Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering under mus sperm capacitation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mammalian sperm erhverve befrugtning kapacitet i den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en proces, kendt som capacitation. Capacitation-relaterede processer kræver energi. Der er fortsat en løbende debat om de kilder, der genererer ATP, som brændstoffer sperm progressiv motilitet, capacitation, hyperaktivering, og acrosome reaktion. Her beskriver vi anvendelsen af en ekstracellulær flux analysator som et værktøj til at analysere ændringer i energimetabolisme under mus sperm capacitation. Ved hjælp af H+-og O2-følsomme fluorophorer, denne metode gør det muligt at overvåge glycolyse og oxidativ fosforylering i realtid i ikke-kondenseret versus kapaciterende sædceller. Ved hjælp af denne analyse i tilstedeværelse af forskellige energi substrater og/eller farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere kan give vigtig indsigt i bidraget fra forskellige metaboliske veje og skæringspunktet mellem signalering kaskader og metabolisme under sperm capacitation.

Introduction

Anvendelsen af massespektrometri har revolutioneret studiet af metabolisme. Målrettet metabolisk profilering og metabolomic Tracing muliggør præcis overvågning af ændringer i energimetabolisme. Men at udføre metabolomics med succes kræver omfattende uddannelse, erfarne medarbejdere, og dyre, meget følsomme massespektrometre ikke let tilgængelige for alle laboratorier. I de seneste år, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, såsom Seahorse XFe96 er vokset populære som en surrogat metode til måling af ændringer i energimetabolisme i forskellige celletyper1,2,3,4,5.

Sperm er højt specialiserede motile sædceller celler; hvis opgave er at levere det faderlige genom til oocyte. Sperm forlader den mandlige reproduktive tarmkanalen efter ejakulation er stadig funktionelt umodne og kan ikke befrugte oocyt fordi de ikke er i stand til at trænge ind oocytterne ' vestments. Sperm erhverve befrugtning kompetence, som de passerer gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen i en modningsproces kendt som kursuskapacitering6,7. Nyejakuleret sperm eller sperm, der dissekeres fra cauda epididymis, kan kondenseret in vitro ved inkubation i definerede kursuskapacitering-medier indeholdende ca2 +, bicarbonat (HCO3-) eller en celle gennemtrængelig lejr analog (f. eks. dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (f. eks. bovin serumalbumin, BSA) og en energikilde (f. eks. glucose). Under capacitation, sædceller ændre deres motilitet mønster i en asymmetrisk flagellar beat, der repræsenterer en svømning tilstand kaldet resulterende8,9, og de bliver kompetente til at gennemgå den acrosome reaktion7, hvor Proteolytiske enzymer frigives, at fordøje oocytter ' vestments. Disse processer kræver energi, og ligner somatiske celler, sperm generere ATP og andre høje energiforbindelser via glycolyse samt mitokondrie TCA cyklus og oxidativ fosforylering (oxphos)10. Mens flere undersøgelser viser, at glycolyse er nødvendig og tilstrækkelig til at understøtte sperm kursuskapacitering11,12,13,14, er bidraget fra oxphos mindre klart. I modsætning til andre celletyper, hvor glycolyse er fysisk koblet til TCA-cyklussen, er sperm stærkt opdelte og menes at vedligeholde disse processer i separate flagellar rum: Mellemstykket koncentrerer mitokondrie maskiner, mens de vigtigste enzymer af glykolyse synes at være begrænset til det vigtigste stykke15,16. Denne opdeling resulterer i en løbende debat om, hvorvidt pyruvat fremstillet i hovedstykket af glycolyse kan understøtte mitokondrie oxphos i midterstykket, og om ATP produceret af oxphos i midterstykket ville være i stand til at diffus tilstrækkeligt hurtigt langs længden af flagel til at understøtte energibehovet i distale dele af hovedstykket17,18,19. Der er også støtte til en rolle for oxphos i sperm capacitation. Ikke alene er oxphos mere energetisk gunstig end glycolyse, genererer 16 gange mere ATP end glycolyse, men mellemstykke volumen og mitokondriel indhold er direkte korreleret med reproduktiv egnethed i pattedyrarter, som udviser større grader af konkurrence mellem mænd for hjælpere20. Behandling af disse spørgsmål kræver metoder til at undersøge de relative bidrag af glycolyse og oxphos under sædcapacitation.

