माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में परिवर्तन को मापने के लिए एक एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करना

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Biochemistry

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Summary

हम माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में वास्तविक समय के परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए एक बाह्य फ्लक्स एनालाइजर के आवेदन का वर्णन करते हैं।

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Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

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Abstract

स्तनधारी शुक्राणु क्षमता के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में महिला प्रजनन पथ में निषेचन क्षमता प्राप्त करते हैं। क्षमता से जुड़ी प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा की आवश्यकता होती है। एटीपी पैदा करने वाले स्रोतों के बारे में एक चल रही बहस बनी हुई है जो शुक्राणु प्रगतिशील गतिशीलता, क्षमता, हाइपरएक्टिवेशन और परिवर्णी प्रतिक्रिया को ईंधन देता है। यहां, हम माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के आवेदन का वर्णन करते हैं। एच+और ओ2- संवेदनशील फ्लोरोफोरस का उपयोग करना, यह विधि गैर-कैपेसिटेमेंस बनाम कैपेसिटिंग शुक्राणु में वास्तविक समय में ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन की निगरानी की अनुमति देती है। विभिन्न ऊर्जा सब्सट्रेट्स और/या फार्माकोलॉजिकल एक्टिवेटर और/या अवरोधकों की उपस्थिति में इस परख का उपयोग शुक्राणु क्षमता के दौरान संकेत झरना और चयापचय के बीच विभिन्न चयापचय रास्तों और चौराहे के योगदान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री के आवेदन ने मेटाबोलिज्म के अध्ययन में क्रांति ला दी है। लक्षित मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग और मेटाबोलोमिक ट्रेसिंग ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की सटीक निगरानी की अनुमति देते हैं। हालांकि, metabolomics प्रदर्शन सफलतापूर्वक व्यापक प्रशिक्षण, अनुभवी कर्मचारियों की आवश्यकता है, और महंगा, अत्यधिक संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमीटर हर प्रयोगशाला के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है । हाल के वर्षों में, सीहॉर्स एक्सएफ96 जैसे एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करना विभिन्न सेलप्रकार1,2,3,4,5में ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन को मापने के लिए एक किराए की विधि के रूप में लोकप्रिय हो गया है।

शुक्राणु अत्यधिक विशिष्ट मोती कोशिकाएं हैं; जिसका काम ऊसाइट को पैतृक जीनोम देने का है। स्खलन के बाद पुरुष प्रजनन पथ छोड़ने वाले शुक्राणु अभी भी कार्यात्मक रूप से अपरिपक्व हैं और ओसाइट को निषेचित नहीं कर सकते क्योंकि वे ओसाइट्स के वेशभूषा में प्रवेश करने में असमर्थ हैं। शुक्राणु निषेचन क्षमता प्राप्त करते हैं क्योंकि वे एक परिपक्वता प्रक्रिया में महिला प्रजनन पथ के माध्यम से पारगमन करते हैं जिसे कैपेसिटीेशन6,7के नाम से जाना जाता है । काउडा एपिडिडिमिस से विच्छेदित ताजा स्खलन शुक्राणु या शुक्राणु को सीए2 +,बाइकार्बोनेट (एचसीओ3-) या सेल-परगम्य सीएमपी एनालॉग (जैसे, परिभाषित क्षमता मीडिया में ऊष्मायन द्वारा विट्रो में कैपेसिटेड किया जा सकता है। डिस्ब्यूटिरिल-सीएमपी), एक कोलेस्ट्रॉल स्वीकारकर्ता (उदाहरण के लिए, गोजातीय सीरम एल्बुमिन, बीएसए), और एक ऊर्जा स्रोत (जैसे, ग्लूकोज)। कैपेसिटी के दौरान, शुक्राणु अपने गतिशील पैटर्न को एक असममित फ्लैगेलर बीट में संशोधित करते हैं, जो हाइपरएक्टिवेशन8,9नामक तैराकी मोड का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वे कलाबाजी प्रतिक्रिया 7 से गुजरने में सक्षम हो जाते हैं, जहां प्रोटेलिटिक एंजाइम जारी किए जाते हैं जो ओसाइट्स के वेशभूषा को पचाते हैं। इन प्रक्रियाओं में ऊर्जा की आवश्यकता होती है, और दैहिक कोशिकाओं के समान, शुक्राणु ग्लाइकोलिसिस के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल टीसीए चक्र और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलाइजेशन (ऑक्सफोस)10के माध्यम से एटीपी और अन्य उच्च ऊर्जा यौगिकउत्पन्न करते हैं। जबकि कई अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लाइकोलाइसिस आवश्यक है और शुक्राणु क्षमता11,12,13,14का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है, ऑक्सफॉस का योगदान कम स्पष्ट है। अन्य सेल प्रकारों के विपरीत जहां ग्लाइकोलिसिस को टीसीए चक्र के साथ शारीरिक रूप से जोड़ा जाता है, शुक्राणु अत्यधिक विभाजित होते हैं और इन प्रक्रियाओं को अलग-अलग फ्लैगलेवर डिब्बों में बनाए रखने के लिए सोचा जाता है: मिडपीस माइटोकॉन्ड्रियल मशीनरी को केंद्रित करता है, जबकि ग्लाइकोलिसिस के प्रमुख एंजाइम प्रमुख टुकड़े15,16तक सीमित दिखाई देते हैं। इस कंपार्टमेंट के परिणामस्वरूप यह बहस चल रही है कि ग्लाइकोलिसिस द्वारा प्रमुख टुकड़े में उत्पादित पायरुवेट मिडपीस में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सफोस का समर्थन कर सकता है, और क्या मिडपीस में ऑक्सफोस द्वारा उत्पादित एटीपी प्रमुख टुकड़े17,18,19के जिला भागों में ऊर्जा आवश्यकताओं का समर्थन करने के लिए फ्लैगलम की लंबाई के साथ पर्याप्त तेजी से फैलाना करने में सक्षम होगा। शुक्राणु क्षमता में ऑक्सफॉस के लिए एक भूमिका का भी समर्थन है। न केवल ऑक्सफॉस ग्लाइकोलाइसिस की तुलना में अधिक ऊर्जावान रूप से अनुकूल है, जो ग्लाइकोलाइसिस की तुलना में 16 गुना अधिक एटीपी उत्पन्न करता है, बल्कि मिडपीस वॉल्यूम और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री सीधे स्तनधारी प्रजातियों में प्रजनन फिटनेस से सहसंबद्ध होती है जो20साथियों के लिए पुरुषों के बीच प्रतिस्पर्धा की अधिक डिग्री प्रदर्शित करती है। इन प्रश्नों को संबोधित करने के लिए शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सफॉस के सापेक्ष योगदान की जांच करने के तरीकों की आवश्यकता होती है।

टूमेंटे एट अल ने 24-अच्छी तरह से एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर लागू किया ताकि बारीकी से संबंधित माउस प्रजातियों के ऊर्जा चयापचय की तुलना काफी अलग शुक्राणु प्रदर्शन मापदंडों21के साथ की जा सके। गैर-कैपेसिबल शुक्राणु के बेसल ईएआर और ओसीआर मूल्यों की रिपोर्ट करने के बजाय, यहां, हम वास्तविक समय में माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की निगरानी के लिए 96-अच्छी तरह से एक्स्सेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करके उनकी विधि को अनुकूलित करते हैं। हमने एक विधि विकसित की है जो एक साथ शुक्राणु में वास्तविक समय में ग्लाइकोलिस और ऑक्सफॉस की निगरानी करने की अनुमति देती है, जिसमें ऑक्सीजन (ओ2)और प्रोटॉन (एच+)(चित्रा 1A)के प्रवाह को मापकर बारह विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों में फ्लैगेला को मात देता है। ग्लाइकोलाइसिस के दौरान लैक्टेट करने के लिए पाइरुवेट के टूटने और टीसीए-चक्र के माध्यम से सीओ2 के उत्पादन के कारण, गैर-कैपेसिट और कैपेसिट शुक्राणु एक्सट्रूड एच+ परख मीडिया में जो एच + के माध्यम से बाह्य फ्लक्स एनालाइजर द्वारा पता लगाया जाता है+संवेदनशील फ्लोरोफोरस एक सेंसर कारतूस की जांच टिप के लिए स्थिर । समानांतर में, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन द्वारा ओ2 खपत का पता ओ2-संवेदनशीलफ्लोरोफोरस के माध्यम से एक ही जांच टिप(चित्रा 1B)के लिए स्थिर किया जाता है। जारी एच+ का प्रभावी पता लगाने और सेवन किया गया ओ2 को बाइकार्बोनेट या फिनॉल लाल के बिना कम बफरिंग क्षमता के साथ संशोधित शुक्राणु बफर की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, बाइकार्बोनेट की अनुपस्थिति में क्षमता को प्रेरित करने के लिए, हमने व्यापक सीमा वाले पेडे अवरोधक आईबीएमएक्स22के साथ इंजेक्शन वाले सेल-पारगम्य कैपएम्प एनालॉग के उपयोग को अपनाया। तीन अतिरिक्त स्वतंत्र इंजेक्शन बंदरगाह औषधीय सक्रियकों और/या अवरोधकों के इंजेक्शन की अनुमति देते हैं, जो प्रायोगिक हेरफेर के कारण सेलुलर श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस दर में परिवर्तन का वास्तविक समय का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है ।

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Protocol

शुक्राणु 8-16 सप्ताह पुरानी सीडी-1 पुरुष चूहों से एकत्र किए जाते हैं। पशु प्रयोगों को Weill कॉर्नेल मेडिसिन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी थी ।

1. परख से पहले दिन

  1. सेंसर कारतूस और एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर कैलिब्रेटर की तैयारी
    1. सेंसर कारतूस हाइड्रेट करने के लिए, XFe96 एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स परख किट से सेंसर कारतूस को हटा दें और सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट के बगल में उल्टा रखें।
    2. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके डबल-आसुत एच2ओ के 25 मिलील के साथ एक समाधान जलाशय भरें, उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में एच2ओ के 200 माइक्रोन जोड़ें। सेंसर कारतूस को वापस यूटिलिटी प्लेट में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कारतूस के लिए कम से कम 4 घंटे के लिए हाइड्रेटेड की जरूरत है।
    3. एलिकोट 25 मिलीआर एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर कैलिबेंट को 50 मिलीएल शंकुई ट्यूब में बदल कर 37 डिग्री सेल्सियस नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. कोना-लेपित माइक्रोप्लेट की तैयारी
    1. 0.5 मिलीग्राम/एमएल (w/v) स्टॉक तैयार करने के लिए डबल आसुत एच2ओ के 5 मिलीग्राम में कोना के 2.5 मिलीग्राम भंग करें।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, 0.5 मिलीग्राम/mL कांग्रेस ए समाधान के 50 माइक्रोन के साथ एक बाह्य फ्लक्स एनालाइजर 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें। ढक्कन को खुला छोड़ दें और कमरे के तापमान पर रात भर थाली सूखने दें।
      नोट: कई प्लेटों को एक बार में लेपित किया जा सकता है और उपयोग के लिए तैयार होने तक चार सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. शुक्राणु बफर की तैयारी
    1. 138 एमएम एनएसीएल, 4.7 एम एम केसीएल, 1.7 एम सीएसीएल2,1.2 एम एम केएच2पीओ4,1.2 एमएम एमजीएसओ4,5.6 एम एम एम ग्लूकोज, और 1 एमएम एचईपीईएस वाले कम हेप्स के साथ एक्स्सेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर टीवाईएच बफर के 250 मीटर तैयार करें। बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।

2. परख का दिन

  1. कारतूस अंशांकन के लिए तैयारी
    1. यूटिलिटी प्लेट में एच2ओ को एक्सएफ कैलिबेंट प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोन के साथ बदलें और एक गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: कैलिबेंट, बाँझ-फ़िल्टर किए गए पीबीएस के बजाय पीएच 7.4 का उपयोग किया जा सकता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर TYH बफर के 50 मिलीएल गर्मी।
  2. एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के लिए एक वेव टेम्पलेट पैदा करना
    1. एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर चालू करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर होने दें।
    2. वेव सॉफ्टवेयर खोलें और एक खाली टेम्पलेट खोलकर एक नया टेम्पलेट डिजाइन करें (पूरक फ़ाइल 1,वेव टेम्पलेट देखें)।
    3. समूह परिभाषाएं टैब खोलें। परख मीडिया को TYH के रूप में परिभाषित करें; पीएच 7.4 और माउस शुक्राणु के रूप में सेल प्रकार, इंजेक्शन रणनीतियों और pretreatments खाली छोड़ दें। प्रत्येक परख की स्थिति के लिए अलग-अलग समूह बनाएं; इस उदाहरण में, 6 विभिन्न समूह हैं (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, चींटी/सड़ांध, चींटी/सड़ांध + डीबी-cAMP/IBMX); डाइब्यूटिरिल सीएएमपी (डीबी-सीएमपी) और 3-आइसोबुटिएल-1-मिथाइलक्सेंथिन (आईबीएमएक्स) को कैपेसिटी, 2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-डीजी) के रूप में ग्लाइकोलिसिस अवरोधक, एंटीमाइसिन ए (चींटी) और रोटेनोन (सड़ांध) को जटिल III और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के जटिल I के अवरोधक के रूप में प्रेरित करने के लिए प्रेरित करना।
      नोट: कुओं के बीच परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, प्रति शर्त कम से कम 7-8 कुओं को समानांतर रूप से मापा जाना चाहिए।
    4. प्लेट मैप टैब खोलें और विशिष्ट कुओं को समूह ों को निर्दिष्ट करके प्लेट मानचित्र को परिभाषित करें।
      नोट: चार कोने कुओं (A1, A12, H1, H12) TYH बफर (कोई शुक्राणु) से भरा जाएगा और बाद में पृष्ठभूमि घटाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    5. प्रोटोकॉल टैब खोलें, 4 अलग-अलग माप चक्र जोड़ें, संबंधित बंदरगाह का चयन करें और माप विवरण(चित्र ा 2, तालिका 1)संपादित करें। इंजेक्शन के बाद उपाय को हाइलाइट करें और समतुल्यको हाइलाइट करें ।
    6. परख टेम्पलेट को सहेजें, परियोजना सारांश भरें और परिणाम फ़ाइल के लिए बचत स्थान को परिभाषित करें।
  3. सेंसर कारतूस में लोड करने के लिए यौगिकों की तैयारी
    1. TYH बफर में 9.8 मिलीग्राम यौगिक को भंग करके 50 एमएम डीबी-सीएमपी के 2 एमएल तैयार करें और आईबीएमएक्स को 5 mM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
      नोट: आईबीएमएक्स TYH बफर में पतला होने के बाद उपजी करने की प्रवृत्ति है । 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में TYH/db-cAMP/IBMX समाधान को भंवर और इनक्यूबेटिंग करके उपजी को भंग किया जा सकता है।
    2. TYH बफर में 82.1 मिलीग्राम कंपाउंड को भंग करके 500 एमएम 2-डीजी का 1 एमएल तैयार करें।
    3. TYH बफर में दोनों दवाओं को कमजोर करके एंटा/सड़ांध के 5 माइक्रोन के 1 mL तैयार करें ।
      नोट: यौगिकों को एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर कारतूस में इंजेक्शन द्वारा 10 गुना पतला किया जाता है; इसलिए, सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन समाधान 10x अधिक केंद्रित हैं।
  4. माउस शुक्राणु का अलगाव
    1. आइसोफ्लोरीन द्वारा 8 से 16 सप्ताह के बीच 3 पुरुष चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें और गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा चूहों का बलिदान करें, जिसके बाद टो पिंचिंग का कोई जवाब नहीं मिला। कौडा एपिडिमिड्स और वासा डिफरेंटिया निकालें।
    2. 24-अच्छी प्लेट अच्छी तरह से पूर्वगरम TYH बफर के 500 μL में प्रत्येक कौडा रखें, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके प्लेट के नीचे कौडा को स्थिर करें और पंख कैंची के साथ 5-7 छोटे चीरे बनाकर ऊतक खोलें।
    3. प्लेट को तुरंत नॉन-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्रांसफर करें और स्पर्म को 15 मिन के लिए तितर-बितर होने दें।
  5. सेंसर कारतूस की लोडिंग
    1. पोर्ट ए और डी और पोर्ट बी और सी के लिए दो पोर्ट-लोडिंग गाइड एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स किट में प्रदान किए जाते हैं। एक विशिष्ट बंदरगाह लोड करने के लिए, सेंसर कारतूस से ढक्कन हटा दें और कारतूस के ऊपरी बाएं कोने के साथ संबंधित पोर्ट लोडिंग गाइड के पत्र को संरेखित करें। इंजेक्शन लगाते समय, पोर्ट लोडिंग गाइड को जगह में रखने और पोर्ट लोडिंग गाइड छेद में लंबवत पिपेट युक्तियों को डालने के लिए गैर-इंजेक्शन वाले हाथ की उंगलियों का उपयोग करें।
    2. पोर्ट ए: मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, टीवाईएच बफर के 20 माइक्रोन को हर कॉलम में इंजेक्ट करें।
    3. पोर्ट बी: कॉलम 1-4 में TYH बफर के 22 μL इंजेक्ट, कॉलम 5-8 में ५०० mM 2-DG के 22 μL इंजेक्ट, और 5 μM चींटा के 25 μL/
    4. पोर्ट सी: विषम संख्या के साथ हर कॉलम में TYH बफर के 25 μL इंजेक्ट, 10 mM डीबी-cAMP/५०० μM आईबीएमएक्स के 25 μL भी संख्या के साथ हर कॉलम में इंजेक्ट ।
    5. संलीकाओं की प्लेट के साथ सेंसर कारतूस को एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर में रखें और परख शुरू करें। अंशांकन में 10 - 15 मिन लगते हैं।
  6. शुक्राणु प्लेटों की तैयारी
    1. TYH बफर (3 मिलीग्राम/mL w/v) के 15 मिलीग्राम में बीएसए के ४५ मिलीग्राम भंग और 5 mL अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रत्येक 3 mL बीएसए/TYH समाधान के तीन aliquots तैयार करते हैं ।
    2. एक १.५ mL अपकेंद्री ट्यूब में दो शुक्राणु कुओं को मिलाएं, एक हेमेटोसाइटोमीटर का उपयोग कर शुक्राणु गिनती और 2 x १० शुक्राणु/mL की एकाग्रता के लिए शुक्राणु पतला ।
      नोट: कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए शुक्राणु को पाइपकरने के लिए कट पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    3. 700 x ग्रामपर 3 मिन के लिए शुक्राणु को अपकेंद्रित करें, सुपरनेटेंट को हटा दें और टीवाईएच बफर के 1 mL जोड़ें। केंद्रीकरण चरण दोहराएं, सुपरनेटेंट को हटा दें, और प्रत्येक शुक्राणु निलंबन को बीएसए/टीवाईएच के 3 mL के साथ एक 5 mL सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. प्रत्येक कोने में TYH बफर के 180 μL अच्छी तरह से रखें (A1, A12, H1, H12) एक कोना-लेपित प्लेट के। कोना-लेपित प्लेट (1.2 x 106 शुक्राणु/अच्छी तरह से) के प्रत्येक खाली कुएं में शुक्राणु निलंबन के 180 μL रखें।
    5. 1 मिन के लिए 250 x ग्राम पर शुक्राणु प्लेट को अपकेंद्रित्र करें, प्लेट को 180 डिग्री तक घुमाएं, और 1 मिन (सबसे कम ब्रेकिंग रेट 1) के लिए 250 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र करें।
    6. एक्स्सेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर से कैलिब्रेशन प्लेट निकालें और स्पर्म प्लेट डालें। परख जारी रखें।
  7. डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण
    1. परख खत्म करने के बाद, कारतूस निकालें, परिणाम फ़ाइल खोलें, निर्यात टैब पर क्लिक करें और एक ग्राफपैड चश्मे फ़ाइल के रूप में पूरा रन निर्यात करें(पूरक फ़ाइल 2:प्राथमिक उदाहरण डेटा चित्रा 3के लिए इस्तेमाल किया) ।
    2. नए टैब पर क्लिक करके ईएआर और ओसीआर फ़ाइल को डुप्लिकेट करें और फिर डुप्लिकेट परिवार ... टैब(चित्रा 3ए)।
    3. डेटा की पहली 7 पंक्तियों को हटाएं(चित्रा 3बी)।
    4. बेसलाइन घटाना पंक्ति 1 द्वारा cAMP/IBMX इंजेक्शन से पहले डेटा बिंदु को सामान्य । एनालिये टैब पर क्लिक करें, फिर निकालें बेसलाइन और कॉलम गणित टैब पर. चयनित पंक्ति पर प्रकाश डाला (s): पहली पंक्ति, गणना: अनुपात: मूल्य/बेसलाइन,और उपकॉलम: उपस्तंभ की अनदेखीकरें । ओके क्लिक करें(चित्रा 3सी)

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Representative Results

यह विधि माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिस और ऑक्सफॉस की दर में वास्तविक समय परिवर्तन ों की निगरानी के लिए एक बाह्युलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करती है। चित्रा 4 एक अनुकरणीय प्रयोग दिखाता है जहां शुक्राणु ग्लूकोज की उपस्थिति में केवल ऊर्जा सब्सट्रेट और 2-डीजी और एंटीमाइसिन और रोटेनोन के रूप में औषधीय मॉड्यूलर के रूप में कैपेसिटी थे। एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर टीवाईएच बफर में ऊर्जा सब्सट्रेट और फार्माकोलॉजिकल मॉड्यूलर को प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर स्वतंत्र रूप से चुना जा सकता है। बीएसए/TYH में गैर-क्षमता वाले माउस शुक्राणु उनके सिर के माध्यम से कोना-लेपित क्षणिक माइक्रोचैंबर के नीचे से जुड़े हुए थे । इस उदाहरण में, सभी पाए गए कुओं के बीच औसतन बेसल ईएआर और ओसीआर मूल्य क्रमशः 12.76 ± 2.75 एमपीएच/मिन और 23.64 ± 2.78 बजेोल/मिन थे।

TYH बफर के साथ एक नकली इंजेक्शन के बाद, क्रमशः ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन को बाधित करने के लिए 2-डीजी और चींटी/सड़ांध का इंजेक्शन के बाद, शुक्राणु क्षमता को डीबी-CAMP/IBMX के इंजेक्शन से प्रेरित किया गया था ।

प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि ग्लूकोज की उपस्थिति में, क्षमता एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट (ईसीएआर) में 7 गुना वृद्धि के साथ होती है, जो 2-डीजी(चित्रा 4ए)के साथ ग्लाइकोलाइसिस को अवरुद्ध करके बाधित होती है। कैपेसिबल शुक्राणु गैर-कैपेसिबल शुक्राणु(चित्रा 4बी)की तुलना में ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) में 20 गुना वृद्धि दिखाते हैं, जिससे यह प्रदर्शित होता है कि माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान बढ़ती ऊर्जा मांग का समर्थन करने के लिए ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलेशन दोनों को बढ़ाते हैं । शुक्राणु क्षमता के दौरान ECAR में वृद्धि ग्लाइकोलिसिस अवरोधक 2-डीजी द्वारा बाधित होती है, लेकिन ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन अवरोधकों एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन(चित्रा 4सी)से प्रभावित नहीं होती है, यह दर्शाता है कि ईसीएआर में परिवर्तन मुख्य रूप से ग्लाइकोलिसिस से एच+ रिलीज से प्रेरित है। ओसीआर में वृद्धि, जैसा कि उम्मीद थी, एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन(चित्रा 4डी)द्वारा अवरुद्ध है, लेकिन यह 2-डीजी(चित्रा 4बी)द्वारा भी बाधित है जिसमें यह खुलासा किया गया है कि शुक्राणु क्षमता के दौरान ऑक्सफॉस में वृद्धि ग्लाइकोलिटिक गतिविधि पर निर्भर है।

Figure 1
चित्रा 1: एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर का सिद्धांत। (क) ग्लाइकोलाइसिस के दौरान लैक्टेट करने के लिए ग्लूकोज के टूटने और टीसीए चक्र के माध्यम से सीओ2 की पीढ़ी के कारण ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सफॉस में परिवर्तन के साथ एक्स्सेलुलर मीडिया में एच+ विसर्जन किया जाता है । XFe96 एनालाइजर ईएआर के रूप में बाह्युलर एच+ एकाग्रता में इन परिवर्तनों का पता लगाता है। समानांतर में, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन द्वारा ओ2 खपत के कारण एक्स्सेल्युलर ओ2 एकाग्रता में परिवर्तन को ओसीआर के रूप में मापा जाता है। 2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-डीजी) या जटिल I और जटिल III अवरोधकरोटोन और एंटीमाइसिन ए के साथ श्वसन के साथ ग्लाइकोलाइसिस को अवरुद्ध करने से पता चलता है कि मेटाबोलिक रास्ते शुक्राणु क्षमता के दौरान बढ़ती ऊर्जा की मांग का समर्थन करते हैं। (ख) माउस शुक्राणु उनके सिर के माध्यम से एक कोना-लेपित माइक्रोचैंबर के नीचे से जुड़े हुए हैं; उनके फ्लैगेला स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे हैं । जबकि एक्स्सेल्युलर एच+ और ओ2 एकाग्रता में परिवर्तन एच+द्वारा पता लगाया जाता है - और ओ2-संवेदनशीलफ्लोरोफोरस एक सेंसर जांच के लिए स्थिर, चार अलग यौगिकों को क्रमिक रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुकरणीय प्रयोग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक्सिसेलुलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करके गैर-क्षमता और कैपेसिटीवाले शुक्राणु में ईसीएआर (एमपीएच/मिन) और ओसीआर (पीएमओएल ओ2/मिन)में परिवर्तन का पता लगाया जाता है । साइकिल 1: बेसल ईएआर और ओसीआर मान। चक्र 2-5: TYH नकली इंजेक्शन के बाद सिस्टम स्थिरीकरण। चक्र 6-8: दवा ऊष्मायन। चक्र 9-27: शुक्राणु क्षमता। तीर इंजेक्शन का संकेत देते हैं। 2-डीजी: अंतिम एकाग्रता 50 mM, AntA/Rot: अंतिम एकाग्रता 0.5 μM, डीबी-cAMP: अंतिम एकाग्रता 1 mM, IBMX: अंतिम एकाग्रता 500 μM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डेटा विश्लेषण। (क) माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ईसीएआर में परिवर्तन का कच्चा डेटा। (ख) पहले 7 डेटा बिंदुओं को हटाने के बाद डेटा । (ग) सीएमपी/आईबीएमएक्स इंजेक्शन से पहले डेटा प्वाइंट तक सामान्यीकृत डाटा । डेटा को 7-8 कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है ± एसईएम इंजेक्शन एक तीर के साथ इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलेशन में परिवर्तन। (क) 50 एमएम 2-डीजी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माउस शुक्राणु की उपस्थिति और क्षमता में सामान्यीकृत ईसीएआर। (ख) 50 एमएम 2-डीजी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में गैर-क्षमता और क्षमता वाले माउस शुक्राणु में ओसीआर को सामान्यीकृत किया गया। (ग) सामान्यीकृत ईसीएआर को गैर-कैपेसिट और कैपेसिटिंग माउस स्पर्म की उपस्थिति और 05 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन की अनुपस्थिति में सामान्यीकृत किया गया है। (D) सामान्यीकृत ओसीआर को गैर-कैपेसिट और कैपेसिटिंग माउस शुक्राणु की उपस्थिति और 05 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन की अनुपस्थिति में सामान्यीकृत किया गया है। डेटा के रूप में दिखाया गया है मतलब ± S.E.M डीबी-cAMP/IBMX इंजेक्शन से पहले डेटा बिंदु को सामान्यीकृत; n = 6. इंजेक्शन एक तीर के साथ संकेत दिए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बंदरगाह चक्रों की संख्या मिक्स (मिन) रुको (मिन) उपाय (मिन)
एक: बेसल ECAR/OCR कोई बंदरगाह नहीं 1 2:00 0:00 3:00
B: नकली इंजेक्शन 1 4 2:00 0:00 3:00
C: दवा इंजेक्शन 2 3 2:00 0:00 3:00
D: क्षमता 3 18 2:00 0:00 3:00

तालिका 1: माप विवरण।

Supplemental Figure 1
अनुपूरक चित्रा 1: बाह्य फ्लक्स एनालाइजर TYH बफर में माउस शुक्राणु की क्षमता। 25 एमएम एचसीओ3के साथ (ए) TYH में ऊष्मायन के बाद (0-90 मिन) क्षमता के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर पता चला माउस शुक्राणु के टायरोसिन अवशेषों का फॉस्फोरिलेशन3 -3 मिलीग्राम/एमएल बीएसए और 20 मीटर हेम ईपीईएस या इन (बी) एक्सोशिएबल फ्लक्स एनालाइजर टाइइन 5 एम डीबी-सीएमपी के साथ, 500 माइक्रोएम आईबीएमएक्स, और 1 एमएम हेप्स, एक α-फॉस्फोटीरोसिन एंटीबॉडी के साथ पता चला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइल 1: माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलेशन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए वेव परख टेम्पलेट। वेव डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर को पंजीकरण फॉर्म(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)भरने के बाद मुफ्त में डाउनलोड किया जा सकता है और विंडोज 7, 8 या 10 पर स्थापित किया जा सकता है, (मैक ओएसएक्स 10.11 (या अधिक) समानताएं 12 (या अधिक) के साथ। इस प्रकार, वेव टेम्पलेट्स को एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर से स्वतंत्र रूप से उत्पन्न किया जा सकता है, निर्यात किया जाता है और फिर किसी भी एक्स्सेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर के तरंग सॉफ्टवेयर में आयात किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

पूरक फ़ाइल 2: ग्राफ पैड चश्मे फ़ाइल अनुकरणीय डेटा विश्लेषण के साथ तरंग सॉफ्टवेयर से निर्यात किया। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

कुछ मेटाबोलिक सब्सट्रेट्स या महत्वपूर्ण मेटाबोलिक एंजाइमों की अनुपस्थिति में शुक्राणु क्षमता की हानि ने सफल निषेचन का समर्थन करने वाले एक प्रमुख कारक के रूप में ऊर्जा चयापचय का पता चला। सेल एक्टिवेशन के दौरान एक मेटाबोलिक स्विच अन्य सेल प्रकारों में एक अच्छी तरह से स्थापित अवधारणा है, हालांकि, हम सिर्फ यह समझने लगे हैं कि शुक्राणु क्षमता के दौरान बढ़ती ऊर्जा मांग के लिए अपने चयापचय को कैसे अनुकूलित करते हैं। एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके, हमने शुक्राणु क्षमता के दौरान वास्तविक समय में ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक आसानी से लागू उपकरण विकसित किया। एक सेंसर जांच के लिए स्थिर फ्लोरोफोरस के साथ बाह्य एच+ और ओ2 में परिवर्तन का पता लगाना न्यूनतम आक्रामक है और चार व्यक्तिगत रूप से संचालित इंजेक्शन बंदरगाहों से पहले या क्षमता प्रक्रिया के दौरान अलग समय बिंदुओं पर औषधीय अवरोधकों या सक्रियकर्ताओं के साथ हेरफेर की अनुमति देते हैं । यह प्रोटोकॉल माउस शुक्राणु क्षमता प्रयोग का केवल एक उदाहरण देता है। परिणामों की व्याख्या को सरल बनाने के लिए हमने शो को एक अनुकरणीय प्रयोग चुना जहां ग्लूकोज का उपयोग एकमात्र ऊर्जा स्रोत के रूप में किया गया था। स्थितियां प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर चर रही हैं, और 12 विभिन्न स्थितियों (यानी, ग्लूकोज बनाम ग्लूकोज और पायरुवेट जैसे विभिन्न ऊर्जा स्रोतों) को समानांतर रूप से मापा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चार स्वतंत्र इंजेक्शन बंदरगाहों से पहले या क्षमता के दौरान किसी भी वांछित समय बिंदु पर औषधीय सक्रियकों और/या अवरोधकों के इंजेक्शन की अनुमति देते हैं । यह एक अर्ध उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग डिवाइस के रूप में बाह्य फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करने की संभावना को खोलता है। माउस शुक्राणु के समान, मानव या गोजातीय जैसी अन्य प्रजातियों में यह अभी भी रहस्यपूर्ण है कि शुक्राणु क्षमता के दौरान अपने चयापचय को कैसे बदलते हैं। प्रोटोकॉल को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है; इस प्रकार, हम वास्तविक प्रयोग शुरू करने से पहले हर बार शुक्राणु एकाग्रता को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं।

प्रोटोकॉल की सबसे बड़ी सीमा यह है कि उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम केवल बाइकार्बोनेट के अभाव में प्राप्त किए जा सकते हैं। मौलिक तरल पदार्थ में बाइकार्बोनेट शारीरिक संकेत है जो स्खलन के बाद शुक्राणु की क्षमता संकेत झरना शुरू करता है। बाइकार्बोनेट घुलनशील एडेनेलिल साइक्लेज़ (सैक; ADCY10), जो एटीपी के रूपांतरण को सीएएमपी23में उत्प्रेरक करता है। इसके बाद सीएमपी में वृद्धि प्रोटीन किनेस ए द्वारा मध्यस्थता में एक सिग्नलिंग झरना चलाती है, जो अंततः लक्ष्य प्रोटीन (जैसे, आयन चैनलों, मेटाबोलिक एंजाइमों, और संरचनात्मक प्रोटीन24,25)के डाउनस्ट्रीम टायररोसिन फॉस्फोरिलाइजेशन की ओर जाता है। बाइकार्बोनेट के खिलाफ यह प्रतिबंध बाइकार्बोनेट-सक्रिय थैली, CAMP के उत्पाद को इंजेक्ट करके दूर किया जाता है। हम व्यापक विशिष्टता फॉस्फोडिस्टेरेस अवरोधक आईबीएमएक्स के समानांतर सेल-पारगम्य सीएमएमपी एनालॉग डीबी-सीएमपी के 5 mM का उपयोग करते हैं, जो फॉस्फोडिस्टेरेस द्वारा डीबी-कैम्प के तेजी से क्षरण को रोकता है। यह संयोजन प्रभावी रूप से बीकार्बोनेट(सप्लीमेंट्री फिगर 1)के समान गतिज के साथ सीएमपी-विनियमित कैपेसिटी सिग्नलिंग पाथवे पोस्ट सैक एक्टिवेशन शुरू करता है। बाइकार्बोनेट के समानांतर, एक कोलेस्ट्रॉल स्वीकारकर्ता (उदाहरण के लिए, बीएसए) का उपयोग जूता स्खलन वाले शुक्राणु या शुक्राणु को काउडा एपिडिडिमिस से विच्छेदित करने के लिए किया जाता है। एल्बुमिन को इंजेक्ट नहीं किया जा सकता क्योंकि यह इंजेक्शन पोर्ट को रोकता है और इसलिए कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले शुक्राणु बफर में जोड़ने की जरूरत है । बीएसए की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रयोग करने से पता चला कि शुक्राणु क्षमता के दौरान ईसीएआर और ओसीआर में वृद्धि कोलेस्ट्रॉल स्वीकारकर्ता से स्वतंत्र है। हालांकि, शुक्राणु बफर में बीएसए की उपस्थिति ने विभिन्न कुओं और प्रयोगों के बीच पता लगाए गए ईएआर और ओसीआर मूल्यों में उतार-चढ़ाव में कमी की; इस प्रकार, हम प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए शुक्राणु बफर में बीएसए को शामिल करने की अत्यधिक सलाह देते हैं।

कौडा एपिडिडिमिस से शुक्राणु को अलग करने से शुक्राणु के संदूषण में एपिडिडिमल द्रव के साथ परिणाम होता है। मौलिक द्रव घटकों के कारण कृत्रिम परिणामों से बचने के लिए, हम एक प्रयोग के लिए उनका उपयोग करने से पहले दो बार शुक्राणु धोने की सलाह देते हैं। शुक्राणु एकाग्रता और चढ़ाना प्रयोग की सफलता का निर्धारण करने वाला एक और महत्वपूर्ण कारक है। विश्वसनीय परिणामों के लिए, निर्माता प्रारंभिक ईकार मूल्यों को 10 से बड़ा और ओसीआर मूल्यों को 20 से बड़ा होने की सिफारिश करता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली शुक्राणु एकाग्रता को अनुकूलित किया गया था ताकि प्रति शर्त मापे गए 7-8 कुओं के औसत बेसल ईएआर और ओसीआर मूल्य क्रमशः 10 और 20 से ऊपर हों। स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ने वाले शुक्राणु बाह्युशिकीय एच+ और ओ2में परिवर्तन का पता लगाने में परेशान करते हैं । इस प्रकार, प्लेट के नीचे तक उनके सिर के साथ सभी शुक्राणु का पालन करना महत्वपूर्ण है। हम कोना, एक संयंत्र लेक्टिन है कि विशेष रूप से बाहरी कलासोमल झिल्ली के साथ बातचीत के साथ थाली कोटिंग द्वारा शुक्राणु का पालन सफलता पाया और आमतौर पर कलाबाजी परख26के लिए प्रयोग किया जाता है, और धीरे से थाली कताई द्वारा (कदम २.७.३ देखें) । इस विधि के साथ, शुक्राणु को पूरी तरह से उनके सिर के माध्यम से अच्छी तरह से नीचे तक स्थानीयकृत किया जाता है ताकि वे अभी भी स्वतंत्र रूप से अपने फ्लैगेला को स्थानांतरित कर सकें और कैपेसिटी के दौरान अपने फ्लैगलेयर बीटिंग पैटर्न को बदल सकें।

शुक्राणु लगातार एच+ और ओ2 दोनों में, गैर-क्षमता और क्षमता वाली स्थिति को बाहर निकालते हैं। प्रारंभिक ईसीएआर और ओसीआर को यथासंभव सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, पिछले वाशिंग चरण के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रयोग शुरू करना महत्वपूर्ण है। यह सेंसर कारतूस लोड करके पूरा किया जा सकता है जबकि शुक्राणु बाहर तैर रहे हैं और पहले वाशिंग स्टेप से पहले एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर में विधि शुरू करके। उपकरण को अंशांकित करने से कोशिकाओं को धोने और चढ़ाना और प्लेट कताई के रूप में लगभग एक ही समय लगता है। निर्माता पहले वास्तविक डेटा बिंदु को मापा जाने से पहले सिस्टम को स्थिर करने की अनुमति देने के लिए एक समतुल्यचरण की सिफारिश करता है। चूंकि प्रोटोकॉल में क्षमता शुरू होने से पहले 8 माप चक्र शामिल हैं, समय बचाने के लिए, समतुल्यता चरण को इस प्रोटोकॉल से बाहर रखा गया है।

परख के दौरान समाधान इंजेक्ट करने और वास्तविक समय में श्वसन और ग्लाइकोलिटिक दर पर उनके प्रभावों का निरीक्षण करने की क्षमता बाह्य प्रवाह विश्लेषक की एक प्रमुख विशेषता है। सेंसर कारतूस लोड करना प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है और इसे सावधानी से किया जाना चाहिए। सभी कुओं में उचित इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, बंदरगाहों की प्रत्येक श्रृंखला के लिए पृष्ठभूमि कुओं सहित एक ही मात्रा में शामिल करने की जरूरत है । एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ बंदरगाहों लोड करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है लेकिन परिवर्तनशीलता और लोडिंग समय काफी कम हो जाता है। हम पोर्ट लोडिंग गाइड का उपयोग करने की अत्यधिक सलाह देते हैं लेकिन एक साथ केवल चार बंदरगाहों को इंजेक्ट करने के लिए। यह भी सराहना करते हैं कि लोडिंग के दौरान, इंजेक्शन की मात्रा धीरे-धीरे अच्छी तरह से बढ़ती मात्रा की भरपाई के लिए बढ़ जाती है। सेंसर कारतूस लोड करते समय, पोर्ट में सुझावों को पूरी तरह से शामिल नहीं करना महत्वपूर्ण है। यह समय से पहले बंदरगाह छिद्र के माध्यम से इंजेक्शन समाधान धक्का हो सकता है । जबकि विधि हमने पाया कि एक शुक्राणु में तरल इंजेक्शन अच्छी तरह से अनिष्ट इंजेक्शन कलाकृतियों का कारण बनता है, शायद अच्छी तरह से और/ पहला इंजेक्शन सबसे बड़ा इंजेक्शन विरूपण साक्ष्य का कारण बनता है, इसलिए हमने प्रोटोकॉल की शुरुआत में सभी कुओं में शुक्राणु बफर के साथ एक नकली इंजेक्शन शामिल किया।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक रॉकफेलर हाई थ्रूपुट और स्पेक्ट्रोस्कोपी रिसोर्स सेंटर में डॉ लावोइसियर रामोस-एस्पिरिटु से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

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References

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292, (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411, (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109, (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58, (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168, (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149, (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61, (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87, (3), 75 (2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276, (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64, (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82, (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101, (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49, (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110, (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26, (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49, (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262, (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278, (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290, (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96, (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121, (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105, (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24, (8), 999-1007 (2009).

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