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使用染色质免疫沉淀和高通量测序(ChIP-seq)发现沙门氏菌生物膜中的CsgD监管目标

Genetics
 

Summary

染色质免疫沉淀与下一代测序(ChIP-seq)相结合,是一种用于建立转录因子与其控制的基因组序列之间的相互作用的方法。该协议概述了使用细菌生物膜执行ChIP-seq的技术,以沙门氏菌肠杆菌菌膜为例。

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Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).

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Abstract

染色质免疫沉淀,然后是测序(ChIP-seq)是一种可用于发现转录因子、组蛋白修饰和其他DNA相关蛋白质的调控靶点的技术。ChIP-seq 数据还可用于查找不同环境条件或细胞类型中转录因子的差分结合。最初,ChIP是通过微阵列(ChIP芯片)的杂交执行;然而,通过技术进步、减少测序的财务障碍和大量高质量的数据输出,ChIP-seq 已成为首选方法。本协议描述了用细菌生物膜(持续和慢性感染的主要来源)进行ChIP-seq的技术。ChIP-seq对沙门氏菌进行血清素型血球生物膜和浮游细胞,以主生物膜调节器CsgD为目标,以确定两种细胞类型的差分结合。在这里,我们演示了要收获的适当数量的生物膜,归一化为平面控制样品,对交叉链接器访问进行均质化生物膜,并执行常规 ChIP-seq 步骤以获得高质量的测序结果。

Introduction

细菌生物膜,嵌入自产基质的细胞结构聚合体,对干燥、抗生素和宿主免疫反应具有抗药性1。因此,它们会导致持续和慢性感染,并由于其生存和传播的解决方案给研究人员带来独特的挑战。沙门氏菌肠血清素型图(S.Typhimurium) 已发现,它建立了对干燥和抗生素具有抗药性的生物膜聚集体,以及当暴露于环境压力(28°C,限制营养)2 时在纯培养中表达毒性因子的浮游细胞。这两种细胞类型产生是由于主生物膜调节器CsgD3的双稳态表达。我们假设这可能是沙门氏菌的押注对冲策略,其中浮游细胞参与短期传播,生物膜细胞能够长期在环境中存在,直到有机会感染新的宿主出现2,4。控制csg操作器表达式的许多监管元素都很好地描述了5。然而,除了adrAcsg operon6之外,很少知道CsgD的监管目标。识别 CsgD 监管网络将有助于我们更好地了解沙门氏菌的生命周期以及生物膜在传播中的作用。

染色质免疫沉淀后,高通量测序(ChIP-seq)是一种强大的体内技术,用于全基因组识别蛋白质-DNA相互作用,并提供涉及转录因子、组蛋白修饰或核小体7的调控过程信息。较新的研究已经使用这种技术来评估生长条件和细胞类型8之间的差别蛋白结合。在染色质免疫沉淀(ChIP)中,通过抗体选择靶蛋白,与相互作用的蛋白质的DNA片段得到丰富。细胞被收获,DNA结合蛋白通过甲醛交叉链接处理与体内的DNA交叉链接。细胞被裂解,释放细胞内容物,染色质被切成大约200-600 bp片段7。与靶蛋白结合的DNA片段使用抗体进行免疫沉淀,通过去交联分离分离,然后进行蛋白质消化9。这些DNA片段代表蛋白质结合位点,通过杂交与微阵列(ChIP芯片)或深度测序和映射到基因组序列10,11进行匹配。虽然ChIP芯片实验产生足够的监管数据,但由于使用昂贵的探头,以及杂交和阵列偏置12,它们是有限的。与ChIP芯片7相比,ChIP-seq具有更大的动态范围,具有更高的核苷酸分辨率和覆盖范围,提高了信噪比,工件更少。

ChIP 已用于分析沙门氏菌血清素 Typhimurium13,14,仲裁感应阿芙A调节在维布里奥藻基利物15, RpoS 调节在埃舍ichi 大肠杆菌16,毒性调节器EspR法规在分枝杆菌结核病17,潜在的二聚氰酸酯环酶通过AmrZ法规在伪单子aeruginosa18,以及VraSR金黄色葡萄球菌19。细菌ChIP-seq实验,已经描述开始生长细胞在液体介质和收获在单细胞的形式。然而,对生物膜和相应的基因调控的分析代表了一组新的挑战,以产生成功的ChIP-seq协议。在此协议中,ChIP-seq 用于查找 CsgD、 S 的差别监管目标。在生物膜和浮游细胞类型中,Typhimurium 主生物膜调节器。该协议描述了用于确定ChIP-seq适当数量的生物膜、从烧瓶培养中收获生物膜、使生物膜和单细胞控制样品标准化、生物膜均质化和完全免疫沉淀的技术。这将有助于研究细菌生物膜中的调节目标,并可适用于许多物种。

Protocol

1. 葡萄球培养细胞生长

  1. 从冷冻库存中,用适当的抗生素在LB琼脂(100 mm Petri板中20mL固体介质)上繁殖沙门氏菌血清素Typhimrium菌株,并在37°C孵育16-20小时,以获得分离的菌落。
  2. 在 25 mm x 150 mm 硼硅酸盐培养管中接种含有适当抗生素的 5 mL LB 肉汤,从步骤 1.1 起从条纹板中分泌 1⁄3 菌落。在 37°C 下孵育,在 200 rpm 下摇动 7 小时。
  3. 使用分光光度计测量肉汤培养的OD600。在 2 mL 比色皿中稀释 PBS 中 1 分之 4 的培养基,并在 600 nm 处测量吸光度。我们发现,在这一步中,最关键的因素是增长时期。OD 值用于规范化培养物,以在步骤 1.4 中提供所需的单元格数。
  4. 将1.0 OD600体积相当于细胞培养物(即+109细胞)添加到含有100 mL 1%胰酮的Erlenmeyer烧瓶中,使用适当的抗生素。在 28°C 孵育,在 200 rpm 下摇动 13 小时。
    注意:生物膜细胞将显示为聚合片状,单个平面细胞位于多云介质中。

2. 收集无细胞条件 1% 胰锥酮

  1. 收集无细胞条件1%胰酮的烧瓶培养。移液器烧瓶培养在加入离心管之前混合多次。
  2. 在12,000 x g下离心10分钟,在10°C下对所有细胞进行颗粒。
  3. 将上清液放入0.2 μm过滤单元、真空过滤器中,并放入新管中。
    注意:生物膜骨料在传统溶液(如PBS)中是附着的,会粘附在管和移液器尖端的侧面。由于它允许更容易操作,我们使用条件介质(1% 试穿酮)最初移动生物膜,并在交联之前立即使用暖PBS(步骤4.5)来去除介质中可能存在的任何蛋白质交联基质。

3. 将生物膜和木板细胞从烧瓶培养物中分离出来2

  1. 使用无菌 25 mL 移液器,将等分烧瓶培养成 15 mL 管。以低速(210 x g)离心2分钟,分离两种细胞类型。
    注意:生物膜细胞应在管底部形成松散的颗粒
  2. 将含有木板细胞的上清液移入两个40 mL离心管中,供以后使用(步骤5)。取出所有剩余的液体,小心不要干扰颗粒。重复上述步骤,直到细胞类型与所有烧瓶培养基分离。

4. 制备生物膜聚合体

注意:生物膜以湿重收获,产生25μg的DNA,这是ChIP推荐的最小起始材料。S的生物膜转化因子(BCF)Typhimurium 是 1.73 x 108 CFU/mg2。准备其他生物膜类型的研究人员需要根据经验确定生物膜单位重量的细胞数量,该细胞数量用于使用此等式查找 25 μg DNA 起始材料所需的生物膜重量:
Equation 1

  1. 准确称量 2 mL 卡帽或螺钉盖管。
  2. 将生物膜颗粒悬浮在1 mL的调节性胰胶中。将重新悬挂的生物膜移入预称重的 2 mL 卡帽或螺钉盖管中。
  3. 在 20°C 下在 11 000 x g下离心 1 分钟
  4. 小心地从管中取出所有上清液,并准确称量管。用生物膜从管子的重量中减去管的重量,以找到生物膜的重量。它应该是目标生物膜重量的±10%。
  5. 洗涤细胞以去除剩余的条件胰锥体。将 1 mL 的暖 PBS 加入管中,轻轻涡旋以重新悬浮颗粒。在8 000 x g下将3分钟离心到颗粒生物膜,并去除上清液。将 1 mL 的 PBS 添加到管和涡流中,以重新悬浮颗粒。

5. 制备浮游细胞

  1. 使用分光光度计记录低速离心(步骤 3.2)的浮游植物上清液的体积和 OD600
  2. 计算最终 OD600的 6.0 所需的交易量:
    Equation 2
  3. 通过离心将离心机冷却至10°C和沉淀浮游细胞(10,000 x g,10°C时10分钟)
  4. 取出上清液,并在步骤 5.2 中计算的 PBS 最终体积中重新悬浮细胞颗粒。
  5. 使用分光光度计重新测量浮游细胞的 OD600,并将 6.0 OD600木板细胞的体积分配到 2 mL 卡帽或螺钉盖管中。
  6. 使用 PBS 将音量调至 1 mL。

6. 均质细胞

  1. 在每个管中添加一个消毒的 5 mm 不锈钢珠。
  2. 在30 Hz下使用混合磨机进行5分钟的均质化。观察集料管,确认生物膜已经破碎。
  3. 将均质细胞转移到新的1.5 mL管中,避免金属珠。使用 PBS 将音量调至 1 mL。
    注意:对枚举输入单元执行串行稀释,并检查最终单元数是否接近所需或预测数。

7. 蛋白质与DNA的交联

  1. 将新鲜甲醛放入样品管中,最终浓度为1%。在室温下在旋转轮上孵育30分钟。
    注意:甲醛具有腐蚀性、皮肤、眼睛和呼吸刺激物,且易燃。在烟罩中分配。
  2. 将1M甘氨酸添加到125 mM的最终浓度,以停止交联。在室温下在旋转轮上孵育5分钟。

8. 清洗细胞以去除多余的交联器

  1. 在8,000 x g下沉淀细胞3分钟,并去除上清液
  2. 在20μL的25倍蛋白酶抑制剂和500μL的过滤灭菌PBS中重新悬浮颗粒。
  3. 离心管在8000 x g下3分钟,并去除上清液。

9. 莱沙细胞

  1. 在600μL利沙缓冲液中重新悬浮颗粒(参见表1),在冰上孵育10分钟。
  2. 将1.4 mL的IP稀释缓冲液(参见表1)添加到无菌的15 mL管中,并将分瓶细胞移动到15 mL管中。将管子放在冰上1.5~2小时,偶尔轻轻涡旋。
    注意:一些耐药细胞材料可能留在管中。在偶尔涡旋的冰上,长时间的潜伏期会分解材料。其余的将通过声波分解。

10. 通过声波分割DNA

  1. 将 15 mL 管放入冰杯中,并将 3 mm 探头放入管内。
  2. 在 400 W 的 20-40% 下执行 5 次 30 秒的声波轮,在爆裂之间在冰上冷却 2 分钟。
  3. 沉淀材料通过离心(8000 x g,4°C时10分钟)。将上清液转移到新管中。
  4. 可选择在65°C下进行30-60分钟的脱交,在45°C下消化RNA和蛋白质30-60分钟,然后使用2%的角糖凝胶进行运行,以检查正确大小的片段。
    注意:将探头浸入细胞内。在声波和休息时,将溶液放在冰上。当声波探头被脉冲时,请勿拆下管子。溶液应出现多云预声波和清晰的声波后。

11. 免疫沉淀DNA-蛋白质-抗体复合物

  1. 制备
    1. 分配一个1.35 mL等分用于免疫沉淀,一个200μL等分作为输入控制。将输入控制存储在 -80°C,直到执行去交和消化步骤。
  2. 原抗体的免疫沉淀
    1. 在1.35μL等分中加入10μg纯化蛋白特异性原抗体。在旋转的车轮上以4°C孵育过夜。
      注意:主要抗体可以是单克隆抗体、优质多克隆血清或商用表位抗体(即抗FLAG)。
    2. 从步骤11.2.1向管中加入50μL蛋白G磁珠,在4°C下在旋转轮上孵育3小时。
    3. 将 IP 洗涤缓冲液 1、IP 洗涤缓冲液 2 和 TE pH 8.0(参见表 1)放入冰桶中。加热洗脱缓冲液至65°C。
      注意:请勿将含有洗脱缓冲液的溶液放在冰上。
    4. 使用磁性支架将蛋白质 G 磁珠结合到管的一侧
    5. 执行洗涤:用 750 μL 冷 IP 洗涤缓冲液 1 洗 2 次,用 750 μL 冷 IP 洗涤缓冲液 2 洗涤 1x,在 pH 8.0 下用 750 μL 冷 TE 洗 2 次。在进行内河时,将管子放在磁性支架上。
    6. 在每个管中加入450 μL的IP洗脱缓冲液(参见表1),并在65°C下孵育30分钟,每5分钟轻轻涡旋一次。
    7. 使用磁性支架将珠子粘结到管的一侧。至少等待 2 分钟,直到解决方案清晰。
    8. 将清除的上清液分配到新的 1.5 mL 管中,小心不要干扰磁珠颗粒。

12. 脱脱DNA-蛋白质复合物和消化共纯RNA和蛋白质

  1. 将 2 μg RNase A 和 NaCl 添加到每个管的最终浓度为 0.3 M。
  2. 在 65°C、±6 小时或过夜孵育。
  3. 通过在每根管中加入180μg蛋白酶K,然后在45°C孵育3~5小时,完成蛋白质消化。

13. 图书馆编制和排序

  1. 使用磁珠净化DNA
    注意:磁珠是分离在ChIP期间通常用细菌细胞恢复的少量DNA的首选。
  2. 使用与所选排序平台兼容的工具包准备库。
  3. 使用荧光计和广泛的 dsDNA 试剂盒或 qRT-PCR 库定量套件检查库浓度。
    注:根据我们的经验,荧光计测量可能高估了DNA浓度。
  4. 池库,占每个库示例的足够覆盖率。对于使用沙门氏菌进行光明对测序,我们汇集了10-12个库。将 Tris-HCl pH 8.0 添加到 1 mM 的最终浓度中。
  5. 根据所选平台的规格进行序列。

Representative Results

从细菌生物膜制备染色质免疫沉淀样品需要几个步骤,如图1所示。其中包括在烧瓶培养中生长生物膜、收集条件介质、收集足够量的生物膜和浮游细胞作为对照、PBS中的洗涤细胞、均质化、蛋白质与DNA的交联、裂解细胞、通过声波分割DNA、用适当的抗体和蛋白质G珠子进行免疫沉淀DNA、洗涤和稀释免疫沉淀DNA,以及纯化DNA进行库制备和测序。

生物膜诱导条件下在液体培养条件下生长的Typehimurium细胞经过表型转换,形成多细胞生物膜聚合体和浮游细胞。该种群将包含大约 40% 的生物膜聚合物,这些聚合物表示较高水平的二甘草环酸 (DGCs) 和生物膜调节器,以及 60% 的浮游细胞,这些细胞表示较高水平的毒性相关基因2、4图 2A)。在此协议中,我们描述了一种通过 ChIP-seq 采集两种细胞类型以比较转录位点的方法;然而,该协议可以适用于由其他细菌物种形成的其他类型的生物膜。生物膜聚合体和浮游细胞通过低速离心分离,这种离心在上清2中颗粒生物膜并留下浮游细胞(图2B)。然后,在协议中后续步骤中分别处理细胞类型。

ChIP-seq的DNA输入推荐量为10-25μg20。在S 中。Typhimurium烧瓶培养,30毫克生物膜产生约25μgDNA。由于生物膜聚合体含有大量蛋白质细胞外物质,我们推测这将干扰交联的效率。如果我们只是按细胞数使不同细胞类型正常化,对浮游细胞的治疗可能会导致免疫沉淀的交联产物数量不等。进行了蛋白质测定,以确定与30毫克生物膜相匹配的浮游细胞物质的等效量(图3)。6.0 OD600的木板细胞被收获,以匹配30毫克生物膜。

生物膜聚合体必须首先分离,以便允许交叉链接器平等进入所有细胞。我们发现,使细胞均匀化的最均匀、高通量的方法是使用搅拌机磨机和5毫米不锈钢珠(4A)。在ChIP-seq实验中,对浮游细胞进行相同的处理,以减少变量(4B)。

一旦DNA被声波、交联和用RNase和蛋白酶K处理而破碎,就可以在2%的糖凝胶上可视化。声波DNA被分解成片段的集合,这些片段在糖凝胶上显示为涂片。平均片段大小随声波爆发次数的增加而减小(图5)。能量转移因声波单元而异,因此建议进行声波测定,以确定将DNA片段到平均小于1 kb所需的声波爆发次数。对于我们的ChIP-seq实验,我们选择了5个突发。

ENCODE指南建议用免疫球体21确认抗体靶结合活性。在本例中,我们测量了用于ChIP制备的全细胞解液的免疫球体结合的抗体的特异性和强度(图6)。我们确认抗体与CsgD-3xFLAG结合;抗FLAG和抗CsgD信号在预期分子量(28kDa)22处共位。

ChIP程序通常产生低浓度的DNA。因此,选择了去除污染物并保留高比例DNA的纯化方法。磁珠纯化选择在基于柱的纯化,因为它保留了低浓度的输入ChIP DNA更好(图7)和去除污染物(数据未显示)。

由于DNA的起始量减少,ChIP DNA的库制备可能需要稀释适配器和PCR浓缩。在测序之前,可以通过生物分析仪跟踪来可视化库,以确认PCR富集前后的正确大小分布(图8)。此外,如果存在转录因子的已知调控靶点,qPCR 应通过比较免疫沉淀和声波输入DNA中已知靶点和参考基因序列丰度之间的折叠变化 (μ Ct) 来确认结合区域的富集。

ChIP 测序数据应通过分配质量分数、修剪低质量基础、对齐正向和反向读取(在成对端测序中)、组合到高质量的参考基因组、查找背景之上的峰值以及执行下游分析(图 9A) 来进行分析。下游分析应包括峰的可视化和注释、与生物复制样本的一致性和主题分析,并可包括条件或细胞类型之间的差分结合分析,以及数据与已知通路的基因表达的集成。对于 ChIP-seq 数据(如我们的数据),峰值应标识为明显高于背景(图 9B、C、红柱),具有p值确定,而不仅仅是通过折叠变化。归根结底,映射的读取数据是参照基因组的注释(9D)。较差的 ChIP-seq 结果将显示为输入 seq,在背景之上没有任何显著的峰值。

Figure 1
图1:用细菌生物膜说明ChIP-seq中的步骤。在所述过程中,S.Typhimurium细胞在28°C的Tryptone烧瓶培养中生长,摇摇(1),收集无细胞条件介质处理生物膜细胞类型(2),用于收集足够量的生物膜和浮游细胞(3)。这些细胞用PBS洗涤并同质化,以分解生物膜(4)。蛋白质与甲醛交联剂与DNA交联,之后细胞被解释以释放细胞内容物(5)。细胞裂拉中的DNA被声波(6)分割。DNA与靶蛋白交联是通过免疫沉淀与与靶蛋白和蛋白G磁珠(7)结合的抗体选择的。从蛋白质G磁珠(8)中清洗和洗脱选定的DNA,并纯化为库制备和测序(9)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:用于研究S的体外烧瓶模型。Typhimurium 生物膜开发。AS.在28°C下,在1%胰腺素中生长的Typhimurium细胞在28°C下进行表型切换,在烧瓶培养的液相中形成生物膜聚合体和浮游细胞。(B) A)中烧瓶培养的生物膜聚合体和浮子细胞通过210 x g离心分离2分钟。上清液被收获用于浮游细胞制剂,颗粒被收获用于生物膜细胞制剂。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:从S采集的浮游细胞和生物膜细胞样本的总蛋白质浓度石嘴兽烧瓶文化。进行了色度蛋白测定,在 750 nm 处测量了相对于 BSA 标准曲线的蛋白质量。在4.0、6.0和8.0 OD600的脂质板细胞样本中,蛋白质含量与30毫克生物膜聚合相比。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:来自S的细胞样本的同质化。Typhimurium 生物膜瓶培养。A) 在PBS(左)中重新悬浮的烧瓶培养物的生物膜骨料在30Hz下使用混合器进行均质化5分钟(右)。(B) 在PBS中重新悬浮的烧瓶培养素的浮游细胞由混合机在30Hz下处理5分钟,以确保细胞类型样品之间的一致性。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:使用前ChIP细胞解压物的声波测定。生物膜聚合和浮游细胞样本分离、均质、交联和分生。DNA-蛋白质复合物在30秒和2分钟的冰上被声波高达8次,将DNA分解成更小的碎片。声波莱沙的一部分在2%的甘蔗凝胶上分离。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:ChIP-seq中使用的抗FLAG抗体的目标结合特异性。抗体特异性是通过免疫印菌对从S烧瓶培养物制备的全细胞解液来评估的如图所示,类型菌株。应变 =p3xFLAG/csgD和 WT 生物膜样品表示从烧瓶中采集的生物膜聚合体,而应变=csgD = p3xFLAG 和 WT 木板细胞表示浮游细胞。纯化的他标记的 CsgD 加载为控件。全细胞乳酸被标准化,使每个通道共分析30μg的总蛋白质。左侧的数字是指预染色的分子量标记的大小(以 kDa 表示)。用于上斑点的主要抗体是兔子抗FLAG多克隆抗体(西格玛-阿尔德里希#F7425),而下斑点与兔子抗FLAG结合CsgD特异性单克隆抗体2孵育。山羊抗兔IgG(利科IRDye 680RD,925-68071)和山羊抗小鼠IgG(利科IRDye800CW,925-32210)被用作二次抗体。使用奥德赛 CLx 成像系统和图像工作室 4.0 软件包(Li-Cor 生物科学)对荧光信号进行可视化。将显示具有代表性的图像。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:基于柱或磁珠的纯化策略,用于ChIP-seq实验产生的少量DNA。使用柱基试剂盒或磁珠对已知数量的DNA样本进行纯化,并在纯化后测量了脱氧核糖核酸的浓度。磁珠在低DNA水平下表现出更好的恢复,类似于在ChIP-seq协议结束时,但在NGS库制备之前通常遇到的低量DNA。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:由生物分析仪可视化的ChIPDNA制剂和随后的库。A) 细胞裂核和声波后基因组DNA的平均片段大小为<1000 bp,大部分片段在200-500 bp范围内。(B) 图书馆准备的起始材料低于检测。(C) 适配器连接和 PCR 扩增允许扩充库片段.(D) 较差的库制备具有低DNA峰、奇形或高分子量峰,或丰量适配器峰值约100 bp。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图9:使用生物信息工具分析ChIP-seq数据,并在基因组浏览器上可视化。A. 用于对 ChIP-seq 数据进行典型生物信息分析的流程图.生物膜(*csgD应变 + p3xFLAG/csgD) 和木板细胞(*csgD = p3xFLAG)的生读取被清洁为低质量读取和适配器,并映射到STyphimurium 14028s 基因组(NC_016856.1 表示染色体,NC_016855.1 表示质粒),由 Bowtie2 (v2.3.3.1) 提供,默认参数为 23。MACS2 (v2.1.2) 用于调用具有参数"-q 0.01 -- nomodel"的峰值,将生物膜复制作为测试数据集,将浮游生物复制作为控制24。MACS2 bdgcmp 模块还用于生成具有"-m FE"参数的折叠扩充轨道。显著的峰值文件与折叠富集轨道被转换成一个假发文件使用床具/床夹/床图大威格25,并使用综合基因组查看器v2.5.126在参考基因组可视化。显示代表性峰值(红色条形)。(B) 包含多个峰值的 ±40 kbp 的大区域是非典型结果,但仍具有潜在价值。(C) 这是一个更典型的结果,显示了两个重要的峰值区域。(D) 在 C 中放大左峰,显示到 S 区域的读取映射Typhimurium 14028s基因组包含美国pAuspB的发散启动子。请点击此处查看此图的较大版本。

细胞莱沙缓冲液
莱西缓冲器
50 mM Tris-HCl pH 8.1
10 mM EDTA
1% SDS
蛋白酶抑制剂
IP 稀释缓冲器
20 mM Tris-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
150 mM 纳Cl
1% 特里顿 X-100
0.01% SDS
免疫沉淀缓冲液
IP 洗涤缓冲液 1
20 mM Tris-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
50 mM 纳Cl
1% 特里顿 X-100
0.1% SDS
IP 洗涤缓冲液 2
10 mM Tris-HCl pH 8.1
250 mM LiCl
1 mM EDTA
1% NP-40
1%脱氧胆酸
TE ( T10E1) pH 8.0
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
洗脱缓冲液
1% SDS
100 mM NaHCO3

表 1.缓冲区配方。

Discussion

该协议概述了一种使用肠菌种血清素和纯培养体中的浮游细胞执行ChIP-seq的技术,以查找主生物膜调节器CsgD的调控目标。我们预计差异结合信息是由于两种细胞类型中CsgD的双稳定性,生物膜聚合水平高,浮游细胞2、3低水平。然而,这种技术也可以应用于其他细菌转录因子、细胞类型或生长条件。特别是,该技术可应用于其他细菌生物膜,使用实验确定的CFU每单位重量生物膜细胞的转化因子。

ChIP-seq 可通过测序放大技术误差;然而,在关键步骤的确认可以防止这27。原抗体特异性对于在免疫沉淀7期间仅选择靶转录因子及其控制的DNA非常重要。在这个实验中,csgD被融合到基因3'端的质粒编码3xFLAG标记中,对应于CsgD2的C端。不含csgD的p3xFLAG质粒被用作"对照"(S.Typhimurium 14028 [csgD ] p3xFLAG)。ENCODE指南建议用原抗体对感兴趣的蛋白质进行免疫博物,以及ChIP菌株和缺失菌株的解毒物21。必须确保在复制中的生长条件一致,以减少转录因子结合和下游测序结果的可变性。如果谨慎确保接种大小和接种前生长条件一致,烧瓶培养的生物膜生长是一致的4。确认所有生物膜在均质化后均质分离非常重要,以确保试剂,特别是甲醛交叉链接剂平等进入所有细胞。

一些修改可能使研究人员将该协议用于其他DNA结合蛋白、细胞类型、菌株、生长条件或实验室设备。如果它用于生物膜形成物种以外的S.地膜,菌落形成单位每单位重量的生物膜的转换系数需要通过收获不同量的生物膜,使生物膜彻底均匀化,并进行连续稀释和板计数来形成标准曲线,在较低的生物膜重量2下可能不准确。声波能量转移和细胞类型电阻可能不同;因此,建议采用声波测定法,以找出能产生下游库制备和测序11所需的片段大小范围的声波爆发数。微球核酸分片是声波的替代方法,可产生高分辨率的占用场所;然而,这种方法可能会引入碎片偏置7,28。DNA 大小范围可能会根据下游库制备试剂盒和测序平台而改变。其他均质化方法可用于代替混合器磨机。例如,玻璃组织均质器可以替代,但它可能会气溶胶或不完全分解生物膜。在控制方面,免疫前沉淀DNA可以在测序后处理和分析中规范化。具有物种匹配正常抗体血清的模拟IP控制也可以用作控制13。

在考虑 ChIP-seq 实验时,研究人员必须考虑这种方法的局限性。可能需要进行重大修改,以适应其他生物膜类型。例如,在PBS中立即重新悬浮生物膜的沙门氏菌会导致生物膜聚集体可测量的损失。针对细菌转录因子的调节目标的免疫沉淀可能导致非常少量的DNA,这是后期纯化和检测的挑战。在库检测9期间,剪切和下游操作过程中可以引入偏置。此外,此方法不会显示体内表达水平,以响应转录因子结合。缺乏生物信息学经验的研究人员可能会受到分析管道的挑战。此方法可能耗时和昂贵;然而,测序的成本往往低于微阵列,而且随着技术改进的不断进行,成本正在逐渐下降。

文献中很少有方法描述ChIP与细菌,大多数细菌实验开始与一个简单的生长条件13,14,15,17,18。与使用生物膜聚合体制备 ChIP 样品相比,使用单细胞制备 ChIP 样品制备非常简单,且挑战更少。至于ChIP-seq,以前研究顺子调节电路的方法,包括通过指数扩能(SELEX)、电泳移动移位测定(EMSA)、ChIP芯片、启动子删除和报告器分析系统进化配体的方法,已由ChIP-seq29补充或取代。由于技术的进步和测序的可用性,ChIP-seq 正在取代 ChIP 芯片。深度测序为研究人员提供了海量的数据,能够识别具有较低结合亲和力和更高的碱基对分辨率的位点,其起始材料比ChIP芯片11、30更少。从具有高质量参考基因组的生物体中分析ChIP数据通常快速而具体。此外,ChIP-seq 是一种彻底的方法,用于发现在 silico 预测结合位点中,这些位点可能并非在所有细胞类型、生长阶段或环境条件31中都占有。

将来,该协议可用于促进对细菌发病机制,特别是生物膜形成生物的了解。广泛采用这种技术和提供新的数据集可以导致数据集成,以确定蛋白质组,共同本地化,以控制细胞过程的生物膜形成微生物32。此外,ChIP-seq和RNA-seq数据可以集成,以建立监管系统模型33。

Disclosures

提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项研究得到了自然科学和工程研究理事会(NSERC)(#2017-05737)和通过Jarislowsky生物技术主席的资助。通过萨斯喀彻温大学传染病、食品安全和公共政策综合培训方案(ITraP),议员获得NSERC-CREATE奖学金的支持。

作者要感谢丹妮·戴尔的拍摄和编辑。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044

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References

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