Tourmente et al. anvendte en 24-brønd ekstracellulær flux analysator til at sammenligne energimetabolisme af nært beslægtede mus arter med signifikant forskellige sædkvalitet parametre21. I stedet for at rapportere basal ECAR og OCR værdier af ikke-kondenseret sperm, her, vi tilpasser deres metode ved hjælp af en 96-godt ekstracellulær flux analysator til at overvåge ændringer i energimetabolisme under musen sperm kursuskapacitering i realtid. Vi udviklede en metode, der muliggør samtidig overvågning af glycolyse og oxphos i realtid i sædceller med slå flageller i op til tolv forskellige eksperimentelle betingelser ved at måle flux af ilt (O2) og protoner (H+) (figur 1a). På grund af nedbrydningen af pyruvat til laktat under glykolyse og produktion af CO2 via TCA-cyklus, ikke-kondenseret og kondenseret sperm Extrude h+ ind i analyse mediet, som detekteres af den ekstracellulære flux analysator via H+-følsomme fluorophorer immobiliseret til probespidsen af en sensor patron. Parallelt hermed detekteres O2 forbrug ved oxidativ fosforylering via o2-følsomme fluorophorer immobiliseret til samme sonde spids (figur 1b). Effektiv påvisning af den frigivne H+ og forbrugt O2 kræver en modificeret sperm buffer med lav bufferkapacitet uden bicarbonat eller phenol rød. Således, at inducere kursuskapacitering i fravær af bicarbonat, vi vedtog brugen af en celle gennemtrængelig lejr analog injiceres sammen med bredspektret PDE inhibitor ibmx22. Tre yderligere uafhængige Indsprøjtnings porte tillader injektion af farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere, hvilket letter realtids påvisning af ændringer i cellulær respiration og glykolyse hastighed på grund af eksperimentel manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sperm er indsamlet fra 8-16-ugers gamle CD-1 mandlige mus. Dyreforsøg blev godkendt af Weill Cornell Medicine Institutionsudvalg for dyrepasning og-brug (IACUC).

1. dagen før assay

  1. Klargøring af sensor patron og ekstracellulær flux analysator kalibrant
    1. For at Hydrere sensor patronen skal du fjerne sensor patronen fra XFe96 ekstracellulær flux-Analysesættet og anbringe sensor patronen på hovedet ved siden af brugs pladen.
    2. Fyld et opløsning reservoir med 25 mL dobbeltdestilleret H2o ved hjælp af en multikanals pipette tilsættes 200 μl H2o til hver brønd af brugs pladen. Anbring sensor patronen tilbage i brugs pladen og Inkuber natten over i en 37 °C ikke-CO2 -inkubator.
      Bemærk: cylinderampullen skal hydreres i mindst 4 timer.
    3. Aliquot 25 mL af det ekstracellulære flux-analysator kalibrere til et 50 mL konisk rør og Inkubér den natten over i en 37 °C ikke-CO2 -inkubator.
  2. Klargøring af ConA-belagte mikroplader
    1. 2,5 mg ConA opløses i 5 mL dobbeltdestilleret H2O for at tilberede en 0,5 mg/ml (w/v) bestand.
    2. Ved hjælp af en multikanals pipette fyldes hver brønd af en ekstracellulær flux analysator 96-brønd plade med 50 μL af 0,5 mg/mL con en opløsning. Lad låget stå åbent og lade pladen tørre natten over ved stuetemperatur.
      Bemærk: flere plader kan være belagt med det samme og opbevares ved 4 °C i op til fire uger, indtil de er klar til brug.
  3. Klargøring af sædbuffer
    1. Forbered 250 mL ekstracellulær flux analysator TYH buffer med lave HEPES indeholdende 138 mm nacl, 4,7 mm kcl, 1,7 mm CaCl2, 1,2 mm KH2po4, 1,2 mm mgso4, 5,6 mm glucose, og 1 mm Hepes. Opvarm bufferen til 37 °C, og Juster pH-værdien til 7,4.

2. analysens dag

  1. Klargøring til patron kalibrering
    1. Udskift H2O i brugs pladen med 200 μl XF kalibrant pr. brønd og Inkuber i mindst 1 time i en ikke-CO2 37 °c-inkubator.
      Bemærk: i stedet for kalibrant, steril-filtreret PBS, kan pH 7,4 anvendes.
    2. Varme 50 mL TYH buffer ved 37 °C.
  2. Generering af en bølgeskabelon til ekstracellulær flux Analyzer
    1. Drej den ekstracellulære flux analysator på og lad temperaturen stabilisere sig til 37 °C.
    2. Åbn Wave-softwaren, og design en ny skabelon ved at åbne en tom skabelon (Se supplerende fil 1, bølgeskabelon).
    3. Åbn fanen gruppedefinitioner . Definer analyse medier som tyh; pH 7,4 og celletype som mus sperm, forlade injektion strategier og forbehandlinger blank. Opret forskellige grupper for hver analyse tilstand; i dette eksempel er der 6 forskellige grupper (TYH, TYH + DB-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + DB-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + DB-cAMP/IBMX); dibutyryl Camp (dB-Camp) og 3-isobutyl-1-Methylxanthin (ibmx) at inducere capacitation, 2-deoxyglucose (2-DG) som glykolyse inhibitor, antimycin A (antA) og rotenon (rot) som hæmmer af komplekse III og komplekse i af elektrontransportkæden.
      Bemærk: for at højde for variabilitet mellem brønde skal mindst 7-8 brønde pr. tilstand måles parallelt.
    4. Åbn fanen plade kort , og Definer plade kortet ved at tildele grupper til bestemte brønde.
      Bemærk: de fire hjørne brønde (a1, A12, H1, H12) vil blive fyldt med TYH buffer (ingen sperm) og vil senere blive brugt til baggrunds subtraktion.
    5. Åbn fanen protokol , Tilføj 4 forskellige måle cyklusser, Vælg den pågældende port, og Rediger måle detaljerne (figur 2, tabel 1). Fremhæv mål efter injektion , og Fremhæv ikke ækvibrate.
    6. Gem analyse skabelonen, Udfyld projektoversigten, og Definer den gemme placering for resultatfilen.
  3. Klargøring af forbindelser til indlæsning i sensor patron
    1. Forbered 2 mL 50 mM DB-cAMP ved at opløse 9,8 mg af sammensatte i TYH buffer og tilsæt IBMX til en endelig koncentration på 5 mM.
      Bemærk: IBMX har tendens til at bundfælde efter at være blevet fortyndet i TYH buffer. Bundfældning kan opløses ved vortexning og inkubelering af TYH/DB-cAMP/IBMX-opløsningen i en 37 °C-varmeblok i 5 min.
    2. Forbered 1 mL 500 mM 2-DG ved opløsning 82,1 mg af sammensatte i TYH buffer.
    3. Forbered 1 mL af 5 μM af AntA/Rot ved at fortynde begge stoffer i TYH buffer.
      Bemærk: forbindelser fortyndes 10 gange ved injektion i den ekstracellulære flux analysator patron; Derfor, være sikker på, at injektion opløsninger er 10x mere koncentreret.
  4. Isolering af mus sædceller
    1. Anesthetize 3 mandlige mus mellem 8 og 16 uger af isofluran og ofre musene ved livmoderhals dislokation efter ingen respons på tåspidsen blev detekteret. Fjern cauda bitestikler og Vasa deferentia.
    2. Placer hver cauda i 500 μl forvarmede tyh buffer i 24-brønd plade godt, immobiliserer cauda til bunden af pladen ved hjælp af et par tang og åbne vævet ved at gøre 5-7 små snit med fjer saks.
    3. Pladen overføres straks til en ikke-CO2 37 °c inkubator og lad sædcellerne dispersere i 15 minutter.
  5. Indlæsning af sensor patronen
    1. I det ekstracellulære flux-sæt findes to hjælpelinjer til port A og D samt port B og C. For at indlæse en bestemt port, Fjern låget fra sensor patronen og Juster bogstavet for den respektive port loading guide med det øverste venstre hjørne af patronen. Mens du injicerer, skal du bruge fingerspidserne på den ikke-injicerer hånd til at holde portindlæsnings vejledningen på plads og sætte pipette spidserne lodret ind i porten til indlæsnings hullerne.
    2. Port A: ved hjælp af en multikanals pipette indsprøjtes 20 μL af TYH-bufferen i hver kolonne.
    3. Port B: Injicér 22 μL TYH-buffer i kolonne 1-4, Injicer 22 μL 500 mM 2-DG i kolonne 5-8, og 25 μL 5 μM AntA/Rot i kolonne 9-12.
    4. Port C: Injicer 25 μL TYH buffer i hver kolonne med ulige tal, Injicer 25 μL af 10 mM DB-cAMP/500 μM IBMX i hver kolonne med lige tal.
    5. Anbring sensor patronen med kalibrerings pladen i den ekstracellulære flux-analysator, og start analysen. Kalibreringen tager 10-15 min.
  6. Fremstilling af sædplader
    1. 45 mg BSA opløses i 15 mL TYH-buffer (3 mg/mL w/v), og tre aliquoter af 3 mL BSA/TYH-opløsning udtages hver i 5 mL centrifugeglas.
    2. Kombiner to sædbrønde hver i et 1,5 mL centrifugeglas, Tæl sædcellerne ved hjælp af et hematocytometer og fortynder sædcellerne til en koncentration på 2 x 107 sperm/ml.
      Bemærk: Brug skære pipettespidser til pipette Rings sædceller for at undgå at beskadige cellerne.
    3. Centrifuger sæden i 3 minutter ved 700 x g, Fjern supernatanten, og tilsæt 1 ml tyh-buffer. Gentag Centrifugerings trinnet, Fjern supernatanten, og Overfør hver sædsuspension alikvot til et 5 ml centrifugeglas med 3 ml BSA/tyh.
    4. Placer 180 μL TYH buffer i hvert hjørne godt (a1, A12, H1, H12) af en ConA-belagt plade. Placer 180 μL sædsuspension i hver Tom brønd af den ConA-belagte plade (1,2 x 106 sperm/brønd).
    5. Centrifuger sædpladen ved 250 x g i 1 min., drej pladen med 180 °, og centrifuger igen ved 250 x g i 1 min. (laveste bremse hastighed 1).
    6. Fjern kalibrerings pladen fra den ekstracellulære flux analysator og tilsæt sædpladen. Fortsætte analysen.
  7. Data udtræk og analyse
    1. Når du har afsluttet analysen, skal du fjerne patronen, åbne resultatfilen, klikke på fanen Eksporter og eksportere den afsluttede kørsel som en Graphpad Prism-fil (supplerende fil 2: primære eksempeldata, der bruges til figur 3).
    2. Dupliker ECAR-og OCR-filen ved at klikke på fanen ny og derefter på fanen Dupliker familie... (figur 3A).
    3. Slet de første 7 rækker med data (figur 3B).
    4. Normalisere til datapunktet før cAMP/IBMX injektion ved baseline trække række 1. Klik på fanen Analysér og derefter på fanen Fjern baseline og kolonne matematik . Fremhæv markerede rækker: første række, beregning: ratio: værdi/Oprindelig planog under kolonner: Ignorer under kolonne. Klik på OK (figur 3C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode bruger en ekstracellulær flux analysator til at overvåge real-time ændringer i satsen for glycolyse og oxphos under mus sperm capacitation. Figur 4 viser et eksemplarisk eksperiment, hvor sperm blev kondenseret i tilstedeværelse af glucose som det eneste energi substrat og 2-DG og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Energi substratet i den ekstracellulære flux analysator TYH buffer og de farmakologiske modulatorer kan frit vælges afhængigt af målet for eksperimentet. Ikke-kapaciteret mus sperm i BSA/TYH blev fastgjort til bunden af en ConA-belagt forbigående mikrokammer via deres hoved. I dette eksempel var basal ECAR-og OCR-værdierne i gennemsnit mellem alle de fundne brønde henholdsvis 12,76 ± 2,75 mpH/min og 23,64 ± 2,78 pmol/min.

Efter en mock-injektion med TYH-buffer, efterfulgt af injektion af 2-DG og ant/Rot for at hæmme glykolyse og oxidativ fosforylering, blev sædcapacitation induceret ved injektion af DB-cAMP/IBMX.

De repræsentative resultater viser, at ved tilstedeværelse af glucose, er kursuskapacitering ledsaget af en 7-fold stigning i ekstracellulær forsuring sats (ECAR), som hæmmes ved at blokere glycolyse med 2-DG (figur 4a). Kondenseret sperm viser en 20-fold stigning i iltforbrug sats (OCR) sammenlignet med ikke-kondenseret sperm (figur 4B), viser, at mus sperm forbedre både glykolyse og oxidativ fosforylering at støtte den stigende energiefterspørgsel under capacitation. Stigningen i vognen under sædkapring hæmmes af glykolyse-hæmmeren 2-DG, men ikke påvirket af de oxidativ fosforylations hæmmere antimycin A og rotenon (figur 4C), hvilket indikerer, at ændringen i ECAR primært drives af H+ frigivelse fra glycolyse. Stigningen i OCR er, som forventet, blokeret af antimycin A og rotenon (figur 4D), men det er også hæmmet af 2-DG (figur 4B) afslører, at stigningen i oxphos under sædcelle behandling er afhængig af glykolytisk aktivitet.

Figure 1
Figur 1: princippet i den ekstracellulære flux analysator. A) på grund af nedbrydningen af glukose til laktat under glykolyse og generationen af co2 via TCA-cyklussen ledsages ændringer i glycolyse og Oxphos af H+ udskillelse i det ekstracellulære medie. XFe96 Analyzer registrerer disse ændringer i ekstracellulær H+ koncentration som ECAR. Parallelt hermed måles ændringer i ekstracellulær O2 -koncentration på grund af o2 forbrug ved oxidativ fosforylering som OCR. Blokering af glycolyse med 2-deoxyglucose (2-DG) eller respiration med de komplekse I og komplekse III-hæmmere rotenon og antimycin A afslører, hvilke metaboliske veje der understøtter den stigende energiefterspørgsel under sædcapacitation. B) muse sædceller fastgøres via deres hoveder til bunden af et ConA-belagt mikrokammer deres flageller er frit bevægende. Mens ændringer i den ekstracellulære H+ og o2 koncentration detekteres af h+-og O2-følsomme fluorophorer immobiliseret til en sensor sonde, kan op til fire forskellige forbindelser injiceres sekventielt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk gengivelse af det eksemplariske eksperiment. Ændringer i vogn (mpH/min) og OCR (pmol O2/min) detekteres i ikke-kapaciterede og kondensator sædceller ved hjælp af en ekstracellulær flux analysatoren. Cyklus 1: basal ECAR og OCR værdier. Cyklusser 2-5: system stabilisering efter TYH mock injektion. Cyklusser 6-8: inkubation af lægemidler. Cyklusser 9-27: Sædcapacitation. Pilene indikerer injektioner. 2-DG: endelig koncentration 50 mM, AntA/Rot: endelig koncentration 0,5 μM, DB-cAMP: slutkoncentration 1 mM, IBMX: endelig koncentration 500 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: data analyse. (A) rå data om ændringer i ECAR under mus sædkapering. B) data efter fjernelse af de første 7 datapunkter. (C) data normaliseret til datapunktet før Camp/ibmx injektion. Data vises som middelværdien af 7-8 brønde ± S.E.M. injektioner er indikeret med en pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: ændringer i glykolyse og oxidativ fosforylering under muse sædcapacitation. (A) NORMALISERET vogn i ikke-kapaciteret og kondenseret mus sperm i nærværelse af og fravær af 50 mm 2-DG. (B) NORMALISERET OCR i ikke-kapaciteret og kapacitating mus sperm i nærværelse af og fravær af 50 mm 2-DG. C) NORMALISERET vogn i ikke-kapaciteret og kondenseret muse sædceller ved tilstedeværelse og fravær af 0,5 μM antimycin A og rotenon. (D) NORMALISERET OCR i ikke-kapaciteret og kapacitating mus sperm i nærværelse af og fravær af 0,5 μM antimycin A og rotenon. Data vises som middelværdien ± S. E. M normaliseret til datapunktet før DB-cAMP/IBMX injektion; n = 6. Injektioner indikeres med en pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Port Antal cyklusser Mix (min) Vent (min) Foranstaltning (min.)
A: basal ECAR/OCR ingen port 1 2:00 0:00 3:00
B: mock injektion 1 4 2:00 0:00 3:00
C: Drug injektion 2 3 2:00 0:00 3:00
D: Capacitation 3 18 2:00 0:00 3:00

Tabel 1: Måledetaljer.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: Capacitation af mus sperm i ekstracellulær flux analysator TYH buffer. Fosforylering af tyrosin rester af muse sperm detekteres på forskellige tidspunkter under kursuskapacitering (0-90 min) efter inkubation i (A) tyh med 25 mm HCO3-, 3 mg/ml BSA og 20 mm Hepes eller i (B) ekstracellulær flux analysator tyh med 5 mm DB-Camp, 500 μM ibmx og 1 mm Hepes, detekteret med et α-phosphotyrosin-antistof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: Wave assay skabelon til at detektere ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering under mus sperm capacitation. Wave Desktop software kan downloades gratis efter at udfylde en registreringsformular (www.Agilent.com/en/Products/Cell-Analysis/Cell-Analysis-software/data-analysis/Wave-desktop-2-6) og installeret på Windows 7, 8 eller 10, (Mac osx 10,11 (eller højere) med paralleller 12 (eller højere). Derved kan bølgeskabeloner genereres uafhængigt af den ekstracellulære flux analysator, eksporteres og derefter importeres til Wave-software af enhver ekstracellulær flux analysator. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende fil 2: Graph pad prisme fil eksporteret fra Wave software med eksemplarisk dataanalyse. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tabet af sædcapacitation i fravær af visse metaboliske substrater eller kritiske metaboliske enzymer afslørede energimetabolisme som en nøglefaktor, der støtter vellykket befrugtning. En metabolisk switch under celle aktivering er et veletableret koncept i andre celletyper, men vi er lige begyndt at forstå, hvordan sædceller tilpasser deres metabolisme til den stigende energiefterspørgsel under capacitation. Ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator, vi udviklet et let anvendeligt værktøj til at overvåge ændringer i glycolyse og oxidativ fosforylering i realtid under sperm capacitation. Påvisning af ændringer i ekstracellulær H+ og O2 med fluorophorer, der er immobiliseret til en sensor sonde, er minimalt invasiv, og de fire individuelt betjente injektions porte tillader manipulation med farmakologiske hæmmere eller aktivatorer på særskilte tidspunkter før eller under kursuskapacitering-processen. Denne protokol giver kun et eksempel på en mus sperm kursuskapacitering eksperiment. For at forenkle fortolkningen af resultaterne valgte vi showet et eksemplarisk eksperiment, hvor glukose blev brugt som den eneste energikilde. Betingelserne er variable afhængigt af eksperimentets mål, og op til 12 forskellige betingelser (dvs. forskellige energikilder som glucose vs. glucose og pyruvat) kan måles parallelt. Derudover tillader fire uafhængige Indsprøjtnings porte injektion af farmakologiske aktivatorer og/eller hæmmere på ethvert ønsket tidspunkt før eller under capacitation. Dette åbner mulighed for at bruge den ekstracellulære flux analysator som en semi High-gennemløb screening enhed. Svarende til mus sperm, i andre arter som mennesker eller kvæg er det stadig gådefulde hvordan sperm ændre deres metabolisme under capacitation. Protokollen kan let tilpasses; således anbefaler vi at optimere sædkoncentrationen hver gang, før du starter et rigtigt eksperiment.

Protokollens største begrænsning er, at resultater af høj kvalitet kun kan opnås i fravær af bicarbonat. Bicarbonat i sædvæske er det fysiologiske signal, der initierer sædcellens kursuskapacitering signalering Cascade efter ejakulation. Bicarbonat aktiverer den opløselige adenylyl cyclase (sAC; ADCY10), som katalyserer omdannelsen af ATP til cAMP23. Stigningen i lejren derefter driver en signalering kaskade medieret af protein kinase a, som i sidste ende fører til downstream tyrosin fosforylering af målproteiner (f. eks Ionkanaler, metaboliske enzymer, og strukturelle proteiner24,25). Denne begrænsning mod bicarbonat er overvundet ved at injicere produktet af bicarbonat-aktiveret sAC, lejr. Vi bruger 5 mM af cellen-permeable cAMP analog DB-cAMP parallelt med den brede specificitet fosfodiesterasehæmmer IBMX, som forhindrer hurtig nedbrydning af DB-cAMP ved fosfodiesteraser. Denne kombination initierer effektivt den lejr regulerede kursuskapacitering signalering pathway post sAC aktivering med en lignende kinetisk som bicarbonat (supplerende figur 1). Parallelt med bicarbonat, en kolesterol acceptor (f. eks, BSA) bruges til in vitro-kondensat frisk ejakuleret sperm eller sperm dissekerede fra cauda epididymis. Albumin kan ikke injiceres, fordi det træsko injektionsporten og derfor skal tilsættes til sperm buffer før plating cellerne. Udførelse af forsøget i nærværelse af eller fravær af BSA afslørede, at stigningen i ECAR og OCR under sperm kursuskapacitering er uafhængig af kolesterol acceptoren. Tilstedeværelsen af BSA i sædbufferen reducerede imidlertid udsving i de fundne ECAR-og OCR-værdier mellem forskellige brønde og eksperimenter; således anbefaler vi stærkt, herunder BSA i sædbufferen for at øge reproducerbarhed.

Isolering af sæd fra cauda epididymis resulterer i kontaminering af sperm med epididymale væske. For at undgå kunstige resultater på grund af sædvæske komponenter anbefaler vi, at du vasker sædceller to gange, før du bruger dem til et eksperiment. Sædkoncentration og plettering er en anden kritisk faktor, der afgør eksperimentets succes. For at sikre pålidelige resultater anbefaler producenten, at initiale ECAR-værdier er større end 10 og OCR-værdier, der skal være større end 20. Den sædkoncentration, der anvendes i denne protokol, blev optimeret, således at de gennemsnitlige basal ECAR-og OCR-værdier for 7-8 brønde målt pr. betingelse er over henholdsvis 10 og 20. Frit bevægende sperm forstyrrer påvisning af ændringer i ekstracellulær H+ og O2. Således er det afgørende at overholde alle sæd med deres hoved til bunden af pladen. Vi fandt succes fastholdelsen sperm ved belægning pladen med ConA, en plante lektin, der specifikt interagerer med den ydre acrosomale membran og er almindeligt anvendt til acrosome assays26, og ved forsigtigt spinning pladen (Se trin 2.7.3). Med denne metode, er sperm lokaliseret til bunden af brønden udelukkende via deres hoved, så de kan stadig frit flytte deres flageller og ændre deres flagellar slå mønster under capacitation.

Sperm konstant Extrude H+ og O2 i begge, den ikke-kondenseret og den kondenseret tilstand. For at bestemme den oprindelige vogn og OCR så præcist som muligt, er det afgørende at starte eksperimentet så hurtigt, som du kan efter det sidste vaske trin. Dette kan opnås ved at indlæse sensor patronen, mens sædcellerne svømmer ud og ved at starte metoden i den ekstracellulære flux analysator før det første vaske trin. Kalibrering af instrumentet tager omtrent samme tid som vask og plating af cellerne og spinding af pladen. Fabrikanten anbefaler en ækvibrations fase for at give systemet mulighed for at stabilisere sig, før det første rigtige datapunkt måles. Da protokollen indeholder 8 måle cyklusser, før kursuskapacitering påbegyndes, for at spare tid, er ækvilibrering Step udelukket fra denne protokol.

Evnen til at injicere opløsninger under analysen og til at observere deres virkninger på respiration og glykolytisk hastighed i realtid er et centralt element i den ekstracellulære flux analysator. Indlæsning af sensor patronen er et af de kritiske trin i protokollen og bør udføres omhyggeligt. For at sikre korrekt injektion i alle brønde, skal hver serie af havne indeholde den samme volumen, herunder baggrunden brønde. Indlæsning af portene med en multikanals pipette kræver en vis øvelse, men mindsker variabiliteten og indlæsningstiden betydeligt. Vi anbefaler stærkt at bruge port loading guide, men at injicere kun fire porte samtidigt. Det er også vigtigt at forstå, at under lastning, injektion volumener gradvist øges for at kompensere for den stigende volumen i brønden. Når du indlæser sensor patronen, er det vigtigt ikke at sætte tippene helt ind i porten. Dette kan for tidligt skubbe injektionsopløsningen gennem havne åbningen. Samtidig med at fastsætte den metode, vi fandt, at indsprøjtning af væske i en sperm godt forårsager uvelkomne injektion artefakter, sandsynligvis på grund af fortynding af sædcellerne i brønden og/eller forstødning sperm fra brønd bunden. Den første injektion forårsager den største injektion artefakt, så vi inkluderede en mock injektion med sperm buffer i alle brønde i begyndelsen af protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller High gennemløb og spectroscopy Resource Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292, (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411, (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109, (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58, (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168, (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149, (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61, (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87, (3), 75 (2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276, (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64, (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82, (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101, (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49, (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110, (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26, (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49, (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262, (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278, (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290, (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96, (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121, (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105, (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24, (8), 999-1007 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics