Visualisere den udviklende hjerne i levende zebrafisk ved hjælp af Brainbow og Time-lapse Konfokal Imaging

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In vivo imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at undersøge de cellulære mekanismer underliggende nervesystem udvikling. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler i realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Udvikling af hvirveldyr nervesystemet kræver en præcis koordinering af komplekse cellulære adfærd og interaktioner. Brugen af in vivobilledteknikker med høj opløsning kan give et klart vindue ind i disse processer i den levende organisme. For eksempel kan dividere celler og deres afkom følges i realtid som nervesystemet former. I de seneste år har tekniske fremskridt inden for flerfarvede teknikker udvidet de typer af spørgsmål, der kan undersøges. Den flerfarvede Brainbow tilgang kan bruges til ikke kun at skelne mellem lignende celler, men også til farvekode flere forskellige kloner af relaterede celler, der hver stammer fra en progenitor celle. Dette giver mulighed for en multiplex afstamning analyse af mange forskellige kloner og deres adfærd samtidig under udviklingen. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler over realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem. Dette er især nyttigt til at følge cellulære interaktioner mellem lignende celler, som er vanskelige at mærke differentieret ved hjælp af traditionelle promotor-drevne farver. Vores tilgang kan bruges til sporing afstamning relationer mellem flere forskellige kloner samtidigt. De store datasæt, der genereres ved hjælp af denne teknik, giver omfattende oplysninger, der kan sammenlignes kvantitativt på tværs af genetiske eller farmakologiske manipulationer. I sidste ende de genererede resultater kan bidrage til at besvare systematiske spørgsmål om, hvordan nervesystemet udvikler sig.

Introduction

I de tidlige faser af udviklingen, puljer af specialiserede sogenitor celler deler gentagne gange i proliferativ zoner, der producerer forskellige arrays af datter celler. Cellerne født i denne udviklingsperiode vil derefter differentiere og rejse til at danne de spirende organer. I nervesystemet, progenitors såsom radial glia give anledning til umodne neuroner i ventrikulære zoner. Som neuroner migrere væk fra hjertekamrene og modne, den ekspanderende væv i sidste ende danner meget komplekse strukturer i hjernen1,2,,3,4,5,6. Koordineringen mellem opdeling af sformere og differentiering og migration af neuroner vil bestemme den endelige størrelse, form, og dermed funktion af hjernen, direkte påvirker adfærd7,8,9,10. Mens stram kontrol over disse processer er klart afgørende for normal hjerneudvikling, de globale mekanismer, der regulerer disse dynamikker er ikke godt forstået. Her beskriver vi et værktøj til at studere nervesystemet udvikling på en cellulær opløsning, så forskerne til at visualisere stamcelleceller og neuroner in vivo i udviklingslandene zebrafisk hjernen med Brainbow og spore deres adfærd over tid via time-lapse konfokal mikroskopi11. Tilgangen kan også tilpasses til at visualisere andre dele af det udviklende embryo.

At observere og skelne mellem celler i den udviklende zebrafisk hjerne, har vi tilpasset Brainbow celle-mærkning teknik11. Brainbow udnytter tilfældigt bestemt, kombinatorisk udtryk af tre forskellige fluorescerende proteiner (FPs) til at mærke en population af celler. Mens standardudtrykket for Brainbow-ekspression er den røde FP dTomato, resulterer rekombination af enzymet Cre recombinase i udtryk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den samlede mængde af hver FP udtrykt i en celle giver det en unik nuance, så klar visuel skelnen fra tilstødende celler. Derudover, når en stamcelle deler sig, vil hver dattercelle arve farven fra sin modercelle, der producerer farvekodede kloner og giver forskerne mulighed for at spore celleafstamning11,14. Mens oprindeligt bruges til at analysere neuronal kredsløb i mus12, Brainbow er siden blevet udtrykt i en bred vifte af model organismer, herunder zebrafisk15.

Vores teknik bygger på tidligere flerfarvede mærknings- og billedbehandlingsmetoder til direkte at afbilde flere farvekodede kloner over tid i levende zebrafisk. På grund af deres optiske gennemsigtighed som embryoner er zebrafisk velegnede til billeddiagnostiske eksperimenter16, og tidligere undersøgelser har udnyttet Brainbow i zebrafisk til at studere en række væv, herunder nervesystemet11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til direkte billede i den levende organisme, sammen med deres hurtige ex utero udvikling, gør zebrafisk en værdifuld model for hvirveldyr udvikling. I modsætning til pattedyr hjernen, hele spredningzone zebrafisk baghjernen er let tilgængelige for billeddannelse uden afbrydelse af dens endogene miljø6. Dette gør det muligt at udføre forsøg i den levende organisme i stedet for i in vitro- eller faste vævspræparater. I modsætning til faste billeddiagnostiske eksperimenter giver in vivo-undersøgelser mulighed for et langsgående design, der producerer timevis af data, der kan analyseres for mønstre, hvilket øger sandsynligheden for at observere relativt sjældne hændelser. Afhængigt af hastigheden og længden af de begivenheder af interesse, kan forskerne vælge at udføre korte (1-2 h) eller lang (op til ~ 16 h) time-lapse billeddannelse eksperimenter. Ved at bruge zebrafisk varmechok promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow udtryk kan være tidsmæssigt kontrolleret28,29. Derudover mosaik udtryk induceret af denne promotor er velegnet til mærkning og sporing mange kloner11.

