위해, 제브라피쉬는 관심의 발달 단계에 따라 더 이상 유지될 수 있다. 그러나, 24 hpf 이전에 Brainbow 발현을 유도하는 열 쇼크는배아(51)에더 해로울 수 있다. 관심있는 연령 및 조직에 따라, 다른 장착 전략은 표적 조직을 올바르게 지향하는 것이 적절할 것이다.

특히 프로토콜을 수정하는 경우 문제 해결이 필요할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 배아당 전달되는 DNA, 볼루스 크기 및 총 DNA의 농도는 Brainbow 발현이 희미하거나 희소하거나 배아가 건강하지 않은 경우 모두 조정될 수 있습니다. 또한, 원하는 발현이 이루어지지 않으면 열 충격 단계의 길이 및 타이밍이 변경될 수 있다. 이미징에 사용되는 수집 파라미터는 사용 가능한 레이저 라인및 필터뿐만 아니라 원하는 표현, 장착 및 분석 유형에 따라 달라집니다. 또한 시간 경과 매개 변수는 관심 이벤트의 속도와 단일 Z 스택을 획득하는 데 필요한 시간에 따라 조정되어야 합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 아가로즈에 물고기를 적절하게 장착하는 것입니다 : 물고기의 각도가 부적절하거나 물고기가 너무 많은 아가로로 덮여있는 경우 최적의 이미징이 불가능합니다. 이 기술을 최적화하는 데는 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다. 또한 공초점 현미경 자체에서 FP 발현을 보기 전에 장착이 적절한지 여부를 확인하기 어려울 수 있으므로 이미징 전에 여러 물고기를 장착하는 것이 유용한 경우가 많습니다. 추가중요한 단계는 이미지화할 특정 물고기의 선별 및 선택입니다. 미세 주사를 수행하는 경우, 밝기, 라벨 밀도, 및 무지개 복사 수는 모두 물고기에 따라 크게 다를 수 있습니다. 희미한 라벨, 지나치게 조밀한 라벨링 또는 적은 복사 번호로 인해 색상이 적은 물고기에서 촬영한 이미지는 분석하기가 더 어려울 수 있습니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 살아있는 제브라피시를 최대 16 시간11까지지속적으로 이미지 화 할 수있었습니다. 이 시간의 길이는 화상 진찰 실에서 E3 증발, 화상 진찰의 평면에서 물고기의 성장, 물고기의 죽음 또는 운동, 또는 공초점 현미경 시간에 사용자 구속에 의해 제한될 수 있습니다. 증발은 현미경 단계에서 온도 제어 액세서리를 사용하여 감소 될 수있다. 이 방법을 사용하여 생성된 5D 데이터 집합은 상당한 하드 드라이브 공간(예: 하룻밤 시간 경과에 대해 최대 ~100GB)과 분석할 적절한 컴퓨팅 성능이 필요한 대용량 파일인 경향이 있습니다.

이 프로토콜은 개발 얼룩말 뇌에서 신경 선조와 딸 뉴런의 인구 내에서 색으로 구분 된 클론을 시각화하고 시간이 지남에 따라 자신의 역학을 추적하는 연구원을 안내합니다. 한 가지 가능한 확장은 개발18에서특정 유전자의 역할을 평가하기 위해 원적 FP 태깅과 Brainbow 시간 경과 이미징의 조합입니다. 이런 식으로, 조작된 유전자를 표현하는 클론은 명백한 색깔에서 구상되고, 시간이 지남에 따라 추적되고, Brainbow 표지되고, 조작되지 않은 이웃 클론과 비교될 수 있습니다. 생체 내 다색 이미징은 신경계가 어떻게 형성되고 기능하는지에 대한 중요한 기계론적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

Y. A. Pan, J. Livet 및 Z. Tobias에게 기술적, 지적 공헌에 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (상 1553764)와 M.J. 머독 자선 신탁에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip) Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

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References

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