Bruke en ekstracellulære Flux Analyzer til å måle endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under Mouse sperm Capacitation

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver anvendelsen av en ekstracellulære Flux analysator å overvåke sanntid endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under musen sperm capacitation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pattedyr sperm erverve befruktning kapasitet i den kvinnelige reproduktive tarmkanalen i en prosess kjent som capacitation. Capacitation-assosierte prosesser krever energi. Det gjenstår en pågående debatt om kildene generere ATP som brensel sperm progressiv motilitet, capacitation, hyperactivation, og acrosome reaksjon. Her beskriver vi anvendelsen av en ekstracellulære Flux analysator som et verktøy for å analysere endringer i energi metabolisme under musen sperm capacitation. Ved bruk av H+-og O2-sensitive fluorophores, kan denne metoden overvåke Glykolysen og oksidativt fosforylering i sanntid i ikke-capacitated versus capacitating sperm. Ved hjelp av denne analysen i nærvær av ulike energi underlag og/eller farmakologiske Aktivator og/eller hemmere kan gi viktig innsikt i bidraget av ulike metabolske trasé og skjæringspunktet mellom signalering kaskader og metabolisme under sperm capacitation.

Introduction

Anvendelsen av masse massespektrometri har revolusjonert studiet av metabolisme. Målrettet metabolsk profilering og metabolomic tracing tillate presis overvåking av endringer i energi metabolisme. Men utfører Plantemetabolomikk vellykket krever omfattende opplæring, erfarne ansatte, og dyre, svært følsom masse spektrometre ikke lett tilgjengelig for hvert laboratorium. I de senere årene, ved hjelp av en ekstracellulære Flux Analyzer, slik som Seahorse XFe96 har vokst populær som en surrogat metode for å måle endringer i energi metabolisme i ulike celletyper1,2,3,4,5.

Sperm er svært spesialiserte aktive celler; Hvis oppgave er å levere fars Genova til oocyte. Sperm forlate den mannlige reproduktive tarmkanalen etter utløsning er fortsatt funksjonelt umodne og kan ikke gjødsle oocyte fordi de ikke er i stand til å trenge inn i oocytter ' gevantene. Sperm erverve befruktning kompetanse som de transitt gjennom kvinnelige reproduktive tarmkanalen i en modningsprosess kjent som capacitation6,7. Fersk utbrøt sperm eller sperm dissekert fra cauda bitestikkel kan være capacitated in vitro av inkubasjons i definerte capacitation medier som inneholder ca2 +, bikarbonat (HCO3-) eller en celle-gjennomtrengelig leir analog (f. eks dibutyryl-cAMP), en kolesterol Acceptor (f. eks, storfe serum albumin, BSA), og en energikilde (f. eks, glukose). Under capacitation, sperm endre sin motilitet mønster i en asymmetrisk flagellar beat, som representerer en svømming modus kalt hyperactivation8,9, og de blir kompetente til å gjennomgå acrosome reaksjon7, der proteolytiske enzymer slippes som fordøye oocytter ' gevantene. Disse prosessene krever energi, og ligner på somatiske celler, sperm generere ATP og andre høy energi forbindelser via Glykolysen samt mitokondrie TCA-syklus og oksidativt fosforylering (oxphos)10. Mens flere studier viser at Glykolysen er nødvendig og tilstrekkelig for å støtte sperm capacitation11,12,13,14, er bidraget fra oxphos mindre klart. I motsetning til andre celletyper der Glykolysen er fysisk koblet til TCA-syklusen, sperm er svært compartmentalized og antas å opprettholde disse prosessene i separate flagellar rom: midpiece konsentrerer mitokondrie maskiner, mens de viktigste enzymene av Glykolysen synes å være begrenset til rektor stykket15,16. Dette compartmentalization resulterer i en pågående debatt om hvorvidt pyruvat produsert i hoveddelen av Glykolysen kan støtte mitokondrie oxphos i midpiece, og om ATP produsert av oxphos i midpiece ville være i stand til å diffuse tilstrekkelig raskt langs lengden av flagellum for å støtte energibehovet i klare deler av rektor stykket17,18,19. Det er også støtte av en rolle for oxphos i sperm capacitation. Ikke bare er oxphos mer energisk gunstige enn Glykolysen, genererer 16 ganger mer ATP enn Glykolysen, men midpiece volum og mitokondrie innhold er direkte korrelert med reproduktiv fitness i pattedyrarter som viser større grad av konkurranse mellom menn for kameratene20. Adressering disse spørsmålene krever metoder for å undersøke den relative bidrag av Glykolysen og oxphos under sperm capacitation.

Tourmente et al. påføres en 24-brønn ekstracellulære Flux analysator å sammenligne energimetabolismen av nært beslektede mus arter med signifikant forskjellig sperm ytelse parametere21. I stedet for å rapportere basal ECAR og OCR verdier av ikke-capacitated sperm, her tilpasser vi deres metode ved hjelp av en 96-brønn ekstracellulære Flux analysator for å overvåke endringer i energi metabolisme under musen sperm capacitation i sanntid. Vi utviklet en metode som gjør det mulig samtidig overvåking Glykolysen og oxphos i sanntid i sperm med juling flagella i opptil tolv ulike eksperimentelle forhold ved å måle Flux av oksygen (O2) og protoner (H+) (figur 1a). På grunn av nedbryting av pyruvat til melkesyre under Glykolysen og produksjon av CO2 via TCA-syklusen, ikke-capacitated og capacitated sperm extrude h+ inn i analysen Media som oppdages av ekstracellulære Flux analysator via H+-sensitive fluorophores immobilisert til sonden spissen av en sensor patron. I parallell oppdages O2 -forbruk ved oksidativt fosforylering via O2-følsom fluorophores immobilisert til samme sonde TIP (figur 1B). Effektiv påvisning av den utgitte H+ og forbrukes O2 krever en modifisert sperm buffer med lav bufring kapasitet uten bikarbonat eller fenol rød. Således, for å indusere capacitation i fravær av bikarbonat, vedtok vi bruk av en celle gjennomtrengelig cAMP analog injisert sammen med bred-Range PDE inhibitor IBMX22. Tre ekstra uavhengige injeksjon porter tillate injeksjon av farmakologiske Aktivator og/eller hemmere, som forenkler sanntids deteksjon av endringer i cellulær åndedrett og Glykolysen rate på grunn av eksperimentell manipulasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sperm er samlet fra 8-16-uke gamle CD-1 mannlige mus. Animal eksperimenter ble godkjent av Weill Cornell Medicine ' s institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).

1. dag før analysen

  1. Utarbeidelse av sensor patron og ekstracellulære Flux analysator calibrant
    1. Hvis du vil hydrere sensor patronen, fjerner du sensor patronen fra XFe96 ekstracellulære Flux analysen Kit og plasserer sensor patronen opp-ned ved siden av verktøy platen.
    2. Fyll et løsnings reservoar med 25 mL dobbel destillert H2O ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 200 ΜL av H2o til hver brønn på verktøy platen. Sett sensor patronen tilbake i ruge og over natten i en 37 ° c non-CO2 inkubator.
      Merk: patronen må være hydrert i minst 4 timer.
    3. Alikvot 25 mL av ekstracellulære Flux analysator calibrant inn i en 50 mL konisk rør og ruge den over natten i en 37 ° c non-CO2 inkubator.
  2. Fremstilling av ConA-belagt mikroplater
    1. Løs opp 2,5 mg ConA i 5 mL dobbelt destillert H2O for å klargjøre en 0,5 mg/ml (w/v) lager.
    2. Bruk en flerkanals pipette til å fylle hver brønn av en ekstracellulære Flux Analyzer 96-brønn plate med 50 μL av 0,5 mg/mL con A-løsningen. La lokket stå åpent og la tallerkenen tørke over natten ved romtemperatur.
      Merk: flere plater kan være belagt på en gang og oppbevares ved 4 ° c i opptil fire uker til de er klare til bruk.
  3. Utarbeidelse av sperm buffer
    1. Forbered 250 mL av ekstracellulære Flux Analyzer TYH buffer med lav HEPES inneholdende 138 mm NaCl, 4,7 mm KCl, 1,7 mm CaCl2, 1,2 mm KH2PO4, 1,2 mm MgSO4, 5,6 mm glukose, og 1 mm HEPES. Varm opp bufferen til 37 ° c og Juster pH til 7,4.

2. dag i analysen

  1. Forberedelse til kassett kalibrering
    1. Skift ut H2O i verktøy tallerkenen med 200 ΜL av XF calibrant per brønn og ruge i minst 1 time i en ikke-CO2 37 ° c inkubator.
      Merk: i stedet for calibrant, steril-filtrert PBS, kan pH 7,4 brukes.
    2. Heat 50 mL TYH buffer ved 37 ° c.
  2. Generere en bølge mal for ekstracellulære Flux Analyzer
    1. Drei ekstracellulære Flux-analysator på og la temperaturen stabilisere seg til 37 ° c.
    2. Åpne bølgen programvaren og designe en ny mal ved å åpne en tom mal (se ekstra fil 1, Wave mal).
    3. Åpne kategorien gruppe definisjoner . Definer analyse medier som TYH; pH 7,4 og celle type som mus sperm, la injeksjon strategier og pretreatments blank. Opprette ulike grupper for hver analysen tilstand; i dette eksempelet er det 6 forskjellige grupper (TYH, TYH + DB-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + DB-cAMP/IBMX, Ant/rot, Ant/rot + DB-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (DB-cAMP) og 3-Isobutyl-1-metylxanthin (IBMX) for å indusere capacitation, 2-deoxyglucose (2-DG) som Glykolysen inhibitor, antimycin A (antA) og rotenon (råte) som hemmer av komplekse III og komplekse I av elektron transport kjeden.
      Merk: for å gjøre rede for variasjon mellom brønnene bør minst 7-8 brønner per betingelse måles parallelt.
    4. Åpne kategorien plate kart , og Definer plate kartet ved å tilordne grupper til bestemte brønner.
      Merk: de fire hjørne brønner (a1, A12, H1, h12) vil bli fylt med TYH buffer (ingen sperm) og vil senere bli brukt for bakgrunns subtraksjon.
    5. Åpne kategorien protokoll , Legg til 4 forskjellige måle sykluser, Velg den respektive porten og Rediger målings detaljene (figur 2, tabell 1). Uthev mål etter injeksjon og ikke Uthev likevekt.
    6. Lagre analysen malen, fyll ut prosjektsammendraget og definere lagringssted for resultatene filen.
  3. Utarbeidelse av forbindelser å laste inn sensor patron
    1. Forbered 2 mL 50 mM DB-cAMP ved oppløsning 9,8 mg sammensatte i TYH buffer og legge IBMX til en endelig konsentrasjon på 5 mM.
      Merk: IBMX har tendensen til å utløse etter å ha blitt fortynnet i TYH buffer. Precipitates kan oppløses ved å virvlingen og incubating TYH/DB-cAMP/IBMX-løsningen i en 37 ° c varme blokk i 5 minutter.
    2. Forbered 1 mL 500 mM 2-DG ved oppløsning 82,1 mg av sammensatte i TYH buffer.
    3. Forbered 1 mL 5 μM ved å AntA/råte ved å fortynne begge stoffene i TYH buffer.
      Merk: forbindelsene er fortynnet 10-fold ved injeksjon i ekstracellulære Flux analysator kassetten; Sørg derfor for at injeksjons løsninger er 10x mer konsentrert.
  4. Isolering av mus sperm
    1. Bedøve 3 mannlige mus mellom 8 og 16 uker ved isoflurane og ofre musene ved cervical forvridning etter at ingen reaksjon på tå knipe ble oppdaget. Fjern cauda bitestikkelvekt og Vasa deferentia.
    2. Plasser hver cauda i 500 μL av prewarmed TYH buffer i 24-brønn plate godt, nakkens cauda til bunnen av platen ved hjelp av et par tang og åpne vevet ved å gjøre 5-7 små snitt med fjær saks.
    3. Overfør platen umiddelbart til en ikke-CO2 37 ° c inkubator og la sperm spre seg i 15 min.
  5. Lasting av sensor patronen
    1. To port innlastings veiledninger for port A og D og port B og C er angitt i ekstracellulære Flux-settet. Når du skal laste inn en bestemt port, fjerner du lokket fra sensor patronen og justerer bokstaven for den respektive port innlastings veiledningen med det øvre venstre hjørnet av kassetten. Mens du injiserer, bruk fingertuppene til den ikke-injiserer hånden til å holde port lasting guide på plass og sett inn pipette tips vertikalt i Port lasting guide hull.
    2. Port A: ved hjelp av en flerkanals pipette, injiserer du 20 μL av TYH-bufferen i hver kolonne.
    3. Port B: Injiser 22 μL av TYH buffer i kolonne 1-4, Injiser 22 μL av 500 mM 2-DG i kolonne 5-8, og 25 μL av 5 μM AntA/rot i kolonne 9-12.
    4. Port C: Injiser 25 μL av TYH buffer i hver kolonne med oddetall, Injiser 25 μL av 10 mM DB-cAMP/500 μM IBMX i hver kolonne med jevne tall.
    5. Sett sensor patronen med kalibrerings platen inn i ekstracellulære Flux Analyzer og start analysen. Kalibreringen tar 10-15 min.
  6. Utarbeidelse av sperm plater
    1. Løs opp 45 mg BSA i 15 mL TYH-buffer (3 mg/mL w/v) og klargjør tre alikvoter med 3 mL BSA/TYH-oppløsning hver i 5 mL sentrifugerør.
    2. Kombiner to sperm brønner hver i en 1,5 mL sentrifugerør, telle sperm ved hjelp av en hematocytometer og fortynne sperm til en konsentrasjon av 2 x 107 sperm/ml.
      Merk: Bruk kutt pipette tips for pipettering sperm for å unngå å skade cellene.
    3. Sentrifuger sæden i 3 min ved 700 x g, Fjern supernatanten og tilsett 1 ml TYH buffer. Gjenta sentrifugering trinnet, Fjern supernatanten og Overfør hver sperm suspensjon alikvot til ett 5 mL sentrifugerør med 3 mL BSA/TYH.
    4. Plasser 180 μL av TYH buffer i hvert hjørne brønn (a1, A12, H1, h12) av en ConA-belagt plate. Plasser 180 μL av sperm fjæring i hver tomme brønn på den ConA-belagte platen (1,2 x 106 sperm/brønn).
    5. Sentrifuger sperm platen ved 250 x g i 1 min, Roter platen med 180 °, og sentrifuger igjen ved 250 x g i 1 min (laveste bremse hastighet 1).
    6. Fjern kalibrerings platen fra den ekstracellulære Flux-analysator og tilsett sperm plate. Fortsett analysen.
  7. Data utvinning og analyse
    1. Etter å ha fullført analysen, ta ut patronen, åpne resultatfilen, klikk på Export -fanen og Eksporter den fullførte kjøringen som en GraphPad Prism-fil (tilleggsfil 2: primær eksempel data som brukes for Figur 3).
    2. Duplisere det ECAR og OCR arkiv av klikker på ny tab og så det kopiere slekt... Tab (skikkelsen 3en).
    3. Slett de første 7 radene med data (Figur 3B).
    4. Normalisere til datapunktet før cAMP/IBMX-injeksjon ved Baseline subtrahere rad 1. Falle i staver på analysere tab, så på fjerne Baseline og søylen Math tab. Fremhev merkede rad (er): første rad, beregning: forhold: verdi/Baseline, og Subcolumns: Ignorer Subcolumn. Klikk OK (Figur 3C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden bruker en ekstracellulære Flux analysator å overvåke sanntid endringer i frekvensen av Glykolysen og oxphos under musen sperm capacitation. Figur 4 viser en eksemplarisk eksperiment der sperm ble capacitated i nærvær av glukose som den eneste energien underlaget og 2-DG og antimycin og rotenon som farmakologiske modulatorer. Energien underlaget i ekstracellulære Flux analysator TYH buffer og farmakologiske modulatorer kan fritt velges avhengig av målet for eksperimentet. Ikke-capacitated mus sperm i BSA/TYH var festet til bunnen av en ConA-belagt transient gassmikrokammeret via hodet. I dette eksempelet er basal ECAR-og OCR-verdier i gjennomsnitt mellom alle de oppdagede brønnene 12,76 ± 2,75 mpH/min og 23,64 ± 2,78 pmol/min.

Etter en mock injeksjon med TYH buffer, etterfulgt av injeksjon av 2-DG og Ant/råte å hemme Glykolysen og oksidativt fosforylering, henholdsvis, sperm capacitation ble indusert ved injeksjon av DB-cAMP/IBMX.

Den representative resultatene viser at i nærvær av glukose, capacitation ledsages av en 7-fold økning i ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som er hemmet av blokkering Glykolysen med 2-DG (Figur 4a). Capacitated sperm viser en 20-fold økning i oksygenforbruk rate (OCR) sammenlignet med ikke-Capacitated sperm (Figur 4B), viser at musen sperm forbedre både Glykolysen og oksidativt fosforylering å støtte økende energibehov under capacitation. Økningen i ECAR under sperm capacitation er hemmet av Glykolysen inhibitor 2-DG, men ikke påvirket av oksidativt fosforylering hemmere antimycin A og rotenon (Figur 4C), som indikerer at endringen i ECAR er i hovedsak drevet av H+ Release fra Glykolysen. Økningen i OCR er, som forventet, blokkert av antimycin A og rotenon (Figur 4D), men det er også HEMMET av 2-DG (Figur 4B) avslørende at økningen i oxphos under sperm capacitation er avhengig av glycolytic aktivitet.

Figure 1
Figur 1: prinsippet for ekstracellulære Flux-analysator. (A) på grunn av nedbrytning av glukose til melkesyre under Glykolysen og GENERERING av co2 via TCA-syklusen, endringer i Glykolysen og oxphos ledsages av H+ utskillelse i ekstracellulære Media. XFe96 Analyzer oppdager disse endringene i ekstracellulære H+ -konsentrasjon som ECAR. Parallelt er endringer i ekstracellulære O2 -konsentrasjon på grunn av o2 -forbruk ved OKSIDATIVT fosforylering målt som OCR. Blokkering Glykolysen med 2-deoxyglucose (2-DG) eller åndedrett med komplekse I og komplekse III hemmere rotenon og antimycin A avslører hvilke metabolske veier støtte den økende energibehovet under sperm capacitation. (B) mus sperm er festet via hodet til bunnen av en ConA-belagt gassmikrokammeret; flagella deres beveger seg fritt. Mens endringer i ekstracellulære H+ og o2 konsentrasjon oppdages av H+-og o2-følsomme fluorophores immobilisert til en sensor sonde, kan opptil fire forskjellige forbindelser injiseres sekvensielt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk fremstilling av eksemplarisk eksperiment. Endringer i ECAR (mpH/min) og OCR (pmol O2/min) oppdages i ikke-capacitated og capacitating sperm ved hjelp av en ekstracellulære Flux analysator. Syklus 1: basal ECAR-og OCR-verdier. Sykluser 2-5: system stabilisering etter TYH mock injeksjon. Sykluser 6-8: Drug inkubasjons. Sykluser 9-27: sperm capacitation. Pilene angir injeksjoner. 2-DG: endelig konsentrasjon 50 mM, AntA/rot: endelig konsentrasjon 0,5 μM, DB-cAMP: endelig konsentrasjon 1 mM, IBMX: endelig konsentrasjon 500 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: data analyse. (A) rådata om endringer i ECAR under mus sperm capacitation. (B) data etter fjerning av de første 7 datapunkter. (C) data normalisert til datapunktet før Camp/IBMX injeksjon. Data vises som gjennomsnittet av 7-8 brønner ± S.E.M. injeksjoner er indikert med en pil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Bilde 4: endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under muse sperm capacitation. (A) normalisert ECAR i ikke-capacitated og capacitating mus sperm i nærvær og fravær av 50 mm 2-DG. (B) normalisert OCR i ikke-capacitated og capacitating mus sperm i nærvær og fravær av 50 mm 2-DG. (C) normalisert ECAR i ikke-capacitated og capacitating mus sperm i nærvær og fravær av 0,5 ΜM antimycin A og rotenon. (D) normalisert OCR i ikke-capacitated og capacitating mus sperm i nærvær og fravær av 0,5 ΜM antimycin A og rotenon. Data vises som middel ± S. E. M normalisert til datapunktet før DB-cAMP/IBMX injeksjon; n = 6. Injeksjoner indikeres med en pil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Port Antall sykluser Mix (min) Vent (min) Mål (min)
A: basal ECAR/OCR ingen port 1 2:00 0:00 3:00
B: mock injeksjon 1 4 2:00 0:00 3:00
C: injeksjon av sprøyte 2 3 2:00 0:00 3:00
D: Capacitation 3 18 2:00 0:00 3:00

Tabell 1: målings detaljer.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: Capacitation av mus sperm i ekstracellulære Flux ANALYSATOR TYH buffer. Fosforylering av tyrosin rester av mus sperm oppdaget på ulike tidspunkter under capacitation (0-90 min) etter inkubasjons i (A) TYH med 25 mm HCO3-, 3 mg/ml BSA og 20 mm HEPES eller i (B) ekstracellulære Flux-analysator TYH med 5 mm DB-cAMP, 500 μM IBMX og 1 mm HEPES, oppdaget med et α-phosphotyrosine antistoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1: Wave analysen mal for å oppdage endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under muse sperm capacitation. Bølgen desktop programvare kan lastes ned gratis etter å fylle ut et registreringsskjema (www.Agilent.com/en/Products/Cell-Analysis/Cell-Analysis-Software/data-Analysis/Wave-Desktop-2-6) og installert på Windows 7, 8 eller 10, (Mac OSx 10,11 (eller høyere) med Parallels 12 (eller høyere). Derved kan bølgemaler genereres uavhengig av ekstracellulære Flux analysator, eksporteres og deretter importeres inn i bølgen programvare av noen ekstracellulære Flux analysator. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggsfil 2: Graph pad prisme fil eksportert fra Wave programvare med eksemplarisk dataanalyse. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tapet av sperm capacitation i fravær av visse metabolske underlag eller kritiske metabolske enzymer avslørte energi metabolisme som en nøkkelfaktor som støtter vellykket befruktning. En metabolsk bryter under celle aktivering er et veletablert begrep i andre celletyper, men vi er bare begynnelsen for å forstå hvordan sperm tilpasse metabolismen til den økende energietterspørselen under capacitation. Bruke en ekstracellulære Flux analysator, vi utviklet et lett anvendelig verktøy for å overvåke endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering i sanntid under sperm capacitation. Påvisning av endringer i ekstracellulære H+ og O2 med fluorophores immobilisert til en sensor sonde er minimalt invasiv og de fire individuelt opererte injeksjons porter tillate manipulasjon med farmakologiske hemmere eller aktivator på forskjellige tidspunkt punkter før eller under capacitation prosessen. Denne protokollen gir bare ett eksempel på en mus sperm capacitation eksperiment. For å forenkle tolkningen av resultatene vi valgte showet en eksemplarisk eksperiment der glukose ble brukt som eneste energikilde. Forholdene er variable avhengig av målet for eksperimentet, og opp til 12 ulike forhold (dvs. forskjellige energikilder som glukose kontra glukose og pyruvat) kan måles parallelt. I tillegg fire uavhengige injeksjon porter tillate injeksjon av farmakologiske Aktivator og/eller hemmere på et ønsket tidspunkt før eller under capacitation. Dette åpner muligheten til å bruke ekstracellulære Flux analysator som en semi høy gjennomstrømming screening enhet. I likhet med mus sperm, i andre arter som menneske eller storfe er det fortsatt gåtefulle hvordan sperm endre metabolismen under capacitation. Protokollen kan enkelt tilpasses; Derfor anbefaler vi at du optimaliserer sperm konsentrasjonen hver gang før du starter et virkelig eksperiment.

Protokollen største begrensningen er at høy kvalitet resultater kan bare oppnås i fravær av bikarbonat. Bikarbonat i banebrytende væske er fysiologisk signal som initierer sperm ' s capacitation signalering Cascade etter utløsning. Bikarbonat aktiverer løselig adenylyl cyclase (sAC; ADCY10), som katalyserer konvertering av ATP i cAMP23. Økningen i leiren deretter kjører en signalering Cascade mediert av protein kinase a, som til slutt fører til nedstrøms tyrosin fosforylering av målet proteiner (f. eks, ion-kanaler, metabolske enzymer, og strukturelle proteiner24,25). Denne begrensningen mot bikarbonat er overvunnet ved å injisere produktet av bikarbonat-aktivert sAC, cAMP. Vi bruker 5 mM av celle gjennomtrengelig cAMP analoge DB-cAMP parallelt med den brede spesifisitet fosfodiesterase inhibitor IBMX, som hindrer rask nedbrytning av DB-cAMP ved phosphodiesterases. Denne kombinasjonen initierer effektivt cAMP-regulert capacitation signalering Pathway post sAC aktivering med en lignende kinetisk som bikarbonat (supplerende figur 1). Parallelt med bikarbonat, en kolesterol Acceptor (f. eks, BSA) brukes til in vitro capacitate fersk utbrøt sperm eller sperm dissekert fra cauda bitestikkel. Albumin kan ikke injiseres fordi det tresko injeksjon porten, og derfor må legges til sperm buffer før plating cellene. Utføre eksperimentet i nærvær eller fravær av BSA avdekket at økningen i ECAR og OCR under sperm capacitation er uavhengig av kolesterol Acceptor. Tilstedeværelsen av BSA i sæd bufferen reduserte imidlertid svingninger i de oppdagede ECAR-og OCR-verdiene mellom ulike brønner og eksperimenter. Derfor anbefaler vi på det sterkeste å inkludere BSA i sæd bufferen for å øke reproduserbarheten.

Isolere sperm fra cauda bitestikkel resulterer i forurensning av sperm med epididymale væske. For å unngå kunstige resultater på grunn av banebrytende væske komponenter, anbefaler vi vask sperm to ganger før du bruker dem for et eksperiment. Sperm konsentrasjon og plating er en annen kritisk faktor bestemme suksessen til eksperimentet. For å få pålitelige resultater anbefaler produsenten at de første ECAR-verdiene er større enn 10, og at OCR-verdier er større enn 20. Sperm konsentrasjonen som brukes i denne protokollen ble optimalisert slik at den gjennomsnittlige basale ECAR og OCR verdier av 7-8 brønner målt per tilstand er over 10 og 20, henholdsvis. Fritt bevegelige sperm forstyrrer påvisning av endringer i ekstracellulære H+ og O2. Dermed er det avgjørende å overholde alle sperm med hodet til bunnen av platen. Vi fant suksess følge sperm ved belegg platen med ConA, en plante Lektiner som spesifikt samhandler med den ytre acrosomal membran og brukes ofte for acrosome analyser26, og ved forsiktig spinning platen (se trinn 2.7.3). Med denne metoden, sperm er lokalisert til bunnen av brønnen utelukkende via hodet slik at de kan fortsatt fritt flytte sine flagella og endre sine flagellar juling mønster under capacitation.

Sperm stadig extrude H+ og O2 i begge, ikke-capacitated og capacitated tilstand. For å bestemme den første ECAR og OCR så nøyaktig som mulig, er det avgjørende å starte eksperimentet så raskt som du kan etter det siste vaske trinnet. Dette kan gjøres ved å legge sensoren kassetten mens sperm svømmer ut og ved å starte metoden i ekstracellulære Flux analysator før første vask trinn. Kalibrering av instrumentet tar omtrent samme tid som vasking og plating av cellene og spinning platen. Produsenten anbefaler en likevekts fase for å la systemet stabilisere før det første reelle datapunktet måles. Siden protokollen inkluderer 8 måle sykluser før capacitation initieres, for å spare tid, er det likevekts trinnet utelukket fra denne protokollen.

Muligheten til å injisere løsninger under analysen og å observere deres virkninger på åndedrett og glycolytic rate i sanntid er en viktig funksjon i ekstracellulære Flux analysator. Lasting av sensor patron er en av de kritiske trinnene i protokollen og bør utføres nøye. For å sikre riktig injeksjon i alle brønner, må hver rekke porter inneholde samme volum, inkludert bakgrunns brønnene. Lasting av portene med en flerkanals pipette krever litt øvelse, men reduserer variasjoner og innlastingstiden betraktelig. Vi anbefaler å bruke port lasting guide, men å injisere bare fire porter samtidig. Det er også viktig å forstå at under lasting, er injeksjon volumer gradvis økt for å kompensere for den økende volum i brønnen. Når du legger i sensor patronen, er det viktig at du ikke setter tuppen helt inn i porten. Dette kan for tidlig presse injeksjons løsning gjennom portåpningen. Mens etablere metoden fant vi at sprøytebruk væske i en sperm godt forårsaker uønsket injeksjon gjenstander, sannsynligvis på grunn av fortynning av sperm i brønnen og/eller fortrenge sperm fra brønnen bunnen. Den første injeksjon forårsaker den største injeksjon gjenstand, så vi inkluderte en mock injeksjon med sperm buffer i alle brønner i begynnelsen av protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller høy gjennomstrømning og spektroskopi Resource Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292, (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411, (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109, (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58, (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168, (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149, (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61, (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87, (3), 75 (2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276, (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64, (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82, (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101, (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49, (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110, (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26, (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49, (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262, (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278, (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290, (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96, (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121, (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105, (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24, (8), 999-1007 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics