Author Produced

اكتشاف الأهداف التنظيمية CsgD في السالمونيلا biofilm باستخدام كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن والتسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq)

Genetics
 

Summary

كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن إلى جانب الجيل التالي من التسلسل (رقاقه-seq) هو أسلوب يستخدم لأقامه التفاعلات بين عوامل النسخ وتسلسل الجينوم التي تتحكم فيها. هذا البروتوكول يحدد تقنيات لأداء رقاقه-seq مع الاغشيه البيولوجية البكتيرية ، وذلك باستخدام السالمونيلا معوي سيرفار البكتيريا بيوفيلم البكتيرية كمثال.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن متبوعا بالتسلسل (رقاقه-seq) هو تقنيه التي يمكن استخدامها لاكتشاف الأهداف التنظيمية لعوامل النسخ ، والتعديلات هيستون ، وغيرها من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي. ويمكن أيضا استخدام بيانات الرقاقة المتسلسلة للعثور علي الربط التفاضلي لعوامل النسخ في الظروف البيئية المختلفة أو أنواع الخلايا. في البداية ، تم تنفيذ رقاقه من خلال التهجين علي ميكروصفيف (رقاقه تشيب) ؛ ومع ذلك ، أصبحت رقاقه-seq الطريقة المفضلة من خلال التطورات التكنولوجية ، وخفض الحواجز المالية للتسلسل ، وكميات هائله من إنتاج البيانات عاليه الجودة. ويرد في هذا البروتوكول وصف لتقنيات تنفيذ الرقاقات المتسلسلة مع الاغشيه البيولوجية البكتيرية ، وهي مصدر رئيسي للعدوى المستمرة والمزمنة. يتم تنفيذ رقاقه-seq علي السالمونيلا معوي سيرفار المكورات المعوية والخلايا المسوية ، واستهداف المنظم بيوفيلم الرئيسي ، csgd ، لتحديد الربط التفاضلي في نوعي الخلية. هنا ، فاننا نظهر الكمية المناسبة من بيوفيلم للحصاد ، وتطبيع لعينه التحكم بلانكتيتونيك ، بيوفيلم المجانسة للوصول عبر رابط ، وأداء الخطوات الروتينية المتسلسلة رقاقه للحصول علي نتائج التسلسل عاليه الجودة.

Introduction

الاغشيه الحيوية البكتيرية ، والمجاميع الهيكلية للخلايا المضمنة في مصفوفة منتجه ذاتيا ، تقاوم الجفاف والمضادات البيولوجية والاستجابات المناعية المضيفة1. وعلي هذا النحو ، فانها تسبب التهابات المستمرة والمزمنة وتمثل تحديات فريدة للباحثين بسبب حلولهم للبقاء والانتقال. السالمونيلا المعوية سيرفار تياموريوم (s. وقد وجدت لإنشاء السكان غير متجانسة ظاهريا من المجاميع بيوفيلم التي تقاوم الجفاف والمضادات الحيوية ، والخلايا المسوية التي تعبر عن عوامل الضراوة في الثقافة البحتة عندما تتعرض للإجهاد البيئي (28 درجه مئوية ، والحد من المواد الغذائية)2. ينشا هذا اثنان خليه أنواع واجبه إلى تعبير [بيستابل] من الرئيسية [بيوفيلم] منظم, [ككب]3. لقد افترضنا ان هذا قد يكون استراتيجية الرهان التحوط للسالمونيلا، حيث الخلايا بلانكتونيك المشاركة في انتقال قصيرة الأجل وخلايا بيوفيلم قادره علي الاستمرار علي المدى الطويل في البيئة حتى فرصه لتصيب مضيف جديد ينشا2،4. تتميز العديد من العناصر التنظيمية التي تتحكم في التعبير الخاص ب csg operon بشكل جيد5. ومع ذلك ، وبصرف الفضل عن عدرا و csg operon6، معروفه الأهداف التنظيمية قليله من csg. ومن شان تحديد الشبكة التنظيمية CsgD مساعدتنا علي فهم أفضل لدوره حياه السالمونيلا والدور الذي تلعبه الاغشيه البيولوجية في الإرسال.

Chromatin ايمونوبريسيبيتيشن متبوعا التسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq) هو تقنيه قويه في الجسم الحي لتحديد الجينوم علي نطاق واسع من التفاعلات البروتين والحمض النووي ويوفر معلومات عن العمليات التنظيمية التي تنطوي علي عوامل النسخ ، والتعديلات هيستون ، أو التماثيل7. وقد استخدمت أحدث الدراسات هذه التقنية لتقييم ربط البروتين التفاضلي بين ظروف النمو وأنواع الخلايا8. في الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه) ، يتم إثراء شظايا الحمض النووي مع البروتينات المتفاعلة من خلال اختيار الأجسام المضادة من البروتينات المستهدفة. يتم حصاد الخلايا ويتم ربط البروتينات المرتبطة بالحمض النووي بالحمض النووي في الجسم المجري من خلال علاج الفورمالديهايد عبر الرابط. يتم الضغط علي الخلايا ، والإفراج عن محتويات الخلية ، ويتم الكشف عن الكروماتين في ما يقرب من 200-600 bp شظايا7. شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين المستهدف هي إيمونوبريسيبيتاتيد باستخدام الأجسام المضادة ، ومعزولة عن طريق أزاله التشابك متبوعا بهضم البروتين9. وتمثل شظايا الحمض النووي هذه مواقع ربط البروتين التي يقابلها التهجين إلى ميكروصفيف (رقاقه تشيب) أو عن طريق التسلسل العميق ورسم الخرائط لتسلسل الجينوم10،11. علي الرغم من ان التجارب رقاقه تشيب تسفر عن بيانات تنظيميه كافيه ، فهي محدوده بسبب استخدام تحقيقات مكلفه ، فضلا عن التهجين والتحيز صفيف12. رقاقه-seq لديها مجموعه ديناميكية أكبر مع زيادة القرار النيوكليوتيد والتغطية ، وتحسين نسبه الاشاره إلى الضوضاء ، والقطع الاثريه اقل بالمقارنة مع رقاقه رقاقه7.

وقد استخدمت رقاقه لتحليل sfh و ompr التنظيم في السالمونيلا سيرفار تياموريوم13،14، النصاب--الاستشعار AphA التنظيم في فيبريو الجينات15، اللائحة rpos في القولونية16، التنظيم التنظيمية التحكم في المتفطره السل17، المحتملة diguanylate الدوريات من خلال التنظيم amrz في الزائفة الزنجاريه18، فضلا عن vrasr التنظيم في المكورات العنقوديةالذهبية19. تبدا التجارب البكتيرية المتسلسلة التي تم وصفها بالخلايا المتنامية في الوسائط السائلة والحصاد في شكل خليه واحده. ومع ذلك ، فان تحليل الاغشيه البيولوجية والتنظيم الجيني المناظر يمثل مجموعه جديده من التحديات لتوليد بروتوكول الرقاقة المتسلسلة الناجح. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام رقاقه-seq للعثور علي الأهداف التنظيمية التفاضلية من CsgD ، S. منظم بيوفيلم الرئيسي بيوفيلم في أنواع الخلايا بيوفيلم و عوالق. يصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد الكميات المناسبة من بيوفيلم لرقاقه-seq ، حصاد بيوفيلم من ثقافة قارورة ، تطبيع بيوفيلم وعينات التحكم خليه واحده ، تجانس بيوفيلم ، وكامله ايمونوبريسيبيتيشن. سيكون ذلك مفيدا لدراسة الأهداف التنظيمية في الاغشيه البيولوجية البكتيرية ويمكن تكييفه للعديد من الأنواع.

Protocol

1. قارورة نمو خليه الثقافة

  1. من المخزونات المجمدة ، سلاله السالمونيلا سيرافار التيفوئيد سلالات علي أجار LB (20 مل وسائل الاعلام الصلبة في 100 Mm لوحه بيتري) مع المضادات الحيوية المناسبة واحتضان في 37 درجه مئوية ل 16-20 ح للحصول علي مستعمرات معزولة.
  2. تطعيم 5 مل رطل مرق يحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة في 25 مم x 150 مم الأنبوب الثقافة بوروسيليكات مع 1-3 مستعمرات من لوحات الخط من الخطوة 1.1. احتضان في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة لمده 7 ساعات.
  3. قياس OD600 من ثقافة المرق باستخدام مقياس طيفي. تمييع قسامه من الثقافة 1 في 4 في الاذاعه التلفزيونية في كوفيت 2 مل وقياس الامتصاص في 600 nm. وقد وجدنا ان العامل الأكثر اهميه في هذه الخطوة هو وقت النمو. يتم استخدام قيم OD لتطبيع الثقافات لتسليم العدد المطلوب من الخلايا في الخطوة 1.4.
  4. أضافه 1.0 OD600 حجم مكافئ لثقافة الخلية (اي ~ 109 خلايا) إلى قارورة ايرلينماير تحتوي علي 100 مل من التريتون 1 ٪ مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان في 28 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 لفه في الدقيقة لمده 13 ساعة.
    ملاحظه: ستظهر خلايا بيوفيلم كالرقائق المجمعة والخلايا المفردة في الوسائط الغائمة.

2. جمع خاليه من الخلايا المكيفة 1 ٪ التريتون

  1. جمع ثقافة قارورة لخاليه من الخلايا المكيفة 1 ٪ التريتون. الماصة قارورة الثقافة عده مرات لخلط قبل أضافه إلى أنبوب الطرد المركزي.
  2. جهاز الطرد المركزي في 12,000 x g ل 10 دقيقه في 10 °c إلى بيليه جميع الخلايا.
  3. Decant ماده طافي إلى وحده تصفيه 0.2 μm ، فلتر فراغ ، والاستغناء في أنبوب جديد.
    ملاحظه: المجاميع Biofilm هي ملتصقة في الحلول التقليدية (علي سبيل المثال ، تلفزيوني) وسوف تلتصق بجانبي الأنابيب ونصائح الماصة. نظرا لأنه يسمح للتلاعب أسهل ، ونحن نستخدم وسائل الاعلام المكيفة (1 ٪ التريتون) لنقل بيوفيلم في البداية واستخدام الدافئة تلفزيوني مباشره قبل عبر ربط (الخطوة 4.5) لأزاله اي البروتين المتقاطعة ركائز التي يمكن ان تكون موجودة في وسائل الاعلام.

3. فصل الخلايا بيوفيلم والمسوي من الثقافات قارورة2

  1. باستخدام ماصه 25 مل معقمه ، والثقافة قارورة قسامه إلى 15 مل أنابيب. الطرد المركزي بسرعة بطيئه (210 x g) لمده 2 دقيقه ، لفصل نوعين من الخلايا.
    ملاحظه: خلايا بيوفيلم يجب ان تشكل بيليه فضفاضة في الجزء السفلي من الأنبوب
  2. ماصه الفائقة التي تحتوي علي خلايا بلانكتونيك في أنابيب الطرد المركزي 2 40 mL لفتره لاحقه (الخطوة 5). أزاله جميع السائل المتبقية ، والحرص علي عدم إزعاج بيليه. كرر حتى يتم فصل أنواع الخلايا من كافة وسائط الثقافة القارورة.

4-اعداد مجاميع بيوفيلم

ملاحظه: يتم حصاد Biofilm بالوزن الرطب لإنتاج 25 ميكروغرام من الحمض النووي ، والحد الأدنى الموصي به مواد البداية لرقاقه. معامل التحويل Biofilm (معامل العامل الإحيائي) لل S. التيفوئيد هو 1.73 x 108 كفو/mg2. سيحتاج الباحثون الذين يقومون باعداد أنواع بيوفيلم أخرى إلى تحديد عدد الخلايا لكل وحده من وزن بيوفيلم ، والذي يستخدم للعثور علي وزن بيوفيلم المطلوب ل 25 ميكروغرام من الحمض النووي بدءا من المواد باستخدام هذه المعادلة:
Equation 1

  1. تزن 2 مل المفاجئة قبعة أو أنبوب غطاء المسمار بدقه.
  2. أعاده تعليق بيليه بيوفيلم في 1 مل من التريتون المكيفة. نقل بيوفيلم المعاد تعليقه إلى ما قبل وزنها 2 مل المفاجئة قبعة أو أنبوب غطاء المسمار.
  3. الطرد المركزي لمده 1 دقيقه في 11 000 x g عند 20 درجه مئوية
  4. أزاله جميع ماده طافي بعناية من الأنبوب وتزن الأنبوب بدقه. طرح وزن الأنبوب من وزن الأنبوب مع بيوفيلم للعثور علي وزن بيوفيلم. يجب ان يكون ± 10 ٪ من الوزن بيوفيلم الهدف.
  5. اغسل الخلايا لأزاله التريتون المكيف المتبقي. أضف 1 مل من البث التلفزيوني الدافئ إلى الأنبوب والدوامة برفق لأعاده تعليق البيليه. الطرد المركزي لمده 3 دقائق في 8 000 x g إلى بيليه بيوفيلم وأزاله supernatant. أضافه 1 مل من تلفزيوني إلى أنبوب ودوامه لأعاده تعليق بيليه.

5. اعداد الخلايا المسوية

  1. سجلت الحجم وال [سد]600 من ال [بلنكتونيك] [سوبرننت] من بطيئه سرعه طرد (خطوه 3.2) يستعمل مقياس طيفي
  2. حساب الحجم المطلوب للحصول علي600 OD النهائي من 6.0:
    Equation 2
  3. تبريد الطرد المركزي إلى 10 درجه مئوية وخلايا الرواسب المسوية من قبل طرد (10,000 x g، 10 دقيقه في 10 °c)
  4. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في المجلد النهائي من تلفزيوني محسوبة في الخطوة 5.2.
  5. أعاده قياس od600 من الخلايا عوالق باستخدام مقياس طيفي والاستغناء عن حجم 6.0 od600 عوالق الخلايا في غطاء المفاجئة 2 مل أو أنبوب كاب المسمار.
  6. جلب حجم إلى 1 مل مع تلفزيوني.

6. المجانسة الخلايا

  1. أضافه واحده معقمه 5 مم الفولاذ المقاوم للصدا حبه لكل من الأنابيب.
  2. المجانسة باستخدام مطحنه خلاط لمده 5 دقائق في 30 هرتز. لاحظ الأنابيب التجميعية للتاكد من ان بيوفيلم قد تم كسره.
  3. نقل الخلايا المتجانسة إلى أنبوب 1.5 mL جديده ، وتجنب حبه معدنيه. جلب حجم إلى 1 مل مع تلفزيوني.
    ملاحظه: قم باجراء الموسعات التسلسلية لتعداد خلايا الإدخال وتحقق من ان رقم الخلية النهائي قريب من الرقم المطلوب أو المتوقع.

7. عبر ربط البروتينات إلى الحمض النووي

  1. الاستغناء عن الفورمالديهايد الطازجة في أنابيب عينه إلى تركيز النهائي من 1 ٪. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة علي عجله الدورية.
    تحذير: الفورمالديهايد هو تاكل ، والجلد ، والعين ، ومهيج الجهاز التنفسي ، وقابله للاشتعال. الاستغناء عن غطاء الدخان.
  2. أضافه 1 M الجليسين إلى تركيز نهائي من 125 mM لوقف الربط المتقاطع. احتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة علي عجله الدورية.

8. غسل الخلايا لأزاله الزائدة المتقاطعة

  1. الرواسب الخلايا في 8,000 x g لمده 3 دقائق وأزاله ماده طافي
  2. أعاده تعليق بيليه في 20 μL من مثبطات الانزيم البروتيني 25x و 500 μL من فلتر تعقيم التلفزيوني.
  3. أنبوب الطرد المركزي لمده 3 دقائق في 8000 x g وأزاله supernatant.

9-الخلايا الليسينجه

  1. أعاده تعليق بيليه في 600 μL المخزن المؤقت تحلل (الرجوع إلى الجدول 1) واحتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه.
  2. أضافه 1.4 ml من المخزن المؤقت التخفيف IP (الرجوع إلى الجدول 1) إلى أنبوب معقم 15 مل ونقل الخلايا تفكيك إلى أنبوب 15 مل. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد ل 1.5-2 h ، ودوامه بلطف وأحيانا.
    ملاحظه: قد تظل بعض مواد الخلايا المقاومة في الأنابيب. وهناك فتره حضانة طويلة علي الجليد مع vortexing في بعض الأحيان كسر المواد. سيتم تقسيم الباقي من خلال سونيكيشن.

10. تفتيت الحمض النووي بواسطة سونيكيشن

  1. وضع أنبوب 15 مل في كوب من الجليد ووضع المسبار 3 ملم داخل الأنبوب.
  2. تنفيذ 5 جولات سونيكيشن من 30 ق علي في 20-40 ٪ من 400 W مع 2 دقيقه التبريد علي الجليد بين رشقات ناريه.
  3. الرواسب عجلت المواد بواسطة طرد (8000 x g، 10 دقيقه عند 4 °c). انقل العملاق إلى أنبوب جديد
  4. وبشكل اختياري ، قم باجراء الربط العشري عند 65 درجه مئوية لمده 30 – 60 دقيقه وهضم الحمض الريبي النيبالي والبروتين عند 45 درجه مئوية لمده 30-60 دقيقه قبل التشغيل علي هلام بنسبه 2% للتحقق من الأجزاء المناسبة الحجم.
    ملاحظه: تزج التحقيق في الخلية lysate. الحفاظ علي الحل علي الجليد في حين سونيكاتينج ويستريح. لا تقم بازاله الأنبوب بينما المسبار sonicator هو pulsing. يجب ان يظهر الحل غائم قبل سونيكيشن وواضحة بعد صوتنه.

11. إيمونوبريسيبيتاتينج الحمض النووي-البروتين-الأجسام المضادة المجمعات

  1. اعداد
    1. الاستغناء عن واحد 1.35 مل قسامه لايمونوبريسيبيتيشن و 1 200 μl قسامه كعنصر تحكم الإدخال. تخزين عنصر تحكم الإدخال في-80 درجه مئوية حتى يتم تنفيذ خطوات الربط والهضم.
  2. ايمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة الاساسيه
    1. أضف 10 ميكروغرام من المضادات الاساسيه الخاصة بالبروتين المنقي إلى ال1.35 μL. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية علي عجله الدورية.
      ملاحظه: الأجسام المضادة الاساسيه يمكن ان تكون الأجسام المضادة أحاديه اللون ، والمصل متعدد المستويات عاليه الجودة أو الأضداد التجارية الفوقية (اي ، ومكافحه العلم).
    2. أضافه 50 μL من البروتين ز الخرز المغناطيسي إلى أنابيب من 11.2.1 الخطوة واحتضان في 4 درجه مئوية ل 3 ح علي عجله الدورية.
    3. مكان المخزن المؤقت غسل الملكية الفكرية 1 ، المخزن المؤقت غسل IP 2 ، و TE pH 8.0 (الرجوع إلى الجدول 1) في دلو الجليد. الدافئة العازلة إلى 65 درجه مئوية.
      ملاحظه: لا تضع الحل الذي يحتوي علي المخزن المؤقت التملص علي الجليد.
    4. ربط البروتين ز الخرز المغناطيسي إلى جانب الأنابيب باستخدام موقف المغناطيسي
    5. اجراء يغسل: غسل 2x مع 750 μL الباردة التخزين المؤقت الملكية الفكرية غسل العازلة 1 ، وغسل 1x مع 750 μL الباردة التخزين المؤقت غسل IP 2 ، وغسل 2x مع 750 μL الباردة TE في الأس الهيدروجيني 8.0. حافظ علي الأنابيب علي الحامل المغناطيسي اثناء الغسيل.
    6. أضافه 450 μL من المخزن المؤقت القابلة للملكية الفكرية (الرجوع إلى الجدول 1) لكل أنبوب واحتضان في 65 درجه مئوية لمده 30 دقيقه مع vortexing لطيف كل 5 دقائق.
    7. ربط الخرز إلى جانب الأنابيب باستخدام موقف المغناطيسي. انتظر علي الأقل 2 دقيقه حتى يصبح الحل واضحا.
    8. الاستغناء عن ماده طافي تطهيرها إلى أنبوب 1.5 mL جديده ، ويجري الحذر لعدم إزعاج بيليه حبه المغناطيسي.

12-الربط بين مجمعات بروتين الحمض النووي والهضم المشترك لتنقيه RNA والبروتين

  1. أضافه 2 ميكروغرام RNase A و NaCl إلى تركيز النهائي من 0.3 M إلى كل أنبوب.
  2. احتضان في 65 درجه مئوية ، ل ≥ 6 ساعة ، أو بين عشيه وضحيها.
  3. الهضم البروتين الكامل عن طريق أضافه 180 ميكروغرام بروتينيه K لكل أنبوب ، ثم احتضان في 45 درجه مئوية ل 3-5 h.

13-اعداد المكتبات وتسلسلها

  1. تنقيه الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي
    ملاحظه: يفضل الخرز المغناطيسي لعزل الكميات الصغيرة من الحمض النووي التي يتم استردادها عاده اثناء الرقاقة مع الخلايا البكتيرية.
  2. اعداد المكتبات باستخدام مجموعه متوافقة مع النظام الأساسي للتسلسل المحدد.
  3. تحقق من تركيز المكتبة بمقياس فلوميتر ومجموعه واسعه من dsDNA أو مجموعه القياس الكمي مكتبه qRT-PCR.
    ملاحظه: في تجربتنا ، قد تبالغ قياسات الفلوميتر تركيز الحمض النووي.
  4. مكتبات تجمع ، والتي تمثل تغطيه كافيه لكل عينه مكتبه. لتسلسل الومينا مع السالمونيلا، قمنا بتجميع 10 – 12 مكتبات. أضافه تريس-HCl pH 8.0 إلى تركيز نهائي من 1 ملم.
  5. التسلسل وفقا لمواصفات المنصة المحددة.

Representative Results

اعداد عينات ايمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من بيوفيلم البكتيرية ينطوي علي عده خطوات ، كما هو مبين في الشكل 1. هذا يتضمن ينمو [بيوفيلم] في قارورة ثقافة, جمع وسائل الاعلام المكيفة ، وجمع كميه كافيه من الخلايا بيوفيلم و عوالق كعنصر تحكم ، وغسل الخلايا في الاذاعه التلفزيونية ، والتجانس ، والبروتينات المتقاطعة إلى الحمض النووي ، والخلايا الليسينجه ، وتفتيت الحمض النووي من صوتنه ، إيمونوبريسيبيتاتينج dna مع الأجسام المضادة المناسبة

خلايا s. التيفوئيد المزروعة في الثقافة السائلة تحت الظروف التي تحفز بيوفيلم الخضوع النمط الظاهري التحول إلى شكل المجاميع بيوفيلم الخلايا المتعددة والخليات بلانيكتونيك. هذا السكان سوف تحتوي علي ما يقرب من 40 ٪ بيوفيلم المجاميع ، والتي تعبر عن مستويات اعلي من السيكلولات diguanylate (dgcs) والمنظمين بيوفيلم ، و 60 ٪ خلايا بلانكتونيك ، والتي تعبر عن مستويات اعلي من الجينات المرتبطة بالضراوة2،4 (الشكل 2ا). في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لحصاد كل من أنواع الخلايا لمقارنه مواقع النسخ من خلال رقاقه-seq ؛ ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لأنواع أخرى من الاغشيه البيولوجية التي تشكلها الأنواع البكتيرية الأخرى. [بيوفيلم] فصلت مجاميع وخلايا [بلكهتونيك] ببطيئه سرعه طرد, اي كريات [بيوفيلم] وأوراق [بلنكتونيك] خلايا في [سوبرننت]2 (شكل 2[ب]). ثم يتم التعامل مع أنواع الخلايا بشكل منفصل للخطوات اللاحقة في البروتوكول.

المبلغ الموصي به من مدخلات الحمض النووي لرقاقه-seq هو 10-25 ميكروغرام20. في س. ثقافة قارورة التيفوئيد ، 30 ملغ من بيوفيلم غله ما يقرب من 25 ميكروغرام الحمض النووي. منذ المجاميع بيوفيلم لديها وفره من المواد المستخلصة من الخلايا البروتينية ، افترضنا ان هذا من شانه ان تتداخل مع كفاءه الربط عبر. إذا كنا ببساطه لتطبيع أنواع الخلايا المختلفة حسب رقم الخلية ، قد يؤدي علاج الخلايا المسوية إلى كميه غير متساوية من المنتجات المتداخلة المقدمة لايمونوبريسيبيتيشن. اجري فحص البروتين لتحديد الكمية المكافئة من المواد الخلوية المسوية لمطابقه 30 ملغ من بيوفيلم (الشكل 3). 6.0 تم حصاد OD600 من خلايا بلانكتونيك لتتناسب مع 30 ملغ بيوفيلم.

يجب أولا تقسيم مجاميع biofilm بشكل منفصل للسماح بالوصول المتساوي للرابط التبادلي إلى كافة الخلايا. وجدنا ان الطريقة الأكثر موحده وعاليه الانتاجيه لتجانس الخلايا كان يستخدم مطحنه خلاط و 5 مم الفولاذ المقاوم للصدا حبه (الشكل 4ا). وتعامل الخلايا المسوية بنفس الطريقة للحد من المتغيرات في تجربه رقاقه التسلسل (الشكل 4ب).

مره واحده وقد تم تجزئه الحمض النووي من قبل سونيكيشن ، crosslinked ، وتعامل مع RNase و بروتينيه K ، فانه يمكن تصور علي 2 ٪ هلام اجبرز. يتم تقسيم الحمض النووي sonicated إلى مجموعه من الشظايا التي تظهر كمسحه علي هلام اجبرز. ينخفض حجم الجزء المتوسط مع عدد متزايد من الرشقات النارية سونيكيشن (الشكل 5). نقل الطاقة سوف تختلف لوحدات sonicator مختلفه ، لذلك ينصح بفحص سونيكيشن لتحديد عدد رشقات ناريه سونيكيشن المطلوبة لتجزئه الحمض النووي إلى متوسط اقل من 1 كيلوبايت. لتجربتنا المتسلسلة ، اخترنا 5 رشقات ناريه.

مبادئ توجيهيه ترميز يوصي بتاكيد الجسم المضاد الهدف--ربط النشاط مع لطخه المناعي21. في هذه الحالة قمنا بقياس خصوصية الأجسام المضادة لدينا وقوه ملزمه من قبل المناعي علي لست] خليه كامله أعدت لرقاقه (الشكل 6). أكدنا ان الأجسام المضادة تربط إلى CsgD-3xFLAG. الإشارات المضادة للعلم ومكافحه CsgD القولون في الوزن الجزيئي المتوقع (28 كده)22.

الإجراءات رقاقه غالبا ما تسفر عن تركيزات منخفضه من الحمض النووي. ولذلك ، تم اختيار طريقه تنقيه تزيل الملوثات وتحتفظ بنسبه عاليه من الحمض النووي. تم اختيار تنقيه الخرزة المغناطيسية علي أساس العمود تنقيه لأنها تحتفظ تركيزات منخفضه من الحمض النووي رقاقه الإدخال أفضل (الشكل 7) وأزاله الملوثات (البيانات لم تظهر).

بسبب انخفاض كميات البدء من الحمض النووي ، واعداد المكتبة من الحمض النووي رقاقه قد تتطلب محولات المخفف وإثراء PCR. قبل التسلسل ، يمكن تصور المكتبات بواسطة تتبع Bioanalyzer لتاكيد توزيع الحجم الصحيح قبل وبعد إثراء PCR (الشكل 8). بالاضافه إلى ذلك ، إذا كان هناك هدفا تنظيميا معروفا لعامل النسخ ، يجب استخدام qpcr لتاكيد إثراء المناطق الملزمة من خلال مقارنه التغيير القابل للطي (∆ ∆ Ct) بين الهدف المعروف ووفره التسلسل الجيني المرجعي في الحمض النووي الخاص بالإدخال الإيمونوبريسيبيتاتيد والسونيكاتيد.

وينبغي تحليل البيانات رقاقه التسلسل من خلال تعيين درجات الجودة ، وتقليم قواعد الجودة المنخفضة ، والمحاذاة إلى الامام والقراءة العكسية (في التسلسل نهاية الاقتران) ، وتجميع إلى الجينوم مرجع عاليه الجودة ، والعثور علي قمم فوق الخلفية ، وأداء تحليل المصب (الشكل 9ا). وينبغي ان يشمل التحليل النهائي تصور القمم وشرحها ، والاتساق مع العينات البيولوجية المتماثلة ، وتحليل العزر ، ويمكن ان يشمل تحليلا تفاضليا ملزما بين الظروف أو أنواع الخلايا ، وتكامل البيانات مع التعبير الجيني من المسارات المعروفة. النسبة لبيانات الرقاقة المتسلسلة مثل منطقتنا ، ينبغي تحديد القمم علي انها اعلي بكثير من الخلفية (الشكل 9ب ، ج، القضبان الحمراء) مع تحديد القيمة p ، وليس ببساطه عن طريق التغيير المزدوج. وفي التحليل النهائي ، تصور القراءات المعينة في ضوء الشروح الخاصة بالجينوم المرجعي (الشكل 9(د)). والفقراء رقاقه-seq نتيجة تظهر مثل المدخلات المتسلسلة دون اي قمم كبيره فوق الخلفية.

Figure 1
الشكل 1: توضيح الخطوات في الرقاقة المتسلسلة مع الاغشيه البيولوجية البكتيرية. في الاجراء الموصوف ، S. تزرع خلايا التيفوئيد في 1 ٪ تريتوني الثقافة قارورة في 28 درجه مئوية مع اهتزاز (1) ، يتم جمع وسائل الاعلام الخالية من الخلايا المكيفة للتعامل مع أنواع الخلايا بيوفيلم (2) ، والتي تستخدم لجمع كميه كافيه من الخلايا بيوفيلم والمسوي (3). غسلت هذا خلايا مع [ببس] و [هومومنزد] ان يكسر [بيوفيلم] (4). ترتبط البروتينات بالحمض النووي مع الرابط المتقاطع ، وبعد ذلك يتم الربط بين الخلايا لتحرير محتويات الخلايا (5). يتم تجزئه الحمض النووي في الخلية محلله بواسطة سونيكيشن (6). يتم اختيار الحمض النووي المرتبط بالبروتين المستهدف من خلال ايمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة التي تربط البروتين المستهدف والخرز المغناطيسي G البروتين (7). يتم غسلها الحمض النووي المختار والتملص من الخرز المغناطيسي G البروتين (8) وتنقيتها لاعداد المكتبة والتسلسل (9). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نموذج قارورة المختبر للدراسة [تيفوموريوم] [بيوفيلم] تطوير. (ا) ق. خلايا التيفوئيد المزروعة في 1 ٪ الترلون لمده 13 ساعة عند 28 درجه مئوية الخضوع النمط الظاهري التحول إلى شكل المجاميع بيوفيلم والخلايا عوالق في المرحلة السائلة من الثقافة قارورة. (ب) تم فصل المجاميع biofilm والخلايا المسوية من الثقافة قارورة في (ا) من خلال طرد في 210 x g لمده 2 دقيقه. تم حصاد ماده طافي لتحضيرات الخلايا المسوية وتم حصاد بيليه للتحضيرات الخلية بيوفيلم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مجموع تركيزات البروتين للخلايا المسوية وعينات خلايا بيوفيلم التي يتم حصادها من S. [تيموريوم] قارورة ثقافة. وأجريت اختبارات البروتين المتري وقيست مقادير البروتين بالنسبة لمنحني قياسي للجيش الصربي البوسني عند 750 نانومتر. محتوي البروتين من عينات الخلية عوالق تفكيك في 4.0 ، 6.0 ، و 8.0 التطوير التنظيمي الOD600 كانت مقارنه إلى 30 ملغ من المجاميع بيوفيلم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تجانس عينات الخلايا الماخوذه من S. [تيموريوم] [بيوفيلم] قارورة ثقافات. (ا) تم تجانس المجاميع biofilm من الثقافة قارورة أعاده تعليق في تلفزيوني (اليسار) باستخدام مطحنه خلاط في 30 هرتز لمده 5 دقائق (يمين). (ب) تم تجهيز الخلايا المسوية من ثقافة القارورة التي أعيد تعليقها في الاذاعه التلفزيونية بواسطة مطحنه خلاط في 30 هرتز لمده 5 دقائق لضمان الاتساق بين عينات نوع الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: فحص صوتنه مع الخلية قبل رقاقه lysates. وقد تم فصل العينات التجميعية والخلايا المسوية والمتجانسة والمتداخلة والمتصلبة. وكانت مركبات الحمض النووي البروتين سونيكاتيد تصل إلى 8 مرات في 30 ثانيه علي و 2 دقيقه قباله علي الجليد لكسر الحمض النووي إلى شظايا أصغر. تم فصل جزء من محلله السونار علي 2 ٪ هلام اجبرز. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحديد الهدف الملزم للأجسام المضادة للعلم المستخدمة في الرقاقة المتسلسلة. تم تقييم خصوصية الأجسام المضادة عن طريق المناعة ضد الخلايا الكاملة المعدة من الثقافات قارورة من S. سلالات التيتيموريريوم كما هو مبين. سلاله ∆ csgd + p3xFLAG/csgd و WT بيوفيلم العينات تمثل المجاميع بيوفيلم حصادها من قوارير ، في حين ان سلاله ∆csgd ± p3xFLAG والخلايا المسوية wt تمثل خلايا بلانكتونيك. تنقيه له-الموسومة CsgD تم تحميله كعنصر تحكم. وقد تم تطبيع الخلايا الكاملة بحيث تم تحليل 30 ميكروغرام من البروتين الكلي في كل حاره. تشير الأرقام علي اليسار إلى الحجم (في كده) لعلامات الوزن الجزيئي الملطخة مسبقا. الأجسام المضادة الاوليه المستخدمة للطخه العلوي كان الأرانب المناهضة للعلم الأجسام متعددة الأضلاع (سيغما-الدريتش #F7425) ، في حين تم احتضان لطخه السفلي مع الأرنب المضادة للعلم جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الاحاديه الخاصة CsgD2. الماعز مكافحه الأرنب مفتش (LiCor IRDye 680 RD ، 925-68071) والماعز المضادة للماوس مفتش (LiCor IRDye 800CW ، 925-32210) واستخدمت الأجسام المضادة الثانوية. وقد تم تصور إشارات الفلورسنت باستخدام نظام التصوير اوديسي CLx و Image Studio 4.0 حزمه البرمجيات (لي-كور العلوم الاحيائيه). يتم عرض الصور التمثيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استراتيجيات التنقية القائمة علي الخرزات العمودية أو المغنطيسية للكميات الصغيرة من الحمض النووي الناتجة عن تجارب الرقاقات المتسلسلة. تم تنقيه عينات من الكميات المعروفة من الحمض النووي باستخدام مجموعات العمود القائم أو الخرز المغناطيسي وتم قياس تركيز الشطف بعد التنقية. وأظهرت الخرز المغناطيسي انتعاشا أفضل عند مستويات منخفضه من الحمض النووي ، علي غرار الكميات المنخفضة من الحمض النووي التي تصادف عاده في نهاية بروتوكول رقاقه التسلسل ، ولكن قبل اعداد المكتبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الاستعدادات رقاقه الحمض النووي والمكتبات اللاحقة تصورها بيومحلل. (ا) متوسط حجم جزء من الحمض النووي الجيني بعد تحلل الخلية وكان صوتنه < 1000 bp ، مع غالبيه شظايا في نطاق bp 200-500. (ب) كانت المواد الاوليه لاعداد المكتبات دون الكشف عنها. (ج) ربط المحول وإثراء PCR يسمح بتضخيم أجزاء المكتبة. (د) ان اعداد المكتبات الرديءه له مستويات منخفضه من الحمض النووي ، أو قمم الوزن الجزيئي الفردية أو العالية ، أو قمم المحولات الوفيرة عند حوالي 100 bp. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: يتم تحليل بيانات الرقاقة المتسلسلة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية وتصور علي متصفح الجينوم. ا. مخطط انسيابي للتحليل المعلوماتي البيولوجي النموذجي لبيانات الرقاقة المتسلسلة. تم تنظيف القراءات الخام ل بيوفيلم (∆csgd سلاله + p3xFLAG/csgd) والخلايا بلانكتيتونيك (∆csgd + p3xFLAG) للقراءة منخفضه الجودة والمحولات ، وتعيينها إلى S. 14028s الجينوم (NC_016856 .1 لكروموسوم و NC_016855 .1 ل plasmid) بواسطة Bowtie2 (v 2.3.3.1) مع المعلمات الافتراضية23. تم استخدام MACS2 (v 2-1-2) لاستدعاء القمم مع المعلمات من '-q 0.01-nomodel ' ، مع الأخذ بيوفيلم نسخا متماثلة كما اختبار مجموعات البيانات والتي عوالق مثل السيطرة24. واستخدمت الوحدة النمطية MACS2 bdgcmp كذلك لتوليد مسار الإثراء اضعاف مع المعلمات من '-m FE '. تم تحويل ملف ذروه كبيره مع المسار الإثراء اضعاف إلى ملف شعر مستعار باستخدام بيدادو/بيدكليب/بيدجراتويجيغ25 وتصور علي الجينوم المرجعي باستخدام التكامل الجينوم عارض v 2.5.126. وتظهر قمم تمثيليه (القضبان الحمراء). (ب) منطقه كبيره من ~ 40 kbp ، الذي يحتوي علي قمم متعددة ، هو نتيجة غير نمطيه ولكن لا يزال من المحتمل ان تكون ذات قيمه. (ج) وهذه نتيجة أكثر شيوعا ، تظهر منطقتين من مناطق الذروة الهامه. (د) التكبير في الذروة اليسرى في C ، والتي تبين قراءه الخرائط إلى منطقه S. 14028s الجينوم الذي يحتوي علي المروجين مختلفه ل Uspa و uspa. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المخازن المؤقتة لتحلل الخلية
تحلل المخزن المؤقت
50 mM تريس-HCl pH 8.1
10 مم أدتا
1% SDS
مثبطات الانزيم البروتيني
المخزن المؤقت لتخفيف IP
20 مم تريس-HCl pH 8.1
2 مم أدتا
150 mM NaCl
1% تريتون X-100
0.01% SDS
مخازن ايمونوبريسيبيتيشن المؤقتة
مخزن الملكية الفكرية غسل العازلة 1
20 مم تريس-HCl pH 8.1
2 مم أدتا
50 mM NaCl
1% تريتون X-100
0.1% SDS
IP غسل العازلة 2
10 مم تريس-HCl pH 8.1
250 mM LiCl
1 مم أدتا
1% NP-40
1 ٪ حمض ديكسيتشوليك
TE (T10E1) pH 8.0
10 ملم تريس-HCl
1 مم أدتا
المخزن المؤقت الelution
1% SDS
100 مم NaHCO3

الجدول 1 وصفات العازلة.

Discussion

هذا البروتوكول يحدد تقنيه لأداء رقاقه-seq مع السالمونيلا معوي سيرفار المكورات المعوية بيوفيلم وخلايا عوالق من الثقافة البحتة ، للعثور علي الأهداف التنظيمية للمنظم بيوفيلم الرئيسي ، csgd. ونحن نتوقع المعلومات التفاضلية الملزمة بسبب الاستقرار ثنائي csgd في نوعي الخلية ، مع مستويات عاليه في المجاميع بيوفيلم ومستويات منخفضه في الخلايا عوالق2،3. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية علي عوامل النسخ البكتيرية الأخرى ، وأنواع الخلايا ، أو ظروف النمو. وعلي وجه الخصوص ، يمكن تكييف هذه التقنية مع العوامل البيولوجية البكتيرية الأخرى باستخدام عامل تحويل محدد بالتجربة لوحده التشكيل الثنائية لكل وزن للوحدة من خلايا بيوفيلم.

رقاقه-seq يمكن ان تكون عرضه لتضخيم الخطا الفني من خلال التسلسل; ومع ذلك ، يمكن تاكيد في الخطوات الهامه منع هذا27. خصوصية الأجسام المضادة الاوليه مهمة لاختيار عامل النسخ المستهدف فقط والحمض النووي الذي يتحكم به خلال ايمونوبريسيبيتيشن7. وفي هذه التجربة ، تم دمج Csgd في علامة 3xFLAG المرمزة بالبلازما في 3 ' نهاية الجين ، والتي تتوافق مع المحطة C من csgd22. تم استخدام البلازميد p3xFLAG بدون csgd ك "السيطرة" (S. التيتيموريريوم 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). مبادئ توجيهيه ترميز يوصي بأداء المناعة مع الأجسام المضادة الاساسيه ضد البروتين من الفائدة ، والبقع من سلالات رقاقه وسلالات الحذف21. ومن المهم ضمان ان تكون ظروف النمو متسقة عبر النسخ المتماثلة للحد من التباين في نتائج ربط عوامل النسخ والتسلسل النهائي. ان واحده يكون حريصه ان يضمن [اينكوه] حجوم و[بر-فينوم] حاله نمو شروط متسقة, [بيوفيلم] حاله نمو في قارورة ثقافة متسقة4. من المهم التاكد من ان كل بيوفيلم قد تم كسره بعد التجانس ، لضمان الوصول المتساوي للكواشف ، وخاصه الفورمالديهايد عبر رابط ، إلى جميع الخلايا.

قد تمكن العديد من التعديلات الباحثين من استخدام هذا البروتوكول للبروتينات الأخرى التي تربط الحمض النووي ، وأنواع الخلايا ، والسلالات ، وظروف النمو ، أو معدات المختبر. إذا تم استخدامه للأنواع التي تشكل بيوفيلم غير S. التيفوئيد, عامل التحويل من مستعمره تشكيل وحدات لكل وحده الوزن بيوفيلم يحتاج إلى تحديد تجريبي من خلال حصاد كميات مختلفه من بيوفيلم, المجانسة بيوفيلم جيدا, وأداء التخفيفات التسلسلية والعد لوحه لخلق منحني القياسية, التي قد لا تكون دقيقه في الأوزان بيوفيلم اقل2. Sonicator نقل الطاقة ومقاومه نوع الخلية قد تختلف; ولذلك ، ينصح بفحص سونيكيشن للعثور علي عدد من رشقات ناريه سونيكيشن التي سوف تنتج نطاق حجم الجزء المطلوب لاعداد المكتبة المصب والتسلسل11. تفتيت الكروماتين بواسطة النوكوكال المجهرية هو بديل سونيكيشن التي تنتج عاليه الدقة من مواقع الشغل. ومع ذلك ، قد يعرض هذا الأسلوب التحيزالتجزئة 7,28. ويمكن تغيير نطاق حجم الحمض النووي اعتمادا علي مجموعات اعداد المكتبة المصب ومنصات التسلسل. ويمكن استخدام أساليب أخرى من التجانس بدلا من مطحنه خلاط. علي سبيل المثال ، قد يتم استبدال الخالط الانسجه الزجاجية ، ولكنها قد ايرودوليز أو تفكك بشكل غير كامل حتى biofilm. وفيما يتعلق بالضوابط ، يمكن تطبيع الحمض النووي قبل الإيمونوبريسيبيتاتي في المعالجة والتحليل بعد التسلسل. ويمكن استخدام التحكم وهميه IP مع مصل الأجسام المضادة الطبيعية المتطابقة الأنواع كعنصر تحكم وكذلك13.

يجب علي الباحثين النظر في القيود المفروضة علي هذه الطريقة عند النظر في تجربه الرقاقة المتسلسلة. قد تكون هناك حاجه إلى تعديلات كبيره للتكيف مع أنواع بيوفيلم أخرى. علي سبيل المثال ، مع السالمونيلا القابلة لأعاده التعليق الفوري من بيوفيلم في الاذاعه التلفزيونية يؤدي إلى فقدان قابله للقياس من المجاميع بيوفيلم. ايمونوبريسيبيتيشن استهداف الأهداف التنظيمية لعوامل النسخ في البكتيريا قد يؤدي إلى كميات صغيره جدا من الحمض النووي ، وهو تحد لتنقيه والكشف في الخطوات اللاحقة. يمكن تقديم التحيز اثناء القص والتلاعب المصب اثناء الكشف عن المكتبة9. الاضافه إلى ذلك ، لا يكشف هذا الأسلوب في مستويات التعبير المجرية استجابه لربط عامل النسخ. الباحثين الذين لديهم خبره قليله في المعلوماتية الحيوية قد يكون تحديا من قبل خط أنابيب التحليل. ويمكن ان تكون هذه الطريقة كثيفه الوقت ومكلفه ؛ ومع ذلك ، فان تكلفه التسلسل غالبا ما تكون اقل من المصفوفة الصغيرة وتتناقص مع مرور الوقت مع استمرار التحسينات التكنولوجية.

يصف قليل من طرق في الأدب رقاقه مع جراثيم, وكثير تجارب جرثوميه يبدا مع بسيطه حاله نمو شرط13,14,15,17,18. رقاقه اعداد عينه مع خلايا واحده واضحة ويقدم التحديات اقل من اعداد عينه رقاقه مع المجاميع بيوفيلم. اما بالنسبة لرقاقه-seq ،وقد استكملت الأساليب السابقة لدراسة الدوائر التنظيمية كومنولث الدول المستقلة ، بما في ذلك التطور المنهجي لل يغاندس عن طريق الإثراء الاسي (selex) ، اختبارات تحول التنقل الكهربي (emsa) ، رقاقه تشيب ، وحذف المروج وتحليل مراسل أو استبدالها رقاقه-seq رقاقه-seq هو استبدال رقاقه تشيب بسبب التكنولوجيات المتقدمة وتوافر التسلسل. ويوفر التسلسل العميق للباحثين كميات هائله من البيانات التي يمكنها تحديد المواقع ذات التقارب الملزم الأقل ودقه الزوج القاعدي الأعلى مع مواد بدء اقل من رقاقه تشيب11,30. تحليل البيانات رقاقه من الكائنات الحية مع جوده عاليه الجينوم المرجعي عموما سريعة ومحدده. بالاضافه إلى ذلك ، رقاقه-seq هو طريقه شامله لاكتشاف في سيليكو توقع المواقع ملزمه التي قد لا تكون مشغولة في جميع أنواع الخلايا ، ومرحله النمو ، أو الظروف البيئية31.

في المستقبل ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتسهيل فهم المرض البكتيري ، وخاصه الكائنات الحية التي تشكل البيوفيلم. الاعتماد الواسع لهذه التقنية وتوافر مجموعات البيانات الجديدة يمكن ان يؤدي إلى تكامل المعطيات لتحديد مجموعات من البروتينات التي تشارك في التحكم في العمليات الخلوية في الكائنات المجهرية التي تشكل بيوفيلم-32. الاضافه إلى ذلك ، يمكن دمج البيانات المتسلسلة بين الرقاقة والجيش الملكي النيبالي لبناء نماذج النظام التنظيمي33.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا البحث بمنحه من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (NSERC) (#2017-05737) إلى فصيل عبد القادر ومن خلال كرسي Jarislowsky في التكنولوجيا الحيوية. وكان النائب مدعوما بمنحه دراسية من خلال برنامج التدريب المتكامل في الامراض المعدية وسلامه الاغذيه والسياسة العامة (ITraP) في جامعه ساسكاتشوان.

ويود المؤلفون ان يشكروا داني دايل علي التصوير والتحرير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, (5418), 1318-1322 (1999).
  2. MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83, (6), 2312-2326 (2015).
  3. Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192, (2), 456-466 (2010).
  4. MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
  5. Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45, (2), 502-531 (2012).
  6. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
  7. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10, (10), 669-680 (2009).
  8. Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
  9. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5, (9), 829-834 (2008).
  10. Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
  11. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, (8), 651-657 (2007).
  12. Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436, (7052), 876-880 (2005).
  13. Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76, (5), 1250-1265 (2010).
  14. Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87, (3), 526-538 (2013).
  15. Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198, (21), 2985-2999 (2016).
  16. Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5, (1), 10469 (2015).
  17. Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8, (3), 1002621 (2012).
  18. Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10, (3), 1003984 (2014).
  19. Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58, (6), 703-708 (2012).
  20. Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, (9), 1813-1831 (2012).
  22. MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15, (6), 1008233 (2019).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, (4), 357-359 (2012).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, (9), 137-139 (2008).
  25. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, (6), 841-842 (2010).
  26. Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, (2), 178-192 (2013).
  27. Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6, (10), 26015 (2011).
  28. Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19, (6), 967-977 (2009).
  29. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9, (5-6), 362-373 (2010).
  30. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4, (8), 613-614 (2007).
  31. Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298, (5594), 799-804 (2002).
  32. Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65, (1), 21-26 (2007).
  33. Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics