親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

Developmental Biology

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Summary

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。

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Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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Abstract

ショウジョウバアラにおける運動ニューロンの逆行標識の手法について説明する。油溶存親油性染料を使用し、マイクロインジェクターによる胚性フィレット製剤に小さな液滴を送出します。膜が液滴によって接触する各運動ニューロンは、その後、迅速に標識することができる。個々の運動ニューロンは連続的に標識され、細かい構造の細部を明確に視覚化することを可能にする。親油性染料は様々な色で来ることを考えると、この技術はまた、多色で標識された隣接するニューロンを得るための手段を提供する。したがって、このトレース技術は、ショウジョウバアラの運動ニューロン系における神経形態形成およびシナプス接続性を研究するのに有用である。

Introduction

ショウジョウバチの胚性運動ニューロンシステムは、中枢神経系(CNS)1、2、3の発達の基礎となるメカニズムを分析するための強力な実験モデルを提供する。運動ニューロンシステムは、生化学的、遺伝的、イメージング、および電気生理学的技術に適しています。技術を用いて、遺伝子操作および機能解析は、単一運動ニューロン2、4、5、6のレベルで行うことができる。

神経系の初期の発達の間に, 神経芽細胞が分裂し、グリアとニューロンの多数を生成します。.神経芽細胞の剥離と遺伝子発現プロファイルとの間の時空間的関係は、以前に詳細に7、8、9で検討されている。運動ニューロン系の場合、胚神経筋接合部(NMJ)の形成は、aCC(前コーナーセル)、RP2(生エビ2)、およびRP5運動ニューロン2、10を用いて広く研究されている。例えば、RP5運動ニューロンが新生シナプス接合部を形成する場合、シナプス前およびシナプス後フィロポディアは11、12、13と混在する。このような直接的な細胞通信は、NMJ形成を開始するために不可欠である。末梢神経枝について私たちが知っていることとは対照的に、モーターデンドライトがCNS内でシナプス接続を開始する方法についての私たちの知識はまだ原始的です。

本報告では、親油性色素のマイクロピペット媒介送を用いて胚における運動ニューロンの逆行標識を可能にする技術を提示する。この技術により、産卵後15時間で30個の体壁筋肉のそれぞれを15時間でヘミセグメントにインジェインする38個の運動ニューロンをトレースすることができます(AEL)14.この技術を用いることで、当社のグループは多数の機能獲得/機能喪失アレス15、16、17を徹底的調査しました。我々は最近、運動デンドライト接続の開始を駆動する分子機構を解明し、Dscam1-Dock-Pak相互作用がaCC運動ニューロン17における樹状突起伸の部位を定義することを実証した。一般に、この技術は、野生型または変異型株における任意の胚性運動ニューロンの表現型解析に適応可能であり、ショウジョウバエ神経系の機能設計に関する新しい洞察を提供する能力を高める。

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Protocol

1. 機器と消耗品

  1. 胚を収集し、卵を産むために大人を訓練するための材料
    1. 50 mLのチューブを切断し、キャップに穴を開けて切断して、チューブとキャップの間に100μm(材料テーブル)の細孔を持つメッシュフィルタを設定して、濾過装置を準備します。
      注:あるいは、100μm(材料表)の細孔を有する細胞ストレーナーは、胚採取の濾過工程に使用することができる。
    2. 記載の指示に従って、ブドウ寒天プレミックス(材料のテーブル)で寒天プレートを作ります。簡単に、粉末混合物の1パケットを室温(RT、23°C)dH2Oに軽く攪拌し、溶存混合物を激しく沸騰させる。70−75°Cまで冷却した後、ペトリ皿(60ミリメートル)に混合物を注ぎます。寒天を固めた後、プレートを4°Cで保存します。
    3. 活性乾燥酵母(材料表)と水をペーストの一貫性に混合して酵母ペーストを調製し、4°Cに保ちます。
    4. 十分な空気の流れを提供する卵コレクションケージ(60ミリメートルペトリ皿、材料のテーブル)を使用してください。
  2. 解剖針と染料注入マイクロピペットの調製
    1. 内径0.6mm、外径1.2mm(材料表)の同じ毛細管から染料注入マイクロピペットと解剖針を用意します。170 V の最大出力 (材料の表) から 7% のマイクロピペット プーラーによってキャピラリー チューブを引っ張り、長さ約 0.4 cm のテーパ付きの鋭い針を作成します。
    2. 染料注入の場合は、計器のマニュアルに記載されているバブルベベル技術により、マイクロピペットベベラー(材料表)でマイクロピペットを調整します。
      1. 要するに、水が針の先端を「ドラッグ」するのを防ぐために、湿潤剤(材料の表)で粉砕機を浸します。マイクロピペットクランプの上に針を25~30°で置き、先端をベベルサーフェスの中心から半径の3分の2に下げます。チューブ付きの注射器が針に空気を押し込む間に針を粉砕し、マイクロピペットがガラスシェービングをクリアするようにします。
      2. マイクロピペットに細かい先端のパーマネントマーカーを付けると、斜めに形成されたマイクロピペットの狭い開口部を見つけるのが難しいので、ベベル後の先端の開口部の位置を示します。

2. 胚コレクションの準備

  1. 大人のハエ(20-40野生型カントン-Sまたは白いハエ)、オスとメスが若い(<7日)と理想的な卵のコレクションのための健康的な条件で維持されていることを確認してください。
    注:産卵を刺激するために、ハエは、少なくとも毎日1回、酵母ペーストで縞模様の寒天プレートに卵の収集の数日前に、彼らの卵の収集ケージで訓練されています。

3. 胚ステージング

  1. ハエがRTで一晩(または少なくとも15時間)卵を産むことを許可し、15時間AEL、すなわちステージ1618で胚を収集し、aCCおよびRP3運動ニューロンの樹状形成を見る。朝、卵と一緒に皿を集めます。
    注:15時間AELの胚は、明確な4チャンバー腸18を有する。異なる段階をイメージングするために、彼らの特定の形態学的基準および老化条件に従う。
  2. 胚を収集するために、5分間50%漂白剤でプレートに産まれた卵をデコリオネートします。
  3. 傷口がクリアされたら、濾過装置または細胞ストレーナーを通してプレートの内容物を注ぎ、胚を単離します。水の絞りボトルを使用して、プレートに残った漂白剤を希釈し、フィルターに混合物をデカントすることによって、できるだけ多くの胚を収集します。
  4. より多くの水で、または漂白剤の臭いが消えるまで、フィルター3-4xの胚を洗浄します。装置からフィルターを取り出し、胚を水で別のきれいなプレートに洗います。胚が置いている新しいプレートから水をデカントします。
  5. 中央に2層のビニールテープで覆い、長方形を形成してガラススライドを準備します。カミソリの刃を使って、長方形のプールをテープから切り取ります。プールの上端に両面テープの細いストリップを配置すると、図1に示すように胚が配置されます。
  6. 細かい鉗子を使用して、15時間AELで5−10の胚を個別に選択し、後ろ側を上に向けた両面テープに置きます。昆虫リンガーの生理線19を解剖プールに追加して、胚を乾燥から保護します(図1)。

4. 解剖と染色

  1. 解剖顕微鏡(材料表)の下でガラス針を使用して、その表面の単一胚の中間線を後部から前端まで切断します。次に、胚をテープからガラスにビテラリン膜からドラッグします(図1をボックス化)。胚の内部組織に損傷を与えないように注意してください。
  2. 中央から上皮組織を反転し、表皮エッジをガラススライドの表面に取り付けます(図1、差し込み)。
  3. 約300μmの先端開口部(解剖針の薄い先端を壊すことによって調製される)の先端の開口部を有する管接続された針を使用して、吸気または吹き飛ばして、後ろ縦気管支幹ならびに残りの腸を取り外す。
  4. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、RTで胚を5分間固定し、胚をPBSで3x洗浄します。
  5. シアン3色素(抗HRP Cy3)と共役した抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体1μLで胚を染色し、200μLのPBSで1時間PBSで胚を染色した後にPBS 3xで洗浄します。
    注:抗HRPの色素は、注射のための選択した親油性染料に基づいて変更することができます。

5. インジェクションマイクロピペットの充填

  1. 熱親油性染料(DiOまたはDiDの5mg/mL、材料の表)を使用前にエタノール:植物油の1:10混合物で60°Cに。
  2. 注射マイクロピペット用の油溶存染料スライドを用意します。マイクロピペットをキャピラリーホルダーに入れます(2、#1)。マイクロマニピュレータ(材料表)を使用して、ミクロピペットを色素スライド上に調整します。次いで、マイクロピペットを染料上に置くようにステージを調整する(2、#2)。
  3. マイクロピペットを埋めるには、マイクロインジェクター(材料表)(図2、#3)を使用します。Pi(射出圧力)を200~500hPa(ヘクトパスカル)、Ti(射出時間)を0.1~0.5s~Pc(補償圧力)の間で5分間0hPaに設定して、マイクロピペット中の色素を回収します(図2、#4)。
  4. 染料を回収したら、染料スライドを取り外し、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。次に、ピレピペットをサンプルに下げる前にPcを20~60hPaの範囲に増やし、毛細血管作用によるPBSの汚染を防ぎます。

6. ニューロンへの色素注入

  1. 10倍の対物レンズ(材料表)を用いて中央に胚を見つけ、マイクロピペットを胚に合わせます。
    メモ:色素液滴のサイズは、Piまたはマイクロピペット先端の開口部のサイズを変更することによって調整することができます。液滴は10-20 μmで、これは約1筋肉の幅である必要があります。
  2. 対物レンズを水浸40倍レンズ(材料表)に交換し、レンズをPBSに沈下して胚を見ます。
    1. 蛍光顕微鏡を使用して、抗HRP Cy3でマークされたニューロン形態をチェックし、注射部位を決定します。
    2. 注射中は、明視野顕微鏡を使用して色素液滴を確認します。胚が焦点を合わせるとき、マイクロピペットの位置を変更して、目的の軸索の先端(例えば、aCC、RP3)と穏やかに接触させる。
    3. 抗HRP Cy3でマークされたニューロンを使用して、ACCまたはRP3(図3)の神経筋接合部で右腹部(A2-A6)ヘミセグメントに色素をドロップします。ハンドコントロール(マウス;図2、5)染料を離し、マイクロマニピュレータで染料を落とした後にマイクロピペットを取り外し、次の注入部位に移動する。
      注:ギャップ接合を介して隣接する細胞に広がる他の染料(例えば、ルシファー黄色、カルセイン)とは異なり、親油性染料は細胞膜に関連し、近傍に移動しません。ただし、色素液滴のサイズが比較的大きいため、この手法はパートナーリング筋肉のラベリングにもなります(図3A)。
  3. イメージングの前に、染料滴下後に1時間RTでサンプルをインキュベートします。
    メモ:プロトコルは、マウントする前にここで一時停止することができ、サンプルは一晩で4 °Cに保つことができます。親油性染料は、イオントフォレーシスを用いて送達することもでき、細胞内直接結合(DC)増幅器が容易に入手可能な場合は20である

7. 共焦点顕微鏡によるイメージング

  1. 鉗子の助けを借りてガラススライドから両面テープとビニールテープを取り外します。
  2. 四隅に少量の真空グリース(材料のテーブル)を使用してカバースリップ(22 x22 mm 2 No.1カバーガラス)を準備し、気泡を避けて慎重にサンプル上に置きます。タスクワイパーを使用して余分なPBSを削除します。
  3. カバースリップを押し下げて、対物レンズとサンプル間の作業距離を調整します。カバースリップの縁をマニキュアで完全に密封します。
  4. 共焦点顕微鏡を用いた10倍及び100倍倍の倍率での画像。
  5. ImageJソフトウェアを使用して、顕微鏡から生画像を処理します(材料表)。
    メモ:最適な画像を取り付けた後、10分以内に観測を開始する必要があります。それ以外の場合、RTでは、染料は、イメージングのための不要な背景を作成する注入部位に隣接する部位に広がります。染料の拡散を遅くするために、サンプルは数時間4°Cで保存することができる。

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Representative Results

aCCおよびRP3運動ニューロンの代表的な画像を図3Cに示し、15時間AELにおける運動ニューロンの多色標識を示す。彼らの樹状の形態は、胚間の大部分が不変である。抗HRP抗体で得られた染色パターンを灰色で示す。DiOまたはDiDの小さな液滴をそれぞれ筋肉1または6/7のNMJに沈着させた。図4は、目的の表現型を定量的に測定する能力を示す。変異型 (例: dscam1-/-) と比較して、野生型の樹状突起チップの総数をカウントしました。

Figure 1
図 1: 解剖プールのセットアップガラスのスライドに見える青い部屋は内部の緩衝液を保つビニールテープで作成される。両面テープは、適切に整列された胚に保持されます。また左下隅に示されているのは、生理線中の解剖胚の一例である。前端は、この数字とそれ以降のすべての数値の一番上にあります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:染料注入装置図中のガラスピペットラベリングは、ガラスピペット(1)の設置場所を示す。エピ蛍光顕微鏡には、LED光源と一連のフィルターセットが装備されています。マイクロマニピュレーター(2)およびマイクロインジェクション(3)デバイスは、顕微鏡の右側に標識される。差し込みは、Pi、Ti、およびPcの適切な値を持つマイクロインジェクションデバイス(4)の表示のクローズアップです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:逆行標識運動ニューロンの親油性色素製剤(A)逆行標識運動ニューロンとその標的筋aCC運動ニューロンを屈起筋1(DiO:励起/放出、484 nm/501 nm);RP3運動ニューロンを内なる筋肉6/7(DiD:励起/放出、644 nm/665 nm)。筋肉6/7はまた、幼虫段階で別の運動ニューロン(MNISNb/d-Is)から内なるを受け取ることに注意してください。しかし、MNISNb/d-Isは胚性の対応するものを持っていません 3 .円は、染料アプリケーションのサイトを示します。(B) 15時間AELにおける体壁筋及び末梢神経枝の概略図腹神経コード(VNC)は、腹部の中線(点線)に対してセグメント的に繰り返され、両側対称神経ミアからなる。各ヘミセグメントの体壁筋は、38個の運動ニューロンによって内向きである。運動ニューロンは、6つの主要な神経枝(ISN[セグメント間神経]、SNa[セグメント神経a]、SNb、SNc、SNd、およびTN[横神経])を介して軸索を投影する。(C)aCCおよびRP3運動ニューロンからの樹状枝は広範な重なりを示す。両方のニューロンは双極性ニューロンであり、ニューロンが樹状突起の2つの異なる集団を確立することを意味します。各ニューロンは、1つのアーバーをイプシラテラルニューロピルに、もう1つのアーバーを対国間ニューロピルに投影します。矢印は樹状のヒントを指します。蛍光画像は、10倍の目的または100倍のオイル浸漬目的で取得した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:aCCデンドリトジェネシスは、1時間~15個の胚における逆行標識で明らかになった。(A) 野生型では、aCCは樹状突起をイプシラテラルおよび反対側の両方の神経ピルに拡張する。わかりやすくするために、この図では aCC の ipsal デンドライトのみを表示します。aCC には、緑色で示された DiO のラベルが付いています。(B) dscam1突然変異体(ツミン・リー博士、ジャネリア・リサーチ・キャンパスのdscam121)では、aCCは17を観測したほとんどの場合、ほとんど多くのイプシラテラル・デンドライトを持っている。矢印は樹状のヒントを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

神経形態を研究するための色素標識の使用は、遺伝的細胞標識技術よりもいくつかの利点を有する。色素標識技術は、運動ニューロンの形態を標識およびイメージングするために必要な時間を最小限に抑えることができます。色素標識プロセスは2時間未満で、神経突起の輪郭を定義できるので非常に高速です。あるいは、aCCで酵母GAL4転写因子を発現するGAL4線を選択し、上流活性化配列(UAS)21によって制御される緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターと交差させることにより、aCC運動ニューロンを可視化することができる。GFPラベリング技術は遺伝的クロスを必要とするため、数日余分にかかる。

色素標識のもう一つの利点は、極めて高密度で血漿膜の標識を可能にすることである。親油性染料の十分な密度は、膜のあらゆる部分に存在することができ、我々は標識された構造の細部を解決することができます。対照的に、GFP分子の密度は、多くの場合、UAS-GAL4システムが開始された後の待ち時間に依存します。たとえば、aCC は 10 時間 AEL から GFP を表現し始めます。観察時に15時間AELでは、GFP分子の密度は膜全体を覆すには不十分です。細かいニューロン突起(D.K.、未発表データ)の標識が不十分となる。

この技術はいくつかの利点を提供するが、モータ軸索の誤射が明らかな場合には、それほど有利ではない。サイドステップがない場合、例えば、運動ニューロンは、早期失速、セグメント境界交差、および過度の分岐22などの重度の軸索欠陥を表示する。その結果、ある軸索端子に到達するのが面倒になります。標識の効率も年齢依存であり、20時間AELより若い胚に有効である。細胞外マトリックスタンパク質が発達するにつれて増加するにつれて、運動ニューロンの標識は非常に複雑に見えます。

ここで説明する技術は、神経突起全長数と数、神経突当分岐パターンおよび形状15、16、17、23、24などの多くの形態学的パラメータを測定することを可能にする。親油性カルボシアニン色素は多くの色(DiO、DiA、DiI、DiD、DiRなど)で来るので、隣接する運動ニューロンの多色標識も達成可能である。図4に示すように、aCCおよびRP3運動ニューロンからの樹状突起は広範囲に重なっている。モータ回路開発における理解をさらに深めるために、樹状突起相互作用のメカニズムを検討する。

ここでは、運動回路におけるニューロン接続を研究する手段を提供する多目的な技術について詳しく説明します。デモンストレーションは15時間AELのaCCおよびRP3運動ニューロンに限定されるが、この技術は胚発生の異なる段階で他の運動ニューロンに適用することができる。軸索末端が注射マイクロピペットでアクセス可能な場合、この技術はハエの幼虫および成人期の任意のニューロンの標識、あるいは他の生物においても適用することができる。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

神山研究室の皆様に、原稿に関するご意見をお寄せいただき、ありがとうございます。この作品は、NIH R01 NS107558(M.I.、K.B.、およびD.K.)によってサポートされました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22x22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

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References

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