Evnen til visuelt at identificere flere kloner i den levende hjerne er en fordel ved denne metode. Vigtige tidligere undersøgelser, der undersøgte den rolle, kloner inden for udvikling af nervesystemet udnyttet retrovirale vektorer til at mærke en enkelt progenitor celle og dens afkom ved hjælp af en enkelt FP eller andre let visualiseret protein. En sådan mærkning gør det muligt for forskere at observere en enkelt klon over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I modsætning til metoder til at spore adfærd celler inden for en klon, de forskellige farver Brainbow giver forskerne mulighed for at observere dynamik blandt kloner. Derudover, ved hjælp af Brainbow at mærke mange kloner i hjernen, yderligere data om klonale adfærd indsamles i forhold til teknikker, der etiketten en enkelt klon11. Det er vigtigt, at de metoder, der er beskrevet her, kan udvides til at generere udviklingssammenligninger mellem fisk, der har gennemgået forskellige genetiske eller farmakologiske manipulationer18. Samlet set disse fordele gør time-lapse i vivo konfokale billeddannelse af Brainbow-udtrykke zebrafisk ideel til forskere udforske udviklingen af hvirveldyr nervesystem, især dem interesseret i den rolle, kloner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurer, der involverer dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Lewis & Clark College.

1. Mikroinjektion af zebrafiskembryoner

  1. Opsæt vilde type, voksne zebrafisk i kønsopdeltparring tanke om eftermiddagen før udførelse af mikroinjektioner39,40.
  2. Klargør DNA-opløsningen om morgenen for mikroinjektionerne. Fortyndes hsp:Zebrabow11 plasmid DNA til en koncentration på ~10 ng/μL i 0,1 mM KCl, sammen med 2,5% fenolrød og 3.75U Cre recombinase enzym.
  3. Udfør mikroinjektioner af DNA-opløsning i zebrafiskembryoner med én celle inden for 45 minutter efter befrugtning39,41. Injicer ca. 4,2 nL af denne opløsning i hvert embryon, svarende til ~42 pg plasmid DNA.
    BEMÆRK: Mikroinjektionstrinnet kan udelades, hvis en transgen, Brainbow-ekspreseksengørende zebrafisklinje parres i stedet, såsom Tg(ubi:Zebrabow)15 og Tg (neurod:Zebrabow)18. Udførelse af mikroinjektioner kan være en fordel, fordi det giver forskerne mulighed for at titrere kopinummer og mærkning tæthed. Desuden kan en anden DNA-konstruktion, der mærker eller manipulerer et bestemt genprodukt, injiceres sammen med Brainbow, hvis det ønskes (f.eks. et langt rødt fluorescerende protein, der supplerer Brainbow18).
  4. Indsprøjtede embryoner i petriskåle af E3-medium39 opbevares i en 28 °C-inkubator i 24 timer.

2. Varmechok at fremkalde Brainbow Expression

BEMÆRK: Hvis plasmid-DNA-indsprøjtet eller transgene udtrykt ikke udnytter hsp70-promotoren til at drive udtrykket, kan varmechoktrinnet springes over, og sunde embryoner skal straks overføres til phenylthiourea (PTU) ved 24 h efter befrugtning (hpf).

  1. Ved 24 hpf, frasortering døde og deforme embryoner fra gruppen af injicerede embryoner. Derefter overføres de sunde embryoner til et 50 ml rør med op til 20 embryoner/rør.
  2. Fyld rørene med 10 ml E3. Placer en hætte oven på hvert rør, men luk ikke tæt.
  3. Rørholderen, der indeholder 50 ml rørene, anbringes oprejst i et 37 °C vandbad. Sørg for, at vandstanden i badet er højere end niveauet af E3 i rørene og lad dem stå i 80 til 90 min.
  4. Rørristen fjernes med embryonerne fra vandbadet, og vend tilbage til 28 °C-inkubatoren oprejst. Lad E3 køle af med op til 1 time, og embryonerne skal gradvist akklimatisere sig til temperaturen. Derefter overføres embryonerne til petriskåle på 0,2 mM PTU i E3 opvarmet i rugemaskinen for at forhindre pigmentering af embryoner.
    FORSIGTIG: PTU er et giftigt kemikalie, der skal håndteres med forsigtighed og bortskaffes korrekt. Iført handsker er foreslået.

3. Screening Embryoner for Brainbow Expression

  1. Ved 2 til 4 timer efter varmechok, undersøge embryoner under en standard fluorescens dissektion mikroskop til udtryk for CFP eller YFP, hvilket indikerer vellykket Brainbow rekombination (fra standard udtryk for dTomato).
    BEMÆRK: Hvis der findes flere muligheder for fluorescensfilter, er screening for coated finpapir den mest effektive måde at identificere velkombinerede fisk på. Hvis CFP- og YFP-filtre ikke er tilgængelige, kan YFP også visualiseres svagt under grønne fluorescerende proteinfiltre (GFP) på grund af overlapningen i deres spektrale profiler.
  2. Vælg embryoner med robust FP udtryk hele vejen igennem og overfør til en separat skål med PTU. Billedembryoner ved 1 dag efter befrugtning (dpf; 28 hkf eller nyere) eller vedligeholde embryoner i PTU og billede ved 2 eller 3 dpf.

4. Montering embryoner til In Vivo Imaging

  1. Før eksperimentets dag skal billeddannende kammer og embryonmanipulationsværktøj forberedes.
    1. Klargør billeddannet ved forsigtigt at superlimere en plastikring til midten af en 60 mm petriskål.
    2. Eventuelt forberede en skræddersyet embryo manipulator til at flytte embryoner i skålen og orientere embryoner, mens montering. Konstruere manipulator ved supergluing en lille længde af nylon fiskesnøre (~ 1 / 2 i, ~ 6 lb) til slutningen af en træ bomuld vatpind stick, der er blevet skåret til en ~ 4 i længden.
  2. Om nødvendigt (dvs. billeddannelse ved 2 dpf eller tidligere), før embryonerne monteres dechorionat ved hjælp af sprøjter under et dissektionsmikroskop.
  3. Bedøve zebrafisk embryoner.
    1. Fyld en 60 mm petriskål halvvejs med E3 og tilsæt 5-6 dråber på 4 mg/ml MS-222 Tricaine-S til en endelig koncentration på ~0,2 mM. Swirl at blande.
      FORSIGTIG: Tricaine skal håndteres med forsigtighed og bortskaffes korrekt.
    2. Fostre ne overføres fra PTU til tricainopløsningen, hvilket sikrer, at så lidt PTU overføres som muligt. Mens fisk reflekser bør ophøre efter 1-2 min, lad embryonerne i tricaine i op til 10 min for at sikre grundig anæstesi for time-lapse billeddannelse eksperimenter.
    3. Bekræft, at embryonerne er korrekt bestøvet. Vurder startlerefleksen ved at røre fosterhalerne forsigtigt med embryomanipulatoren. Hvis en refleks bevægelse er observeret, tilsættes en ekstra dråbe tricain til fadet så langt fra embryoner som muligt og hvirvle at blande. Overhold fosterpulsen under et dissektionsområde. Hvis det er unormalt langsomt, tilsættes yderligere dråber E3 til skålen for at reducere tricainkoncentrationen.
  4. Mount bestøvet embryoner i agarose.
    1. Overfør fisken til midten af plastringen i billeddannet, og fjern så meget overskydende E3 som muligt ved hjælp af en finspidset overførselspipette.
    2. Ved hjælp af en ren overførselspipette dækkes fisken med 1,0% lavsmelteagarose (LMA) i E3, der opbevares ved 42 °C, og fyld hele plastringen med et tyndt lag agarose. Brug en overførselspipette til forsigtigt at trække embryonerne op i pipettespidsen og tilbage i agarose uden at indføre luftbobler.
    3. Før agarose hærder, hurtigt bruge et foster manipulator til at orientere fisken korrekt. Hvis der dannes billeddannelse med et opretstående mikroskop, placeres embryonerne så tæt på agarosens overside som muligt. Placer embryonerne parallelt med bunden af billeddannelsen med halen lige.
      BEMÆRK: Til baghjernebilleddannelse kan embryonerne placeres i et dorsale eller sagittal synspunkt. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at embryonernes hoveder ikke synker, mens agarose stadig er flydende. Andre retningslinjer kan være hensigtsmæssige for at målrette andre væv, der udvikler væv til billeddannelse. For inverterede mikroskoper, ville montering ske anderledes, typisk positionering fisken tæt på bunden af en glasbundet petriskål.
  5. Vent på, at agarose er blevet hærdet, og fyld derefter billeddannende kammer med E3. Tilføj så meget E3 som muligt for at tage højde for fordampningen i løbet af billeddannelse.

5. Time-lapse Konfokal Imaging af udvikling zebrafisk hindbrain

  1. Placer billeddannet på det konfokale mikroskop som forberedelse til billeddannelse.
    1. Placer billeddannet med fisken og E3 på det konfokale mikroskop.
    2. Vælg en målsætning med en høj numerisk blændeåbning og en lang arbejdsafstand, f.eks.
    3. Find et område med en passende tæt og lys mærkning af den eller de celletyper, der er interessante.
      BEMÆRK: Et temperaturstyret trin/apparat på mikroskopet kan også anvendes til at regulere temperatur og fugtighed under lange billeddannelsessessioner. Dette kan nedsætte fordampningen.
  2. Konfigurer anskaffelsesparametrene for Brainbow imaging.
    1. Billede hver FP-kanal sekventialt. Hvis du bruger en kommerciel software (f.eks Zen software), dette gøres ved at forberede tre "spor". Brug en Argon laser til at ophidse CFP på 458 nm og YFP på 514 nm. Brug en DPSS 561 nm laser til at ophidse dTomato. Indsamle emissioner mellem 463-509 nm for CFP, 519-555 nm for YFP, og 566-691 nm for dTomato.
    2. For skærmvisning, kode CFP som blå, YFP som gul, og dTomato som rød.
      BEMÆRK: Disse indstillinger vil variere afhængigt af, hvilke laserlinjer og andre funktioner der er tilgængelige på det konfokale mikroskop. For at øge hastigheden af billeddannelse, cfp og dTomato kanaler kan afbildes samtidigt uden mærkbar bløder-through. Hvis der også afbildes et separat FP, f.eks.
    3. Konfigurer de generelle billedparametre til at tage 16-bit billeder med en opløsning på mindst 1024 x 1024 og i gennemsnit to gange. Juster zoom afhængigt af det område og celletype af interesse (dvs. for hindbrain imaging med en 20x mål zoom vil variere fra 1,0-2,5). Maksimer synsfeltet for at give mulighed for vækst af fisken over tid.
    4. Visning af et spor ad gangen (og slukke for andre lasere for at forhindre fotoblegning), optimere anskaffelsesinsindene for hver FP individuelt (f.eks. laserkraft, pinhole størrelse, photomultiplier rør gevinst, osv.).
    5. Vælg Z-stakområde til billede.
      BEMÆRK: For lange billeddannelse sessioner (> 2 h), tage hensyn til, at fiskene vil fortsætte med at vokse i løbet af billeddannelse, således både XY feltet og Z-stack rækkevidde bør tage højde for dette med ekstra plads. Hvis billeddannelse hindbrain, omfatter plads i marken for væv til at bevæge sig rostrally i billeddannelse periode. Der skal også medtages plads til vækst i Z-dimensionen. Medtag i billedet ca. 10-20 μm over det pågældende område, uanset om fisken er placeret til sagittal eller dorsalvisning.
  3. Konfigurer parametre for time-lapse-billedbehandling.
    1. Vælg et tidsinterval. Interval længde varierer mellem 10-30 min at spore mitotiske og apoptotiske begivenheder i den udviklende baghjerne. Intervallængden varierer afhængigt af hastigheden af de begivenheder, der er af interesse, og den samlede tid, det tager at fange en enkelt Z-stak.
    2. Vælg længden af billedsessionen. Time-lapse billeddannelse sessioner generelt forekomme natten over og kan vare mindst 16 timer.
  4. Kør eksperimentet.
    BEMÆRK:
    Fiskene kan aflives umiddelbart efter billeddannelse eller omhyggeligt dissekeres fra agarose ved hjælp af sprøjter og returneres til E3 for at komme sig. Genvundet fisk kan derefter afbildes igen på et senere tidspunkt, selvom celle position og dybde vil flytte i denne periode på grund af den samlede vækst.

6. Time-lapse Filhåndtering

  1. Importer billedfilen til analysesoftwaren.
    1. Hvis du bruger Zen-software, skal du gemme filen i .czi-format, når billedanskaffelsen er fuldført. Sørg for at gemme rådata i et format, der er kompatibelt med Fiji42 og/eller anden software.
    2. Importer til Fiji-software ved hjælp af BioFormats Importør.
      BEMÆRK: Time-lapse filer vil være store og kan kræve betydelige mængder af tid og hukommelse til at åbne for analyse. Det er derfor nyttigt at være strategisk i, hvordan de gemmes og åbnes. Det kan være nyttigt at gemme en version af lavere kvalitet, der lettere kan åbnes for at søge efter begivenheder af interesse for øje.
  2. Hvis du bruger Fiji, skal du oprette mindre, mere håndterbare delmængder af time-lapse-filer. Generer undersæt enten efter tid (f.eks. visning af fuld Z-stak ved første tidspunkt) eller efter dybde (f.eks. visning af de første 50 Z-sektioner på hvert tidspunkt) ved at klikke på Billede| Stakke| Værktøj| Lav understak.

7. Kvantitativ klonale farveanalyse af Brainbow Images

  1. Mål de gennemsnitlige røde, grønne og blå (RGB) intensitetsværdier for de celler, der er interessante i Fiji.
    BEMÆRK:
    Disse instruktioner er specifikke for billedanalyse i Fiji. Men, forskere kan foretrække at opnå gennemsnitlige RGB intensitet værdier i et alternativt softwareprogram.
    1. Sørg for, at filen er beskåret korrekt, så der ikke er sort mellemrum omkring billedets kanter. Sort rum vil kunstigt sænke den minimale intensitet målinger er nødvendige for analysen. Hvis filen skal beskæres, skal du vælge knappen Markering af rektangel og tegne et interesseområde (ROI) omkring synsfeltet, bortset fra al sort mellemrum. Klik på Billede| Beskær.
    2. Indstil måleværktøjet til at tage middel-, minimum- og maksimummålinger af gråværdier. Klik på Analysér| Angiv mål. Kontroller, at afkrydsningsfelterne for Min & Max Gray Value og Mean Gray Value begge er markeret.
    3. Visning af rå datafiler eller underetterede Z-stakke i Fiji, finde celler af interesse for klonale farveanalyse. I baghjernen kan formodede kloner visuelt identificeres ved deres fælles nuance samt deres radiale orientering. Marker ikke celler, der er i tæt kontakt med og dermed er vanskelige at løse fra, tilstødende celler af en anden farve. Det kan være svært at kvantificere deres nuance.
    4. Find centrum Z-plan af cellen af interesse ved hjælp af Z-scrollbar. Højreklik på den ovale markeringsknap, og vælg knappen Elliptisk markering. Andre markeringsværktøjer vil være velegnede til forskellige celletyper. Tegn et elliptisk investeringsafkast omkring det centrale ~2/3 af cellekroppen.
    5. Vælg den røde (dTomato)-kanal ved hjælp af C-rullepanelet. Tag den gennemsnitlige intensitetsmåling for denne kanal ved at vælge Analysér| Mål. Gentag med samme ROI og fokusplan for de grønne (YFP) og blå (CFP) kanaler og gem alle middelintensitetsværdier.
    6. Klik et vilkårligt sted på billedet for at fjerne det elliptiske investeringsafkast i den interessante celle.
    7. Hvis du vil måle baggrundsniveauer for normalisering, skal du bruge C-rullepanelet og vælge den røde (dTomato) kanal. Tag minimumintensitetsmålingen for hele feltet i denne kanal ved at vælge Analysér| Mål. Gentag med det samme brændpunktplan for de grønne (YFP) og blå (CFP) kanaler og gem alle minimum intensitetsværdier.
  2. Beregn relative RGB-kanalvægte for de interesseceller.
    BEMÆRK:
    Beregning af relative RGB-kanalvægte fra disse intensitetsværdier kan udføres i43en række forskellige softwareprogrammer, f.eks.
    1. Middelintensitetsmålingen af celle-ROI'et for hver kanal normaliseres ved at trække den minimale intensitet fra hele feltet i den pågældende kanal og det pågældende brændpunktsplan.
    2. Sum de normaliserede gennemsnitlige RGB-intensitetsværdier fra hver kanal for at finde den samlede normaliserede RGB-intensitet for cellen.
    3. Beregn den relative kanalvægt for hver kanal ved at dividere den normaliserede middelintensitetsværdi for den pågældende kanal med den samlede normaliserede RGB-intensitet.
  3. Vis relative RGB-kanalvægte som ternære parceller ved hjælp af den ternære pakke til R43,44. Ternære plots er nyttige til at visualisere klyngedannelse af lignende farver i 3D RGB plads.
  4. Beregn farvespændekoefficienten for at kvantificere forskellen mellem cellefarver.
    1. Beregn den euklidiske afstand mellem de to farver i 3D RGB-plads ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 1
      hvor R, G og B er de relative RGB-kanalvægte beregnet i 7.2.
    2. For at lette forståelsen, normalisere farveafstanden ved at dividere med √2, den maksimale mulige afstand mellem farver, for at opnå en farvespredningskoefficient mellem 0 og 1, hvor 0 angiver nøjagtig den samme farve og 1 angiver helt forskellige farver (f.eks. ren rød og ren blå).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette afsnit illustrerer eksempler på resultater, der kan opnås ved hjælp af in vivo multicolor time-lapse imaging tilgang beskrevet her. Vi viser, at Brainbow farvekodede kloner af celler i den proliferative ventrikelzone af den udviklende zebrafisk baghjernen14 (Figur 1).

Typisk, når Brainbow-mærket celler var arrangeret langs en bestemt radial fiber, de delte den samme farve (Figur 1D), som kunne kvantificeres som den relative RGB kanal vægte (Figur 1E). Dette tyder på, at disse radiale grupper var kloner af dividere celler, og at deres lignende farve kunne bruges til at identificere dem som værende klonalt relateret, som observeret i tidligere undersøgelser i zebrafisk, mus, og kylling14,15. Når Brainbow mærkning tæthed er relativt sparsomme, kan denne farve-kodning bruges til klart at visualisere og spore mange forskellige radiale kloner inden for proliferativregioner i de levende hvirveldyr hjernen.

En kvantitativ farveanalyse viste, at datterceller gav samme farve som deres morcelle (stamcelle) (Figur 1F), men at tilstødende radiale klynger af celler kan skelnes fra hinanden11 (Figur 1E). Det betyder, at mange kloner af beslægtede celler kan følges samtidigt over timer in vivo (Figur 2), hvilket giver mulighed for en multiplex afstamning analyse og sammenligning. Kvantificering af farveudtryk i kloner ved 2 dpf og derefter igen ved 3 dpf (Figur 2A-B) viste , at Brainbow-udtrykket også forblev relativt konstant fra 2-3 dage i vivo11. Individuelle celler kan således identificeres og spores i realtid i relativt lange perioder under udviklingen.

Time-lapse-billeddannelse afslørede mange celler, der gennemgik interkinetisk nuklear migration og celledeling i perioden fra 1-2 dpf (figur 2CF)11, hvilket gjorde det muligt at studere cellecyklussen. Ved hjælp af et tidsforskydningsinterval på 30 min fangede vi ikke altid den mitotiske figur under celledeling. Dette indførte en potentiel fejl på op til 30 min til den tildelte tid for celledeling. Derudover observerede vi nogle kloner, der syntes at indeholde to progenitorceller (f.eks. figur 2F). Inden for disse begrænsninger kan cellecyklussens længde måles. Ved at spore individuelle Brainbow-mærkede stamaftagere over tid beregnede vi en gennemsnitlig cellecyklus på 8,4 ± 1,5 timer, svarende til tidligere målinger i zebrafisk1,45,46. Desuden, ved hjælp af Brainbow time-lapse imaging teknik, vi var også i stand til at observere individuelle celler undergår de stereotype morfologiske ændringer forbundet med apoptose (Figur 3)11, såsom membran blebbing og celle fragmentering47,48.

Figure 1
Figur 1: Brainbow mærket klonalt relaterede klynger af dividere celler i udviklingslandene zebrafisk baghjernen. (A) Skematisk af hsp:Zebrabow (Brainbow) DNA forbigående udtrykt til farve-kode kloner. bB) In vivo transmitterede lysbilleder af zebrafisk ved 1 og 2 dpf pile angiver den generelle baghjerneregion, der er målrettet mod billeddannelse. Embryonernes gennemsigtighed påvises ved et mikrometer, der er placeret under hver fisk. Eksperimentel tidslinje, der viser injektioner på encellede trin, varmechok (HS) ved 24 hpf og billeddannelse fra 1-3 dpf. (C) Dorsal visning af 29 hpf zebrafisk baghjernen mærket med Brainbow. Den transmitterede lyskanal viste baghjernens morfologi og ventrikel overlejret med maksimal intensitetsprojektion af Brainbow-mærkede kloner, der repræsenterer 165 μm. Rostral er oppe. (D) In vivo Brainbow-udtryk i baghjernen, vist i maksimale intensitetsfremskrivninger, der repræsenterer 41 μm i sparsomt mærket 51 hkf zebrafisk (D1) og 81 μm i 63,5 hpf zebrafisk (D2). I begge paneler, er dorsal op og rostral er til venstre. (E) Cellernes farve i D1 og D2 blev kvantificeret som relative kanalvægte i tilsvarende ternære parceller (n = 54 celler E1; 461 celler E2). (F) Cellefarven forblev forholdsvis konstant i datterceller efter celledeling. Serie af tidspunkter, der viser in vivo mitotiske hændelser i baghjernen på 29 hpf Brainbow-mærket zebrafisk over 1 time (F1, maksimal intensitet fremskrivninger, 30 μm dybde). Farven på mor og datter celler, angivet med de sorte bokse i F1, er repræsenteret som relative kanal vægte i ternære plot i F2. Indsatviser et zoom af samme plot for at vise tæt grupperede cellefarver (M er mor; D1 og D2 er døtre på 30 min / pladser, og 60 min / trekanter). Skalastænger = 30 μm (C), 20 μm (D1),16 μm (D2) og 5 μm (F1). I C, D og F er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grøn, og CFP er kodet som blå. Billeder genoptrykt med tilladelse fra Brockway et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Time-lapse in vivo imaging kombineret med Brainbow farvekodning skelnes flere tilstødende kloner af celler, der gennemgår interkinetisk nuklear migration og dividere. (A) Farvekodede radiale klynger mærket i baghjernen af en fisk, der udtrykker Brainbow ved 2 dpf (55 hkf; A1) og 3 dpf (71 hkf; A2); maksimale intensitetsfremskrivninger på henholdsvis 62 μm og 47 μm. Tre farvekodede radiale klynger identificeres med pilespidser på hvert tidspunkt. (B) Farven på alle Brainbow-mærkede celler i A1 og A2 blev kvantificeret som relative kanalvægte i de tilsvarende ternære parceller i B1 og B2 (n = 106 celler, 119 celler). cC) Zebrafisk baghjernen ved 35 hkf mærket med Brainbow (maksimal intensitetsprojektion med 24 μm) indsat angivet med stiplet hvid boks er det første tidspunkt, der vises i D. (D) Serie af tidspunkter taget med 30 min intervaller i baghjernen fra C. Der vises en periode på >9,5 timer. De mærkede celler gennemgik interkinetisk nuklear migration; hvide pilespidser angiver en celle ved den apikale overflade. Afrunding af cellesomaen ved den apikale overflade og en tilsvarende stigning i klonantallet (f.eks. rød celle ved 5,5 timer og derefter 8 timer) blev betragtet som en mitotisk hændelse. (E) Dorsolateral visning af zebrafisk baghjernen på 30,5 hkf mærket med Brainbow, hvor den hvide stiplede-og-stiplede linje viser den omtrentlige grænse af hovedet, og den hvide stiplede boks angiver indsat vist i første gang punkt af F. (F) Serie af tidspunkter taget med 30 min intervaller i baghjernen fra E. Over en periode på 1,5 timer kunne to blå celler, der er angivet med de hvide pilespidser, observeres, når de bevæger sig til den apikale overflade og gennemgår mitose, hvilket tyder på en klon, der indeholder to progenitorceller. Skalabjælke = 20 μm (A), 25 μm (C) og 20 μm (F). I A-D, er dorsal op og rostral er til venstre. I E og F er rostral til venstre. I alle billeder er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grøn, og CFP er kodet som blå. Billeder genoptrykt med tilladelse fra Brockway et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Time-lapse Brainbow imaging viser celler i ventrikulær zone gennemgå celledød in vivo. (A) Zebrafisk baghjernen ved 31 hpf mærket med Brainbow (maksimal intensitet fremspringning svarende til 36 μm). Hvid stiplet boks angiver indsat vist i første tidspunkt i B. (B) Serie af tidspunkter, der viser baghjernen i A med 30 min intervaller. Hvid pilespids i det første panel viser en lavendel celle, der gennemgik apoptose som vist i efterfølgende paneler, angivet ved cellefragmentering efterfulgt af gradvis clearance af apoptotiske organer. Tilstødende mærkede celler syntes sundt hele vejen igennem. Dorsal er op og rostral er til venstre. Skalabjælke = 20 μm (B). I alle billeder er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grøn, og CFP er kodet som blå. Billeder genoptrykt med tilladelse fra Brockway et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til at visualisere kloner af stamcelleceller og neuroner i den udviklende zebrafisk baghjerne og følge dem in vivo ved hjælp af Brainbow og time-lapse konfokal mikroskopi11. Den største fordel ved denne protokol i forhold til in vitro- eller ex vivo-undersøgelser er evnen til direkte at observere hvirveldyrhjernens proliferativzone i dens naturlige miljø over tid. Denne teknik bygger på tidligere undersøgelser, der mærkede en enkelt klon ved hjælp af retrovirale vektorer. I modsætning hertil er brugen af hsp:Zebrabow konstruere farvekoder mange kloner samtidigt, så multiplex afstamning sporing og fokus på dynamik blandt kloner11. Denne protokol kan ændres for at fokusere på udvikling i andre systemer eller celletyper. For eksempel kan forskellige Brainbow konstruktioner udtrykkes i zebrafisk embryoner. Brug af zebrafisk hsp70 promotor i hsp: Zebrabow vil resultere i mosaik mærkning af en række forskellige celletyper efter varmechok, herunder neurale progenitors og neuroner11, og giver forskerne tidsmæssige kontrol over genekspression29. Det skal bemærkes, at brugen af varmechok promotor konsekvent etiketter farvekodede kloner, mens andre initiativtagere ikke klart kan afgrænse celle afstamning på denne måde. Når klonidentitet ikke er en interessefaktor, kan konstruktioner, der anvender andre initiativtagere, anvendes til at mærke bestemte celletyper. For eksempel kan neuroD promotor bruges til at mærke umodne neuroner18,49. Derudover, i stedet for at udføre mikroinjektioner, forskere kan vælge at udnytte transgene Brainbow zebrafisk, herunder linjer som Tg (ubi:Zebrabow)15 og Tg (neurod: Zebrabow)18. I dette tilfælde, krydser til linjer, der udtrykker Cre recombinase, såsom Tg(hsp:Crea134)15, producere uinjicerede embryoner, der indsamles og vedligeholdes på samme måde. Mens denne protokol er designet til at billedet fisk mellem 1-3 dpf, for at falde sammen med den store periode med udviklingsmæssige neurogenese50, zebrafisk kan opretholdes i længere tid afhængigt af udviklingsmæssige fase af interesse. Men, varmechok at fremkalde Brainbow udtryk før 24 hpf kan være mere skadeligt for embryoner51. Afhængigt af alder og væv af interesse, forskellige montering strategier vil være hensigtsmæssigt at have den målrettede væv orienteret korrekt.

Der er en række trin, der kan kræve fejlfinding, især hvis der foretages ændringer af protokollen. Koncentrationen af DNA, indsprøjtet bolusstørrelse og den samlede mængde DNA, der leveres pr. embryon, kan alle justeres, hvis Brainbow-udtrykket er svagt eller sparsomt, eller hvis embryonerne ikke virker sunde. Desuden kan længden og timingen af varmestødstrinnet ændres, hvis det ønskede udtryk ikke opnås. Anskaffelsesparametrene, der bruges i billedbehandling, varierer afhængigt af de tilgængelige laserlinjer og filtre samt lysstyrken af udtryk, montering og den ønskede type analyse. Derudover skal time-lapse parametrejusteres afhængigt af hastigheden af begivenhederne af interesse og den tid, der er behov for at erhverve en enkelt Z-stack. Et af de mest kritiske trin i protokollen er en passende montering af fisken i agarose: Hvis fiskens vinkel er uhensigtsmæssig, eller hvis fisken er dækket af for meget agarose, vil optimal billeddannelse ikke være mulig. Optimering af denne teknik kan tage nogle praksis. Derudover er det ofte nyttigt at montere flere fisk før billeddannelse, da det kan være svært at fastslå, om montering er passende, før du ser FP udtryk på det konfokale mikroskop selv. Et yderligere kritisk skridt er screening og udvælgelse af de specifikke fisk, der skal afbildes. Hvis der udføres mikroinjektioner, lysstyrke, mærkning tæthed, og Brainbow kopinummer kan alle variere betydeligt blandt fisk. Billeder taget i fisk med dæmpet mærkning, for tæt mærkning eller et lavt kopinummer, hvilket resulterer i få farver, kan være vanskeligere at analysere.

Med denne protokol har vi været i stand til løbende at billede levende zebrafisk op til 16 h11. Denne tid kan begrænses ved E3 fordampning fra billeddannelse skammer, vækst af fiskud af planet af billeddannelse, død eller bevægelse af fisk, eller bruger begrænsninger på konfokale mikroskop tid. Fordampning kan reduceres ved brug af et temperaturstyret tilbehør på mikroskopstadiet. Det skal bemærkes, at de 5D-datasæt, der genereres ved hjælp af denne fremgangsmåde, har tendens til at være store filer, der kræver betydelig plads på harddisken (f.eks. op til ~ 100 GB for en time-lapse om natten) og tilstrækkelig computerkraft til at analysere.

Denne protokol guider forskere til at visualisere farvekodede kloner i en population af neurale stamtagere og datter neuroner i udviklingslandene zebrafisk hjernen og spore deres dynamik over tid. En mulig udvidelse er kombinationen af Brainbow time-lapse imaging med langt rød FP-mærkning til at vurdere specifikke geners roller i udvikling18. På denne måde kan kloner, der udtrykker manipulerede gener, visualiseres i en særskilt farve, spores over tid og sammenlignes med Brainbow-mærkede, ikke-manipulerede tilstødende kloner. In vivo multicolor imaging kan bruges til at løse vigtige mekanistiske spørgsmål om, hvordan nervesystemet former og fungerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (Award 1553764) og MJ Murdock Charitable Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip) Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297, (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146, (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16, (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453, (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81, (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30, (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33, (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36, (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4, (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1, (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255, (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362, (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17, (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21, (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458, (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53, (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27, (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18, (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4, (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics