Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We bieden een protocol om genen die extracellulaire matrix (ECM) eiwitten coderen in C2C12 myoblasten neer te halen met behulp van small-hairpin (sh) RNA. Gericht op ADAMTSL2 als voorbeeld, beschrijven we de methoden voor de validatie van de knockdown-efficiëntie op het mRNA-, eiwit- en cellulair niveau tijdens C2C12 myoblast tot myotubedifferentiatie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Extracellulaire matrix (ECM) eiwitten zijn cruciaal voor skeletspierontwikkeling en homeostase. De stabiele knockdown van genen codering voor ECM eiwitten in C2C12 myoblasten kan worden toegepast om de rol van deze eiwitten in skeletspierontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om het ECM-eiwit ADAMTSL2 uit te putten als voorbeeld, met behulp van small-hairpin (sh) RNA in C2C12 cellen. Na transfection van shRNA plasmiden werden stabiele cellen batch-geselecteerd met behulp van puromycine. We beschrijven verder het onderhoud van deze cellijnen en de fenotypische analyse via mRNA expressie, eiwitexpressie en C2C12 differentiatie. De voordelen van de methode zijn de relatief snelle generatie stabiele C2C12 knockdown cellen en de betrouwbare differentiatie van C2C12 cellen in multinucleated myotubes bij uitputting van serum in de celkweek medium. Differentiatie van C2C12 cellen kan worden gevolgd door heldere veldmicroscopie en door het meten van de expressieniveaus van canonieke markergenen, zoals MyoD, myogenine of myosine zware keten (MyHC) die de progressie van C2C12 myoblastdifferentiatie in myotubes aangeeft. In tegenstelling tot de tijdelijke knockdown van genen met klein-storende (si) RNA, genen die later worden uitgedrukt tijdens C2C12 differentiatie of tijdens myotube rijping kan efficiënter worden gericht door het genereren van C2C12 cellen die stabiel uitdrukken shRNA. Beperkingen van de methode zijn een variabiliteit in de knockdown efficiëntie, afhankelijk van de specifieke shRNA die kan worden overwonnen met behulp van gen knock-out strategieën op basis van CRISPR / Cas9, evenals potentiële off-target effecten van de shRNA die moeten worden overwogen.

Introduction

Extracellulaire matrix (ECM) eiwitten bieden structurele ondersteuning voor alle weefsels, bemiddelen celcel-cel communicatie, en bepalen cel lot. De vorming en dynamische verbouwing van ECM is dus van cruciaal belang om weefsel en orgaanhomeostase1,2te behouden. Pathologische varianten in verschillende genen die coderen voor ECM-eiwitten geven aanleiding tot aandoeningen aan het bewegingsapparaat met fenotypes, variërend van spierdystrofieën tot pseudomousculaire build3,4. Pathogene varianten in ADAMTSL2 veroorzaken bijvoorbeeld de uiterst zeldzame spier- en skeletaandoening geleophysic dysplasie, die zich presenteert met pseudomusculaire opbouw, d.w.z. een schijnbare toename van de skeletspiermassa5. Samen met genexpressiegegevens bij muis en mens suggereert dit een rol voor ADAMTSL2 in skeletspierontwikkeling of homeostase6,7.

Het protocol dat we hier beschrijven is ontwikkeld om het mechanisme te bestuderen waarmee ADAMTSL2 skeletspierontwikkeling en/of homeostase moduleert in een celkweekomgeving. We hebben ADAMTSL2 neergeslagen in de murine C2C12 myoblast cellijn. C2C12 myoblasten en hun differentiatie in myotubes is een goed beschreven en veel gebruikt celkweekmodel voor skeletspierdifferentiatie en skeletspierbiotechniek8,9. C2C12-cellen doorlopen duidelijke differentiatiestappen na serumterugtrekking, wat resulteert in de vorming van multinucleated myotubes na 3−10 dagen in de cultuur. Deze differentiatiestappen kunnen betrouwbaar worden gecontroleerd door mRNA-niveaus van verschillende markergenen te meten, zoals MyoD, myogenine of myosine zware keten (MyHC). Een voordeel van het genereren van stabiele gen knockdowns in C2C12 cellen is dat genen die worden uitgedrukt in latere stadia van C2C12 differentiatie efficiënter kunnen worden gericht, in vergelijking met voorbijgaande knockdown bereikt door klein-interfererende (si) RNA, die meestal duurt 5 − 7 dagen na transfection, en wordt beïnvloed door de transfection efficiëntie. Een tweede voordeel van het protocol zoals hier beschreven is de relatief snelle generatie van batches van C2C12 knockdown cellen met behulp van puromycine selectie. Alternatieven, zoals CRISPR/Cas9-gemedieerde genknock-out of de isolatie van primaire skeletspiercelprecursoren van menselijke of doel-gen deficiënte muizen zijn technisch uitdagender of vereisen de beschikbaarheid van patiënt spierbiopten of doel-gen deficiënte muizen, respectievelijk. Echter, vergelijkbaar met andere celcultuur gebaseerde benaderingen, zijn er beperkingen in het gebruik van C2C12 cellen als model voor skeletspierceldifferentiatie, zoals de tweedimensionale (2D) aard van de celcultuur set-up en het ontbreken van de in vivo micro-omgeving die van cruciaal belang is voor het behoud van ongedifferentieerde skeletspier voorloper cellen10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van het shRNA Plasmid DNA van Escherichia coli

  1. Generatie van klonale bacteriële kolonies die de shRNA plasmids dragen
    1. Verkrijg glycerolvoorraden van E. coli met doelspecifieke shRNA plasmiden en een controleplasmid uit commerciële bronnen (Tabel met materialen).
      OPMERKING: Drie verschillende shRNA plasmiden werden gebruikt, gericht op verschillende regio's van de murine Adamtsl2 mRNA. Een shRNA werd geselecteerd om de 3'-onvertaalde regio (3'UTR) van Adamtsl2 te richten op reddingsexperimenten met expressie plasmiden codering recombinant full-length ADAMTSL2 of individuele ADAMTSL2 eiwit domeinen te vergemakkelijken. Bovendien werd een vervormde shRNA plasmid opgenomen als een negatieve controle. Details van de shRNA sequenties zijn opgenomen in figuur 1A.
    2. Ontdooi de shRNA bacteriële glycerol voorraad bij kamertemperatuur (RT). Breng 10 μL bacteriële glycerolvoorraad over op een Luria-Bertani (LB) agarplaat aangevuld met 100 μg/mL ampicillin (LB-Amp).
      OPMERKING: LB-Amp platen worden bereid door autoclaving 1 L lb medium (voor 1 L: 10 g tryptone, 5 g gist extract, 10 g NaCl, aanpassen pH tot 7.0) samen met 12 g agar. Laat het medium afkoelen tot ~50 °C en voeg ampicilline (stockoplossing: 50 mg/mL in steriel water) toe aan een eindconcentratie van μg/mL (LB-Amp agar). Giet onmiddellijk ~ 20 mL LB-Amp agar in een 10 cm Petri schaal en laat de agar stollen voor gebruik. 1 L lb-amp agar is meestal voldoende om ongeveer 40 10 cm petrischaaltjes te gieten. Petrischaaltjes met LB-Amp agar zijn minstens een maand stabiel als ze in het donker bij 4 °C worden bewaard.
    3. Verspreid bacteriën met steriele Drygalski spatel of een andere geschikte methode om enkele bacteriële kolonies te bereiken. Incubeer bacteriële platen ondersteboven 's nachts bij 37 °C.
  2. Plasmidvoorbereiding
    1. De volgende ochtend, verwijder de petrischaal met de individuele bacteriële kolonies en op te slaan op 4 °C om begroeiing van de bacteriële kolonies en de vorming van satellietkolonies te voorkomen. Sluit de petrischaal af als deze 's nachts of langer wordt opgeslagen.
    2. Voeg 's middags 5 mL LB-Amp medium toe aan een polypropyleen bacteriële kweekbuis. Selecteer een enkele bacteriële kolonie uit de petrischaal die 's nachts wordt gekweekt met een pipettip en inoculerenlb-amp medium door de pipettip uit te werpen in de bacteriële kweekbuis met het LB-Amp medium.
    3. Incubeer de bacteriële cultuur 's nachts in een shaker bij 250 tpm bij 37 °C met het deksel losjes bevestigd om beademing mogelijk te maken.
    4. Neem bacteriële kweekbuis de volgende ochtend en houd op 4 °C om bacteriële begroeiing te voorkomen. In de middag, resuspend bacteriën door vortexing en overdracht 1 mL van de nachtelijke bacteriële cultuur in 50 mL van LB-Amp medium in een 250 mL conische kolf. Incubeer 's nachts in een shaker bij 250 tpm bij 37 °C.
    5. Breng de volgende ochtend bacteriën over naar een wegwerpcentrifugebuis van 50 mL en centrifugebacteriën bij RT van 6.000 x g gedurende 15 min. Verwijder het medium en ga verder met stap 1.2.6.
      OPMERKING: Als plasade-DNA niet onmiddellijk kan worden geïsoleerd, verwijder dan het LB-Amp-medium na de centrifugatiestap en bewaar de bacteriepellet bij -20 °C.
    6. Volg instructies voor plasmidvoorbereidingskit (midischaal) om het plasmide-DNA uit de bacterie te halen. Beoordeel de plasmakwaliteit van plasmid door de A260/A280-verhouding te meten met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: Een A260/A280 verhouding van >1.8 is wenselijk, wat wijst op een hoge zuiverheid van het plasmide DNA-preparaat. Een lagere A260/A280 verhouding suggereert besmetting met eiwit of onvoldoende verwijdering van extractiereagentia. Er kunnen extra plasmidezuiveringsstappen nodig zijn.

2. Kweek- en transfection van C2C12-cellen en puromycineselectie

  1. C2C12 celcultuur
    1. Ontdooi C2C12-cellen(Tabel van materialen)snel in een waterbad van 37 °C en giet cellen in steriele wegwerpcentrifugebuis van 15 mL met 8 mL dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met 100 eenheden penicilline en streptomycine antibiotica (serumvrije DMEM) in een celkweekkap. Centrifugecellen gedurende 3 min bij 160 x g bij RT.
    2. Aanzuigensupernatant en resuspenderen van de celpellet in 10 mL serumvrije DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (volledige DMEM). Breng cellen over naar 10 cm weefselkweek behandelde plastic gerechten. Incubeer cellen in een bevochtigde couveuse bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer.
    3. Vervang de volgende dag het medium door een verse complete DMEM.
    4. Breid lage passage C2C12 cellen uit op gerechten van 3−4 10 cm. Wanneer de C2C12-cellen 50-60% samenvloeiing bereiken, zuigt u het medium aan en spoelt c2C12-cellen met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    5. Voeg 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA toe en incubeer gedurende 2 minuten bij RT. Monitor celonthechting onder een microscoop en verleng indien nodig de incubatietijd, totdat de meeste cellen zijn losgemaakt.
      LET OP: Zorgvuldig tikken op de schotel kan helpen om de cellen los te maken.
    6. Wanneer de meeste cellen zijn losgemaakt, voeg 10 mL volledige DMEM aan de schotel, pipet het volume op en neer meerdere malen, en overdracht cel vering naar een steriele wegwerp 15 mL centrifuge buis. Centrifugecellen gedurende 3 min bij 160 x g bij RT. Aspirate supernatant en resuspenderen de celpellet in 2 mL vriesmedium (10% dimethylsulfoxide [DMSO]/90% FBS).
    7. Breng twee 1 mL aliquots per 10 cm schotel in cryovials. Incubeer in een celvriescontainer gevuld met RT isopropanol gedurende ten minste 24 uur in een vrieskist -80 °C, wat resulteert in een vriessnelheid van ongeveer -1 °C per min om de vorming van ijskristallen te voorkomen. Bewaar cellen voor langdurig gebruik in de dampfase van vloeibare stikstof.
      OPMERKING: De leverancier raadt aan C2C12-cellen te gebruiken tot passagenummer 15. De ervaringen van auteurs toonden ook aan dat de lagere cellen van het passageaantal meer verenigbare en snelle differentiatie in myotubes toonden. Het is essentieel om C2C12-cellen met een lage celdichtheid (<50% samenvloeiing) te behouden om voortijdig eeraante van differentiatie te voorkomen. Differentiërende of gedifferentieerde C2C12-cellen kunnen niet worden teruggezet in de oorspronkelijke myoblast-toestand en moeten worden weggegooid.
  2. C2C12-cellen voorbereiden op transfection
    1. Kweek ongedifferentieerde C2C12 cellen in een schotel van 10 cm tot ze 50-60% samenvloeiing bereiken. Aanzuigen van het medium, spoel C2C12 cellen met 10 mL PBS, en voeg 1 mL van 0,25% trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 2 minuten bij RT, monitor celloslating onder een microscoop en verleng de incubatietijd indien nodig, totdat de meeste cellen zijn losgemaakt.
      LET OP: Zorgvuldig tikken op de schotel kan helpen om de cellen los te maken.
    2. Wanneer de meeste cellen zijn losgemaakt, voeg 10 mL volledige DMEM toe aan de schotel en breng celvering over naar een steriele wegwerpcentrifugebuis van 15 mL. Centrifugecellen gedurende 3 minuten bij 160 x g bij RT. Aspirate supernatant en resuspenderen de celpellet in 4 mL van volledige DMEM.
    3. Combineer 10 μL celvering met 10 μL trypanblauw in een 1,5 mL-reactiebuis, meng door op en neer te bepaaid en de reactiebuis voorzichtig te vegen en cellen over te zetten naar een tellende dia. Bepaal het celnummer/mL met behulp van een geautomatiseerd celteller.
    4. Verdun C2C12 cellen tot 50.000 cellen/mL en zaai 100.000 cellen (2 mL) per put in een 6 putplaat om ongeveer 40−50% samenvloeiing te bereiken na 's nachts incubatie. Incubeer cellen in een bevochtigde couveuse bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer.
  3. Transfection van C2C12 cellen met de shRNA plasmid met behulp van polyethyleen (PEI) en puromycine selectie
    1. Voorbereiding van PEI-voorraadoplossing
      1. Los 16 mg PEI op in 50 mL steriel gedestilleerd water (concentratie van voorraadoplossing: 0,32 mg/mL) in een 50 mL glazen mediafles met een schroefdop. Incubeer de oplossing bij 65 °C gedurende 1 uur en vortex de oplossing meerdere malen tijdens de incubatietijd krachtig om de PEI volledig op te lossen.
      2. Pas aan op pH 8 door 15 μL van 1N HCl per 50 mL toe te voegen.
        LET OP: HCl is corrosief. Geconcentreerde HCl moet worden behandeld onder de rookkap. Onderzoekers moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
      3. Bevries de PEI-oplossing op -80 °C gedurende 1 uur met een losjes bevestigd deksel en ontdooi snel bij 37 °C in een waterbad om de oplosbaarheid verder te verbeteren. Herhaal de vries-dooi cyclus 3x.
      4. Bewaar PEI-voorraadoplossing in 0,5 mL voor eenmalig gebruik bij -20 °C.
    2. Transfection van C2C12-cellen
      1. Combineer 25,5 μL (8,5 μL/μg plasmid DNA) van de PEI-voorraadoplossing met 100 μL van 25 mM NaCl in een 1,5 mL-reactiebuis en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C. Combineer 3 μg van het plasmide DNA met 100 μL van 25 mM NaCl en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C.
      2. Combineer het volledige volume verdunde PEI reagens met de verdunde plasmid en meng door zachtjes op en neer te stampen. Incubeer gedurende 25 min bij 37 °C.
      3. Verander tijdens de incubatietijd het medium van de C2C12-cellen die bestemd zijn voor transfection naar DMEM zonder FBS of antibiotica.
      4. Voeg de PEI/DNA transfection mix toe aan C2C12 cellen druppel voor druppel en meng voortdurend door de celkweekschotel zorgvuldig te verplaatsen. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer. Na 6 uur wijzig je het medium om DMEM te voltooien.
    3. Puromycine selectie
      1. 24 uur na omzetting schakelt u medium naar selectiemedium (complete DMEM plus 5 μg/mL puromycine). Doorgaan met puromycine selectie tot puromycine-resistente C2C12 cellen worden verkregen, die meestal duurt 10−14 dagen.
      2. Breid puromycineresistente C2C12-cellen uit met een lage celdichtheid (<50−60% samenvloeiing), d.w.z. om de ongedifferentieerde toestand en cryopreserve van 6−10 flacons te behouden voor toekomstige experimenten zoals beschreven in de stappen 2.1.4−2.1.7.
        OPMERKING: Behoud puromycine-resistente C2C12 cellen in aanwezigheid van 5 μg/mL puromycine voor routinematige celkweek en expansie. Puromycine werd echter weggelaten in de differentiatie-experimenten.

3. Fenotypische analyse van C2C12 Differentiatie

OPMERKING: De onderstaande methoden kunnen gemakkelijk worden aangepast voor algemene fenotypische analyse van C2C12 myoblastdifferentiatie in myotubes door het variëren van de specifieke antilichamen die worden gebruikt in de westerse vlekken of de genspecifieke primers die worden gebruikt in de kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse.

  1. C2C12 differentiatie protocol en brightfield microscopie
    1. Zaad 150.000 cellen/put in een 12 putplaat. Kweekpuromycine-resistente C2C12 stabiele cellen in een 12-putplaat in selectiemedium in een bevochtigde incubator bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer. Cultuur C2C12 cellen in volledige DMEM totdat ze ~ 95% samenvloeiing te bereiken.
    2. Om differentiatie van C2C12-cellen te induceren, vervangt u volledige DMEM door serumvrije DMEM (dag 0 van differentiatie). Verander medium om de twee dagen en volg C2C12 myotube formatie met behulp van een omgekeerde heldere veldmicroscoop met camera.
      OPMERKING: Veel protocollen gebruiken 2% paardenserum om C2C12-cellen te differentiëren in myotubes. In de handen van auteurs had het verwijderen van het serum een vergelijkbaar effect. Insuline wordt beschreven als een additief voor het celkweekmedium om C2C12-differentiatie te versnellen. In het huidige protocol werden C2C12-cellen echter betrouwbaar in myobuisjes gedifferentieerd binnen 3−5 dagen na serumontbering en toevoeging van insuline overbodig geacht.
  2. Myosine zware keten (MyHC) immunostaining om myotubes visualiseren
    1. Zaad 50.000 puromycine-resistente C2C12 cellen per kamer in een 8-kamerschuif in 500 μL volledige DMEM. Kweekcellen tot ze 95% samenvloeiing bereiken in volledige DMEM (ongeveer 24 uur).
    2. Om differentiatie te induceren, schakelt u over van volledige DMEM naar 500 μL serumvrije DMEM (dag 0 van differentiatie). Op het gewenste moment(en) zuigt u de medium aan en spoel t.a.v.r.d. 3x met 0,5 mL PBS.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit bij RT.
    3. Fix cellen met 0,2 mL van 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS gedurende 15 min. Spoelcellen met 0,5 mL PBS 3x voor 5 min per stuk.
      LET OP: PFA is gevaarlijk. Neem de juiste voorzorgsmaatregelen en gooi paraformaldehyde oplossing als gevaarlijk afval.
    4. Blus PFA met 0,2 mL van 0,5 M glycine in PBS voor 5 min. Spoelcellen met 0,5 mL PBS 3x voor 5 min per stuk.
    5. Incubeer cellen met 0,2 mL van 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof/wasmiddel(Materiaaltabel)in PBS gedurende 10 min om het celmembraan te doorsijpelen. Blok met 0,2 mL van 5% runderserumalbumine in PBS voor 1 uur. Spoelcellen met 0,5 mL PBS 3x per stuk.
    6. Incubeer cellen met 0,2 mL MyHC-antilichaam (1:200 in PBS) voor 2 uur. Spoel cellen met 0,5 mL PBS 3x voor 5 min per stuk.
    7. Incubeer cellen met 0,2 mL geit-anti muis rhodamine rood-geconjugeerd secundair antilichaam (1:200 in PBS). Spoel cellen met 0,5 mL PBS 3x gedurende 5 min per stuk.
    8. Na het verwijderen van PBS kwantitatief, voeg een druppel montage medium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) per kamer. Coverslip en cure montage medium volgens de instructies van de fabrikant. Sluit af met nagellak.
    9. Observeer C2C12-cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met behulp van de juiste filterset.
  3. Beoordeling van knockdown-efficiëntie door kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (qRT-PCR)
    1. Kweek C2C12 cellen onder differentiatievoorwaarden in 12 putplaten zoals beschreven in punt 3.1.
    2. Verwijder op het gewenste tijdstip(en) het differentiatiemedium, spoel de cellen één keer af met 1 mL PBS en voeg 0,5 mL RNA-extractiereamiddel(Tabel van materialen)per put toe. Lyse de cellen door voorzichtig pipetteren op en neer en de overdracht van cel lysate naar een steriele 1,5 mL reactiebuis. Isoleer het RNA door het protocol van de fabrikant zorgvuldig te volgen.
      LET OP: Het RNA extractiereagens bevat fenol. Het moet worden gebruikt onder een rookkap. Verzamel het RNA-extractiereagensafval en gooi ze weg als gevaarlijk afval. Onderzoekers moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
    3. Los de uiteindelijke RNA-pellet op in 20 μL diethylpyrocarbon (DEPC)-behandeld water. Bepaal de hoeveelheid en kwaliteit van het RNA-preparaat met behulp van een spectrofotometer en bepaal de A260/A280-verhouding als kwaliteitsmaatregel.
      OPMERKING: Een typische opbrengst van 1 put van een 12 putplaat is 5−7 μg totaal RNA met een A260/A280-verhouding van 1,8−2.
    4. Om restmedegezuiverd elekpachtig dna te verteren, verdunt u 1 μg RNA in een totaal volume van 8 μL DEPC-behandeld water in een PCR-buis. Voeg 1 μL 10x reactiebuffer en 1 μL DNase I (1 unit/μL)(Materiaaltabel)toe en incubeer gedurende 15 min bij RT. Voeg 1 μL stopoplossing (25 mM EDTA) toe en incubeer bij 70 °C gedurende 10 min.
    5. Om cDNA te genereren, combineert u 10 μL DNase behandeld RNA met 10 μL van 2x reverse transcriptase master mix, met de omgekeerde transcriptase, willekeurige primers, 4 mM dNTP mix (1 mM elk van dATP, dTTP, dGTP en dCTP), en omgekeerde transcriptase reactiebuffer. Incubeer de reactie in een thermocycler met behulp van het programma zoals aanbevolen door de fabrikant. Verdun cDNA met water in een verhouding van 1:5.
    6. Om de qRT-PCR-reactie voor te bereiden, combineert u 5 μL SYBR groene qPCR-mastermix met 0,5 μL genspecifieke voorwaartse en omgekeerde primers (bouillon: 10 μM), respectievelijk, en 2 μL DEPC-behandeld water per reactie. PipetteqPCR reactie in een put van een 96 goed qRT-PCR plaat en voeg 2 μL verdunde cDNA. Stel drie technische replicaties in voor elke biologische repliceren en omvatten een huishoudingsgen zoals Gapdh of Hprt1.
    7. Versterk het PCR-product met een qRT-PCR thermocycler met behulp van het volgende programma: 50 °C voor 2 min (uracil-DNA glycosylase [UDG] activatie), 95 °C voor 2 min (dual-lock DNA polymerase activatie), 40 cycli van 95 °C voor 15 s, 60 °C voor 30 s en 72 °C voor 1 min.
    8. Kwantificeren qRT-PCR resultaten met behulp van de DDCt methode normaliseren naar een huishouding gen, zoals Gapdh of Hprt1.
  4. Beoordeling van knockdown efficiëntie door westerse blotting
    1. Zaad 300.000 puromycine-resistente C2C12 cellen per put in een 6 put plaat voor westerse vlek analyse. Na 24 uur wissel je medium naar serumvrije DMEM om differentiatie in gang te zetten (dag 0 van differentiatie).
    2. Verzamel op het gewenste tijdstip twee 1 mL serumvrij geconditioneerd medium in een 1,5 mL-reactiebuis en centrifuge voor 5 min bij RT om losgekomen cellen en celvuil te verwijderen.
      OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als ECM-eiwitten of andere uitgescheiden eiwitten in geconditioneerd medium worden onderzocht. Als het eiwit van belang is gelokaliseerd in het cytoplasma of membraangebonden is, zuigt u het celkweekmedium aan en gaat u verder met de cellysestappen (3.4.7−3.4.12). Cellyse moet parallel met de eiwitneerslag van serumvrij geconditioneerd medium worden uitgevoerd om proteolytische afbraak en andere onbedoelde gevolgen van langdurige opslag van de cellaag tot een minimum te beperken.
    3. Na centrifugering brengt u 1 mL geconditioneerd medium over in een nieuwe 1,5 mL-reactiebuis en neerslageiwitten door 0,391 mL toe te voegen aan een mengsel van trichloorazijnzuur (TCA) en niet-ionische oppervlakteactieve stof/wasmiddel. Kort vortex het mengsel en incuberen voor 10 min op ijs.
      OPMERKING: Bereid het eiwitneerslagmengsel direct voor gebruik voor door 0,252 mL van 55% TCA en 0,139 mL van 1% niet-ionische oppervlakteactieve stof/wasmiddel per mL geconditioneerd medium en vortex kort te combineren. De oplossing wordt troebel.
      LET OP: TCA is corrosief en moet op de juiste manier worden behandeld.
    4. Pellet de neergeslagen eiwitten op >16.000 x g voor 10 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
      LET OP: De supernatant bevat TCA en moet afzonderlijk worden verzameld en als gevaarlijk materiaal worden verwijderd.
    5. Was de eiwitpellet 3x met ijskoude aceton en centrifuge telkens op >16.000 x g voor 10 min bij 4 °C.
    6. Luchtdrogen de eiwitpellet gedurende 3−4 min bij RT en lossen op in 50 μL 1x natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektrofore (SDS-PAGE) monsterbuffer (50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 6% glycerol en 0,004% bromopopolenblauw, aangevuld met 5% β-mercaptoethanol). Kook het monster gedurende 5 min bij 95 °C en gebruik voor westerse vlekken om het gewenste doeleiwit te detecteren met behulp van standaardprocedures.
      LET OP: β-Mercaptoethanol is geurig en giftig en moet worden behandeld in een rookkap.
    7. Voor intracellulaire en membraangebonden eiwitten, spoel de cellaag eenmaal met 2 mL PBS.
    8. Voeg 1 mL PBS toe en verlos cellen door ze van de put te schrapen met behulp van een celschraper. Verzamel cellen in een 1,5 mL-reactiebuis en centrifuge bij 3.420 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Was de celpellet 3x met 1 mL PBS en centrifuge elke keer 3 m in 4 °C.
    9. Om de cellen te lyseren, de celpellet opnieuw op te schorten in 0,2 mL lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% natriumdeoxycholaat, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat en 1 mM natriumorthovanadate) aangevuld met 1x EDTA-vrije proteaseremmercocktailreamiddel en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    10. Ultrasoon voor 15 s op ijs met een vermogensinstelling van 10 op een bedrijfsfrequentie van 23 kHz.
    11. Verwijder celvuil door centrifugeren bij 13.680 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Verzamel supernatant in een nieuwe 1,5 mL reactiebuis en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een commerciële Bradford-test of een andere geschikte methode.
    12. Combineer voor elk monster 100 μg eiwit met 5x SDS-PAGE monsterbuffer in een totaal volume van 60 μL en kook gedurende 5 min bij 95 °C. Analyseer monsters door standaard westerse blotting procedures voor de aanwezigheid van het gewenste doeleiwit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selectie van puromycine-resistente C2C12 kan worden bereikt in 10−14 dagen na transfection als gevolg van efficiënte eliminatie van niet-resistente, dat wil zeggen, ongetransfected cellen (figuur 1B). Typisch, meer dan 80% van de cellen los te koppelen van de cel cultuur schotel en deze cellen worden verwijderd tijdens routine cel onderhoud. Puromycine-resistente C2C12 cellen uitdrukken van de controle (roerei) shRNA behouden de spindel-vorm, langwerpige celmorfologie bij lage celdichtheid en de mogelijkheid om te differentiëren in myotubes. C2C12 differentiatie bij serum terugtrekking kan worden gecontroleerd door heldere veld microscopie en door immunostaining voor de myotube marker myosine zware keten (MyHC) (Figuur 2). MyHC-positieve myotubes worden waargenomen tussen 3−5 dagen na differentiatie initiatie. Myotubes zijn multinucleated zoals blijkt uit de aanwezigheid van meer dan een DAPI-positieve kern binnen de MyHC-positieve cel grenzen. Figuur 3A toont heldere veldbeelden van stabiele C2C12-cellen gekweekt in volledige DMEM. De hier gepresenteerde knockdown-efficiëntie varieert van 40−60% (figuur 3B). Aangezien de mRNA werd geoogst in de proliferative staat waar weinig Adamtsl2 wordt uitgedrukt, de knockdown efficiëntie lijkt laag, maar de knockdown efficiëntie zal naar verwachting groter zijn op latere tijd punten tijdens C2C12 differentiatie, waar endogene Adamtsl2 wordt geïnduceerd en dus uitgedrukt op veel hogere niveaus. Westerse vlekanalyse bevestigde de succesvolle knockdown van ADAMTSL2 in het cellysaat verkregen uit C2C12 cellen stabiel uitdrukken shRNA 3086 in vergelijking met controle shRNA (Figuur 3C).

Figure 1
Figuur 1: Selectie van stabiele C2C12-cellen na transfection met shRNA-encoding plasmid DNA. (A) Tabel met het doelgebied (CDS, coderingsvolgorde; 3'-UTR, 3'-onvertaalde regio), kloon-ID (hierna 1977, 3086 en 972 genoemd) en volgorde van de shRNA's die worden gebruikt om Adamtsl2te targeten . (B) De panelen tonen de selectie van C2C12 cellen transfected met de controle shRNA en de drie Adamtsl2-targeting shRNAs. C2C12 cellen werden transfected met de shRNA plasmiden en puromycine werd toegevoegd aan het medium na 24 uur. Puromycine-gevoelige cellen verschijnen rond en uiteindelijk los te maken tijdens routine cel cultuur onderhoud (rode pijlen). In tegenstelling, puromycine-resistente cellen herbergen de geïntegreerde shRNA plasmiden lijken asvormig, licht langwerpig, bevestigd, en levensvatbaar (blauwe pijlen). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: C2C12 myoblast to myotube differentiatie. Heldere veldbeelden van differentiërende C2C12-cellen tonen dichte geplaveide verschijning van de cellen aan het begin van de differentiatie (dag 0−1) en multinucleated myotubes werden waargenomen na dag 5 (bovenste rij). Immunostaining van het differentiëren van C2C12 cellen met myosine zware keten (MyHC, rood), dat is een marker voor myotubes, wordt geïnduceerd op dag 3 van differentiatie (middenpaneel). Kernen werden gekleurd met DAPI en de samengevoegde afbeelding wordt weergegeven in de onderste panelen. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Validatie van stabiele knockdown in woekerende C2C12-cellen. (A) Heldere veldbeelden van stabiele C2C12 cellen gekweekt in volledige DMEM. Schaalstaven = 300 μm. (B) qRT-PCR-analyse van Adamtsl2 mRNA-expressie in stabiele C2C12-cellen. Ct waarden werden genormaliseerd aan de huishouding gen Hprt1. mRNA werd geoogst vóór het begin van differentiatie. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (C) Westerse vlekanalyse waaruit blijkt verminderd ADAMTSL2 eiwit in de cel lysate /ECM fractie van C2C12 cellen stabiel uitdrukken shRNA 3086. Endogene ADAMTSL2 werd gedetecteerd met behulp van een op maat gemaakte polyklonale peptide antilichaam (beschikbaar op verzoek). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschrijven hier een protocol voor de stabiele knockdown van ECM eiwitten in C2C12 myoblasten en voor fenotypische analyse van de differentiatie van C2C12 myoblasten in myotubes. Verschillende factoren bepalen de uitkomst van het experiment en moeten zorgvuldig worden overwogen. Het handhaven van C2C12 cellen in de woekerende fase is een kritieke stap om de C2C12 cellen in de myoblast voorloper toestand te houden. Het behoud van het vermogen van C2C12 cellen om consequent te differentiëren in myotubes hangt af van i) het passagenummer van de cellen, ii) de dichtheid van de gekweekte cellen tijdens routineonderhoud, en iii) beschikbaarheid van voedingsstoffen, die frequente en regelmatige aanvulling van de celkweek medium11,12,13. Door een aantal onbekende mechanismen verliezen hogere passagenummer C2C12 cellen ook het potentieel voor verdere myoblast fusie11. De instructies van de provider van de C2C12 cellen suggereren het handhaven van deze cellen tot passage nummer 15. Daarna kan het differentiatiepotentieel worden verminderd en experimenten met dergelijke cellen kunnen resulteren in minder consistente myotubevorming. Aan de andere kant kan de celdichtheid tijdens het onderhoud leiden tot vergelijkbare effecten9. Het bereiken van confluent C2C12 celdichtheden tijdens routinecelcultuur bevordert initiatie van C2C12 myoblast differentiatie en kan dus een negatieve invloed hebben op het differentiatiepotentieel van de celpopulatie. Daarom is het van cruciaal belang om te voorkomen dat C2C12-cellen hoge celdichtheden bereiken tijdens routinematig c2C12-celonderhoud. Dit kan worden bereikt door c2c12-cellen al te sub-kweken bij lage celdichtheden (<50−60% samenvloeiing). Serumhonger wordt gebruikt om C2C12 celdifferentiatie in myotubes te induceren. Daarom, het handhaven van cellen voor langere tijd zonder het aanvullen van medium ernstig uitputten van de voedingsstoffen en serum niveaus. Het aanvullen met vers serum dat ten minste om de twee dagen medium bevat, kan het ontstaan van ongewenste voortijdige differentiatie als gevolg van nutriënten- en serumdeprivatie voorkomen.

C2C12 differentiatie wordt meestal veroorzaakt door serum honger. Het percentage serum dat wordt gebruikt om C2C12-differentiatie te induceren, kan de resultaten sterk beïnvloeden, met name de tijd die nodig is om MyHC positieve myotubes te vormen14,15. Verschillende protocollen tonen een succesvolle inductie van differentiatie onder verschillende serumconcentraties. Gebruik van 2−10% FBS of paardenserum en volledige serumontbering is gemeld en alle voorwaarden resulteren in C2C12 myotubevorming. Het serumpercentage of de verandering in de serumpartij kan de markers voor differentiatie aanzienlijk veranderen. Bovendien kan de bron van het serum de experimentele uitkomst beïnvloeden, omdat het land van oorsprong bepaalde toevoegingsmiddelen al dan niet toestaat tijdens de productie van runderserum8. Het serumniveau kan worden aangepast om de differentiatiesnelheid te bereiken op basis van specifieke experimentele vereisten. Insuline kan worden toegevoegd aan het kweekmedium van C2C12-cellen om differentiatie en myotubevorming te versnellen16.

De mogelijkheid om plasmiden te leveren die shRNA coderen of recombinante eiwitten via transfection in C2C12-cellen te integreren, is een aantrekkelijk kenmerk van C2C12-cellen. Verschillende commerciële liposoom-gebaseerde transfection reagentia zijn eerder gebruikt om plasmid DNA te leveren in C2C12 cellen met variabele gerapporteerde transfection efficiëntie17,18,19,20,21. PEI toont ook redelijke transfection efficiëntie en is een kosteneffectief alternatief voor liposoom-gebaseerde transfection reagentia. Een vergelijking tussen transfection met een commerciële liposoom-gebaseerde transfection reagens en PEI toonde geen aanzienlijke verandering in de transfection efficiëntie en iets hogere efficiëntie werd gevonden met PEI22. In onze handen was transfection efficiency met PEI voldoende om stabiele puromycine-resistente C2C12 cellen te genereren. Een kritieke stap in dit protocol is echter om de incubatietijd van de transfection reagens kort te houden. Zoals hierboven vermeld, C2C12 cellen zijn gevoelig voor serum terugtrekking en langdurige blootstelling aan lage serum omstandigheden tijdens transfection kan c2C12 celdifferentiatie gunst. Aangezien transfection wordt uitgevoerd bij afwezigheid van serum, werd de incubatietijd na de transfection kort gehouden om snel serumhoudend medium te bevoorraden om voortijdige differentiatie te voorkomen. Puromycine werd toegevoegd aan het kweekmedium 24 uur na transfection om de selectie van puromycine-resistente C2C12 cellen te initiëren. Methoden voor de invoering van plasmide DNA in gedifferentieerde myotubes omvatten transfection (tot 85% gerapporteerde efficiëntie), elektroporatie of een biolistische aanpak23,24,25. Als alternatief, stabiele C2C12 cellen herbergen een inducible shRNA plasmid kan worden gegenereerd om knock-down genen in latere stadia van myotube differentiatie of tijdens myotube rijping26.

De hier beschreven methode resulteerde in een stabiele knockdown van ADAMTSL2 in C2C12 cellen waar de functie tijdens differentiatie in myotubes nu kan worden bepaald. De generatie van stabiele knockdown cellen kan vooral belangrijk zijn om de functie van eiwitten die worden geïnduceerd tijdens myotubevorming of rijping te bestuderen. Voorbijgaande transfection met siRNA bijvoorbeeld zou niet voldoende zijn om deze genen efficiënt neer te halen, omdat het voorbijgaande knockdown-effect van siRNA na 5−7 dagen kan afspenen. Als alternatief is de knock-out van een ECM-eiwit met CRISPR/Cas9 technisch uitdagender en moeten individuele klonen worden geselecteerd en gesequenced om de knock-out van het gewenste gen te garanderen. De evoluerende lijn van reagentia kan CRISPR/Cas9 echter de keuzemethode maken voor functioneringsexperimenten in de toekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

D.H. wordt ondersteund door de National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) en seed funding van het Leni & Peter W. May Department of Orthopedics, Icahn School of Medicine bij Sinaï.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11, (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25, (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40, (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26, (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115, (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3, (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7, (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167, (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107, (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306, (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186, (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5, (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4, (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591, (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46, (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286, (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278, (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003, (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17, (2), 514-526 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics