C. Elegans生理应激反应的测量

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Biology

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Summary

在这里,我们通过测量荧光转录机的激活和对生理应激的敏感性来描述线虫C.elegan的细胞蛋白毒性应激反应。

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Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).

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Abstract

生物体经常暴露在波动的环境和细胞内平衡的变化中,这可能对其蛋白体和生理产生有害影响。因此,生物体进化了有针对性的特定应力反应,专门用于修复损伤和保持平衡。这些机制包括内质视网膜(UPRER)的展开蛋白反应、线粒体(UPRMT)的展开蛋白反应、热冲击反应(HSR)和氧化应激反应(OxSR)。此处介绍的协议描述了检测和描述这些途径的激活及其在线虫,C. elegan的生理后果的方法。首先,描述使用特定于路径的荧光转录报告器进行快速细胞表征、药物筛查或大规模基因筛查(例如RNAi或突变库)。此外,还描述了互补、健壮的生理测定,可用于直接评估动物对特定压力因素的敏感性,作为转录报告员的功能验证。这些方法共同允许快速表征内部和外部蛋白毒性扰动的细胞和生理影响。

Introduction

生物体对细胞内和细胞外环境变化作出反应的能力对其生存和适应至关重要。这是通过多种保护途径在细胞水平上实现的,这些通路可确保细胞的完整性。虽然许多细胞组分受到与压力相关的损伤,但细胞压力反应的一个主要参与是修复和保护细胞蛋白酶体的平衡。然而,将蛋白质分割成特殊结构(称为细胞器)对细胞构成挑战,因为它不能依赖一种集中的蛋白质质量控制形式来确保细胞内的所有蛋白质都正确折叠和发挥作用。因此,为了应对对蛋白质的干扰,细胞器已经进化出专门的质量控制机制,可以感知错误折叠的蛋白质并激活压力反应,以减轻该隔间内的压力。例如,细胞索尔依赖于热冲击反应(HSR),而内质视网膜(ER)和线粒体依赖于其隔间特有的展开蛋白反应(UPR)。OxSR 有助于减轻活性氧物种 (ROS) 的毒性影响。每个应激反应都会在细胞挑战和环境侮辱的情况下触发,并诱导量身定制的转录反应。这些反应的特征包括合成分子,这些分子将错误折叠的蛋白质(如伴郎)重新折叠,以适当的细胞器为目标,或者去除蛋白质降解所损坏的蛋白质。未能激活这些应激反应会导致受损蛋白质的积累,细胞功能障碍传播到组织的全身衰竭,并最终死亡。不同应激反应的功能及调节,在其它地方会检讨

关于细胞应激反应的调节和活性的许多见解都归因于线虫,Caenorhabditis elegans,一种在基因研究中的多细胞模型有机体。线虫不仅允许研究细胞水平上应激反应的激活,而且允许在有机水平上研究压力反应的激活;线虫被用来研究遗传扰动或接触药物和污染物对其生长和生存的影响。其快速的生成时间、等基因、透明度、遗传性和实验期间的易用性使其成为此类研究的理想选择。此外,相对快速的生理反应对压力(小时和几天之间)和细胞通路的进化保护使线虫成为研究抗压力的重要工具。

有两种常用的大肠杆菌菌株作为食物来源来生长C.elegans:标准OP50,一种B菌株,其中大多数实验在历史上都进行了2和HT115,K-12菌株,用于几乎所有的RNAi实验33,4。4需要注意的是,OP50和HT115细菌饮食之间存在显著差异。这些不同细菌源的生长已证明会导致代谢轮廓、线粒体DNA拷贝数和几个主要表型(包括寿命5)的重大差异。其中一些差异归因于与OP50细菌生长相关的维生素B12缺乏症,这可能导致线粒体平衡缺陷和对病原体和压力的敏感度提高。所有这些表型已被证明通过HT115细菌的生长得到缓解,这些细菌的维生素B126含量较高。因此,建议对HT115细菌进行所有生理应激反应实验,而不管RNAi条件是否必要。然而,由于在OP50上维护动物的方便性,所有标准生长(即动物的维护和放大)都可以在OP50上进行,因为在这里描述的实验范式中,只要它们被转移到HT115后同步(即从具有或没有L1逮捕的填充物)到实验之前,在OP50上维护的蠕虫中就不会检测到显著差异。

本文介绍了使用两种功能方法对细胞应力反应活性的表征。应该指出,所提出的协议主要侧重于细胞压力反应及其对蛋白质平衡的影响。首先,荧光转录机被利用,这是由内源性基因促进者调节的,这些启动器是专门针对不同的细胞压力而激活的。这些荧光转录报告是基于特定基因的转录诱导,这些基因是压力反应的本机部分。例如,HSP-4,一种热冲击蛋白正交人类伴子HSPA5/BiP,在ER压力下激活,并本地化到ER,以减轻压力。在ER应力条件下(例如,接触图尼卡霉素),一种绿色荧光蛋白(GFP),置于hsp-4促进剂的调节下,在高水平合成,可以通过荧光显微镜评估,或使用线虫7的大颗粒流细胞测定定量测量。同样,线粒体贞操的促进剂hsp-6(哺乳动物HSPA9的正交)用于监测UPRMT8的激活,而细胞轮手hsp-16.2(人类晶体状α基因的正交)的促进剂用于评估HSR9的活性。这些记者允许快速描述为应对各种扰动而激活的路径。

经常,这里介绍的记者使用显微镜进行成像,这为压力反应的激活提供了定性输出。然而,虽然成像技术提供了上述记者的强度和组织位置信息,但其定量并不总是准确或可靠。虽然可以使用成像分析工具量化荧光活化,但由于成像的动物数量相对较少,这些方法的吞吐量相对较低,样本尺寸也很小。获得大量动物的简便性和能力,使C.elegans成为使用大型粒子流细胞计检测荧光应力检测器激活的理想模型系统。大颗粒流式细胞计能够记录、分析和排序,具体取决于许多活体动物的大小和荧光。使用这种方法,可以获取数千个蠕虫的荧光强度、大小以及空间 (2D) 信息。该系统使用 FlowPilot 进行控制,允许实时采集数据并分析测量参数。在这里,提供了使用大颗粒流细胞计进行微观成像和定量分析的方法,作为测量应力反应激活的方法。

除记者分析外,动物对压力的敏感性或抵抗力可以通过生理压力测定来测量。这是通过将动物暴露在激活特定细胞压力通路的紧张环境中来实现的。在这里,提供了几种方法来测量整个动物对特定类型压力器的敏感性。

ER应力是使用化学剂,图尼辛,阻止N联联糖基,导致在ER10中折叠错误的蛋白质的积累。在C.elegans中,接触图尼卡霉素时的生长会导致ER功能的主要扰动,并且寿命显著缩短11。通过测量动物在含有曲霉素的盘子里的存活率,可以量化动物的ER应力敏感性。例如,与野生型动物12相比,具有异位UPRER诱导和增强对ER中蛋白质错折叠应力的抵抗力的动物在接触图尼卡霉素后存活率增加。

氧化和线粒体应力通过使动物接触化学剂百草枯而应用于C.elegan。百草枯是一种常用的除草剂,它特别在线粒体13中引起超氧化物的形成。由于线粒体衍生活性氧物种(ROS)的特定定位,百草枯测定常被用作"线粒体"应力测定。然而,超氧化物通过线粒体超氧化物脱氧酶(SODs)14迅速转化为过氧化氢。14过氧化氢随后会从线粒体中扩散出来,并在细胞的其他隔间中引起氧化应激。因此,我们将百草枯生存测定描述为测量线粒体和氧化应激的敏感性(其他氧化应激测定可以发现15)。

热耐受性测定通过在高温下放置动物在C.elegan中进行。线虫的环境温度为+15-20°C,热应力在25°C16、17,17以上的温度下引起热应力。耐热性测定一般在30-37°C的温度下进行,因为动物在这种温度下表现出严重的细胞缺陷,生存测定在24小时内完成16,18。16,在这里,提供了两种替代方法来执行热耐受性测定:在34°C下生长,在37°C下生长。结合此处提供的协议,当与使用RNA干扰或化学药物库的标准基因击倒相结合时,可用于执行大规模筛选。

该协议可分为4个广泛的程序——生长的C.elegans和成像准备(第1节和第2节),使用荧光显微镜对转录记者进行成像(第3-5节),对使用大颗粒流细胞计(第6节)的记者进行定量测量,以及生理测定测量C.elegans的应力敏感性(第7节)。

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Protocol

1. 温度和 OP50 的标准生长条件与 HT115

  1. 标准增长和扩展
    1. 在环境温度 (+22-25 °C) 下,在 LB 中生长 OP50 培养物(表 1)或首选等效介质 24-48 小时。在室温下生长细菌,因为OP50是一种乌拉基辅助营养,在37°C生长时,还原剂(例如抑制剂突变体)的发生率较高。不建议长期储存OP50培养物(最多1周,4°C)。
    2. 将体积为 ±100-200 μL 的饱和 OP50 培养物放在 60 mm NGM 板(表 1)上,用于维护蠕虫和 1 mL 饱和 OP50 培养物,放在 100 mm 板上,用于扩展动物进行实验。
    3. 让盘子在台面上晾干过夜。
      注:100 mm 板可能需要更多时间干燥,尤其是使用非通风板时。将所有C. elegans板存放在 4 °C 的密封容器中。不要使用超过6个月的板,因为板的干燥将发生,这将改变动物生理在板由于不同的渗透压力和板的刚度。
    4. 对于标准维护,将 10-15 只幼小动物(鸡蛋、L1 或 L2 级)移到 60 mm 板上,但如果与繁殖率较低的突变体或转基因动物打交道,可以移动更多动物。对于有发育或粪便缺陷的动物,将动物数量增加一些,以防止种群流失。如果保持在15°C,每周移动动物;20°C,每3-4天移动一次动物。
    5. 每 25-30 通道对动物进行一次新鲜的解冻(如果动物每周移动一次,并保持在 15°C 时,则进行 6 个月)。
    6. 要进行膨胀,将一块完整的 60 mm 板块到 100 mm 板上进行膨胀。作为参考框架,具有野生类型繁殖的动物可以有一个完整的60毫米板切成4-6,并块在20°C的大板2天或15°C3天,以创建一个完整的100毫米板,而不会达到饥饿。

2. 使用漂白的蠕虫的分期/同步

  1. 漂白协议以同步蠕虫
    1. 使用 M9(表 1)将肉汁蠕虫(满满鸡蛋的成年人)从加盘上洗掉。从非同步的蠕虫种群(即从步骤 1.1.6 开始的块状蠕虫)开始漂白实验,因为在连续几轮通过漂白同步时可能发生显著的遗传漂移。
    2. 使用玻璃移液器将蠕虫/M9 混合物移入 15 mL 锥形管中;几个蠕虫板可以收集到一个15mL锥形管。
    3. 旋转动物下降30s在1000 x g。吸气 M9 上清液。除非有大量污染或大量细菌,否则没有必要洗掉残留的细菌。如果是这种情况,则使用 M9 执行多个处理。
    4. 准备一批新的漂白溶液(表1)。漂白溶液可在4°C下保存数天,但使用新制作的漂白溶液,因为低效的漂白会导致漂白不均匀,在消除所有蠕虫尸体之前,对鸡蛋造成损害。
    5. 向动物添加2-10 mL的漂白溶液(每±0.1 mL动物颗粒的漂白溶液±1 mL)。反转漂白剂和蠕虫混合物5分钟(不要超过10分钟;请注意,漂白时间可能会有所不同,并且应针对每个实验室专门进行打分)。大力摇动,帮助更快地溶解蠕虫尸体,并优化鸡蛋保存。定期在解剖显微镜下观察或将锥形管置于光线下,观察成年蠕虫尸体完全溶解,且管中仅存有卵子时。
    6. 通过在1,000 x g旋转30s,然后吸进上清液,将鸡蛋吸出。鸡蛋的离心速度比蠕虫快,而不会破坏它们的完整性,因此,如果不确定离心机速度,鸡蛋可以以高达2,500 x g的速度旋转,而不会影响它们的生理。
    7. 将 M9 加入至 15 mL,并反转管子以清除鸡蛋上的漂白剂。
    8. 重复步骤 2.1.6-2.1.7 (洗涤/颗粒工艺) 2-3 次去除漂白剂。
    9. 移液卵/M9 混合到板上,在 15-20 °C 下生长以进行实验。为了测量要使用的蠕虫数量,通过将5μL的鸡蛋混合物移至加盘或滑动,并将鸡蛋计数除以5,以确定每1 μL体积的卵子数量,执行近似的卵子计数。平均 3 个独立计数可以提高准确性。为了避免饥饿,表2中提供了每盘推荐鸡蛋计数表。
    10. 如果需要,L1 通过将鸡蛋/M9 混合物置于 20°C 的旋转器中,以进行长达 24 小时的旋转,从而将动物抓下更紧密的时间同步。对于野生型动物,当L1在48小时内被检查时,动物生理上没有发现任何缺陷。但是,对饥饿敏感的突变体(例如,淋索体或自噬突变体)在 L1 逮捕时表现不佳,因此不建议对已知对饥饿敏感的突变体执行此同步方法。如果无法被 L1 抓取的动物需要更紧密同步,请使用第 2.2 节中所述的产卵方法。
  2. 用于同步蠕虫的蛋层协议
    注:作为漂白的替代方法,可以进行蛋层测定。当动物的漂白不能提供足够接近的同步时,蛋层使用,因为成年动物蛋囊中的卵子可以相差8-12小时。对于实验范式,其中动物必须尽可能紧密地上演,但L1逮捕是不可能的(例如,在饥饿突变体),鸡蛋奠定检测建议。然而,应该注意的是,由于卵子产卵协议所涉及的劳动,进行大规模实验不太可行。
    1. 将 4-12 个肉汁成人(参见步骤 2.2.2 后的说明)放在标准 OP50 或 HT115 种子 NGM 板上(有关细菌菌株的建议,请参阅上文第 1 节)。根据实验的规模,可以使用多个板。请务必仔细记录步骤 2.2 的每个板上有多少动物。
    2. 将动物置于所需温度进行实验(15-20 °C),4-8小时。
      注:动物留在盘子里的小时数将决定第一个卵子的同步程度,最后一个卵子的产卵时间可以根据需要调整。由于较短的孵育时间将意味着每只动物产卵的时间更少,因此应该将更多的动物放在盘子上,以确保产卵足够。虽然由于动物往往经历短时间的产卵时间,而不是蛋的标准化率,实际产卵率尚未完全正常化,但每只动物产卵的平均率估计为5欧元/小时,而表现出野生类型粪便的动物则有19个。当尝试将动物种植到第 1 天成人阶段时,每个盘子的产卵时间为 +lt;100 个鸡蛋以避免饥饿(有关每盘推荐动物的更多详细信息,请参阅表 2)。
    3. 从盘子里取出成年动物。确保所有成年动物从盘子里移走,因为动物将继续产卵,导致种群数量不同步和/或盘子饥饿。

3. 蠕虫的蠕虫生长条件,用于转录记者的成像

  1. 蠕虫的生长
    1. HT115的接种细菌培养,含有pL4440RNAi质粒(EV)和/或携带RNAi盒对期望的目标基因(s)到LB介质补充100微克/mL卡白霉素和20μg/mL四环素。
    2. 在摇动的 37 °C 培养箱中,在一夜之间(约 16 小时)将培养培养到饱和。
    3. 斑点 60 mm NGM RNAi 板,具有 200 μL 的饱和细菌培养和 100 mm NGM RNAi 板,具有 1,000 μL 的饱和细菌培养。在黑暗中在环境温度 (+22 °C) 下干燥过夜(用铝箔松散覆盖)。
    4. 将携带荧光报告器的转基因蠕虫同步种群(见表3,完整列表)放在NGM RNAi板上,这些板中含有选择的细菌。
    5. 生长在15-20°C到特定记者所需的阶段,如下所述。
  2. 用于实验的蠕虫暂存注意事项
    1. 在成年后的第一天为转录记者做实验,但需要L4动物的检测除外。根据WormAtlas,L4动物从蛋级(www.wormatlas.org)在20°C下大约获得2.5天(约56小时)的生长。
    2. 对于"第1天成人",在产卵后在20°C下使用大约3-4天(+65-96小时)的生长动物。
      注:这个广泛的范围解释如下:+65小时在20°C是当动物达到"产卵",这是真正的"成年"状态。96小时是当动物进入WormAtlas描述的"产卵最大",这是当成人是一个肉汁成人,有一个完整的蛋囊。此时,动物被描述为比第 1 天大,并且可能开始显示差异,因此,这里描述的协议都建议从 65 小时开始,到 96 小时开始。对于此处描述的测定,在 +65-96 h 窗口使用动物时未观察到显著差异。
    3. 对于单个实验的复制,使用类似的时间点进行更强大的重现性(例如,在电镀卵后以+65 h或+96 小时执行所有实验)。
      注:一些转基因动物和突变体显示生长速度减慢。为此,有两项建议。1) 使用交错同步,在不同时间对动物进行漂白,以便同时进行实验。当测定中的技术变异性可能大于同步测定可能产生的技术变异性(例如,生存测定,如果它们不同时执行,存活时间可能会延长,则建议这样做)。2) 使用交错分析,动物可以同时漂白,但测定本身在不同的时间进行。对于没有固有变异性的非常简单的检测(例如,RNAi-压力反应诱导),建议这样做。

4. 压力反应的诱导

  1. 使用 hsp-4p::GFP 作为激活 UPRER的读出
    1. 使用 RNAi 诱导 ER 应力
      1. 准备发现带有RNAi细菌的板,将感兴趣的基因靶向NGM RNAi板(表1),如第3节所述。使用EV作为控制基底UPRER水平和RNAi击倒标签-335(酶为N链接糖基化ER居民蛋白;RNAi 击倒具有类似的效果,以治疗图尼卡霉素)作为在ER压力下激活 UPRER的正控制。
      2. 使用第 2 节中描述的方法同步hsp-4p::GFP报告动物。
      3. 使用表 2中建议的标准将鸡蛋板板板板板。
      4. 在20°C孵卵约3-4天(+65-96小时),在成年后第1天进行实验。在 UPRER实验中,hsp-4:GFP报告器在不同温度下生长时基底荧光存在差异。因此,在20°C下执行所有实验。
    2. 使用化学剂诱导ER应力
      1. 同步hsp-4p::GFP报告动物使用第2节描述的方法,并在20°C下生长,直到动物到达L4阶段。将动物转移到M9的管子里。让蠕虫沉降(重力为±2-3分钟,或以1,000 x g旋转30秒),然后移除M9。
      2. 在 M9 中稀释图尼霉素到 25 ng/mL(1 毫克/mL 库存中的 1:40 稀释)。作为一种控制,在M9中也稀释了等效的DMSO体积。
      3. 将 25 ng/mL tunicamycin/M9 或控制 DMSO/M9 溶液添加到蠕虫(对于 1.5 mL 管使用 400-500 mL,对于 15 mL 锥形管使用 2 mL)。在旋转平台上在20°C下孵育3-4小时。
        注:Tunicamycin 也可以直接稀释成蠕虫/M9 混合物。
      4. 允许蠕虫沉降、移除 M9/TM 解决方案,然后使用 1 mL M9 进行清洗。
      5. 将动物转移到NGM板或NGM RNAi板,并允许在一夜之间恢复(或+15-20小时),并在20°C到达成年后的第1天,然后进行荧光显微镜(第5节)。执行隔夜恢复,以便累积可检测到的 GFP 水平。
      6. 或者,通过将L4动物移动到含有25纳克/μL的图尼霉素的加盘,达到16-24小时,诱导hsp-4p:GFP。由于应力持续时间较长,因此hsp-4p::GFP的感应更加可靠,因此动态范围远低于上述测定。
  2. 使用hsp-6p::GFP作为激活 UPRMT的读出
    1. 使用RNAi诱导线粒体应力
      1. 激活UPRMT遵循与第4.1.1节相同的协议,除了使用RNAi敲除线粒体基因,如cox-5b/coco-1(细胞色素c氧化酶亚单元5B;击倒抑制电子传输链活动)。对于通过电子传输链功能扰动进行UPRMT激活,RNAi在开发初期需要执行20。因此,从这些实验的舱口执行RNAi。
    2. 使用化学剂诱导线粒体应力
      1. 准备发现带有RNAi细菌的板,靶向感兴趣的基因,如第3节。即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中使用 HT115 细菌(参见第 1 节)。确保 NGM RNAi 板(或 NGM RNAi = DMSO0.2)和 NGM RNAi + 抗霉素 A 板(表 1)都为步骤 4.2.2.5 做好准备。
      2. 使用第 2 节中描述的方法同步hsp-6p::GFPhsp-60p::GFP报告动物。
      3. 使用表2中推荐的标准,将鸡蛋盘到选择的种子板上。由于抗霉素A溶解在DMSO中,因此从舱口生长在NGM RNAi + DMSO0.2板上的动物。
      4. 在20°C下孵卵2天(+56小时)到L4级。或者,在15°C下生长动物3天(约75小时)。
      5. 将蠕虫从 NGM RNAi = DMSO0.2 板移动到 NGM RNAi = 抗霉素 A 板或 NGM RNAi = DMSO0.2 板作为控制。蠕虫可以手动移动与选择小规模实验,但对于大规模实验,我们建议用M9清洗动物,定居与离心,吸印M9,然后电镀到NGM RNAi + 抗霉素A板。
      6. 孵育蠕虫为额外的±20小时和图像在第1天成人(第5节)。
  3. 使用gst-4p::GFP作为氧化应激反应的读出。
    1. 使用 RNAi 诱导 OxSR
      1. 或者,使用wdr-23的RNAi-击倒(它编码skn-1的负稳压器;因此,其击倒诱导OxSR)使用第4.1.1节中描述的协议诱导gst-4p:GFP。
    2. 利用暴露于化学氧化剂特丁基氧化过氧化剂 (TBHP) 诱导 OxSR
      1. 准备发现带有RNAi细菌的板,靶向感兴趣的基因,如第3节。即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中使用 HT115 细菌(参见第 1 节)。
      2. 使用第 2 节中描述的方法同步gst-4p::GFP报告动物。
      3. 使用表2中推荐的标准,将鸡蛋盘到选择的种子板上。一定要准备更多的板超过必要的,因为药物治疗协议导致损失的>10-20%的动物。对于成像,从 >100 动物开始,然后从 >1,000 动物开始排序。
      4. 在20°C下孵育鸡蛋2天(+56小时)至L4级。或者,在15°C下生长动物3天(约75小时)。
      5. 将 L4 动物从盘子上洗掉,并按情况分成两个 15 mL 锥形管。吸气体积降至至少 1 mL,并添加相同体积的新鲜制造的 2 mM TBHP。使用总液体体积至少为 2 mL,因为较低的体积可能导致旋转时蠕虫大量死亡。在药物治疗之前不要清洗,因为板的残留细菌有助于确保蠕虫在孵育期间不会过度饿死。
      6. 在20°C下在旋转器上孵育蠕虫4小时。
      7. 以 1,000 x g 的旋转来清洗蠕虫,吸皮 M9 + TBHP 混合物,然后更换 15 mL M9。重复进行第二次洗涤。
      8. 在 20°C 下,EV RNAi 上的板蠕虫在 20°C 下一夜之间恢复 (+16-24 h)。蠕虫可以在匹配选择的RNAi时恢复,但在EV RNAi上恢复时没有显著差异,因此这样做是为了便于实验设置。在恢复后拍摄第 1 天成人的图像。
        注: 执行隔夜恢复,以便累积可检测到的 GFP 水平。如果没有此恢复,就没有可检测到的 GFP 信号。如果需要短期恢复,可以使用第 4.3.3 节中所述的测定。
    3. 利用暴露于化学氧化草草(PQ)诱导OxSR
      1. 重复第 4.2.2 节中的所有步骤,以便根据条件在 15 mL 锥形管中获取 2 批 L4 gst-4p:GFP动物。
      2. 吸气体积降至至少 1 mL,并添加相同体积的新鲜制造的 100 μM PQ。与 4.3.2.5 类似,建议最小体积为 2 mL。
      3. 在20°C下在旋转器上孵育蠕虫2小时。
      4. 以 1,000 x g 的旋转来清洗蠕虫,吸皮 M9 + PQ 混合,然后替换为 15 mL M9。重复进行第二次洗涤。
      5. EV RNAi 上的板蠕虫在 20°C 下恢复 2 小时,然后恢复后立即拍摄图像。
        注:2小时的恢复是可视化GFP感应所需的最小恢复。
  4. 使用 hsp-16.2p::GFP 和hsp-70p::GFP作为 HSR 激活的读出。
    1. 利用暴露于高温下诱导 HSR
      1. 准备发现带有RNAi细菌的板,靶向感兴趣的基因,如第3节。使用 HT115 细菌,即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中(请参阅简介)。
      2. 使用第 2 节中描述的方法同步hsp-16.2p::GFPhsp-70p::GFP报告动物。
      3. 使用表2中推荐的标准,将鸡蛋盘到选择的种子板上。确保准备2倍所需的板数,因为一半的样品将暴露在高温下进行热冲击感应,另一半将作为非热冲击控制。
      4. 在20°C孵卵约3-4天(+65-96小时),在成年后第1天进行实验。不要在15°C下生长蠕虫进行热休克实验,因为在15°C与20°C之间经历热冲击的动物之间只有细微的差别。
      5. 将实验动物群移动到34°C孵化器,温度为2小时。 将板作为单层(即不堆叠板)放入培养箱中,以确保在板子上以最快、最相等的热量分布。
      6. 将热冲击动物移到20°C的培养箱中,恢复2小时,然后立即进行成像(参见第5节)。如有必要,动物可以恢复更长时间,以便提高GFP诱导。
        注:2小时的恢复是可视化GFP感应所需的最小恢复。

5. 使用立体显微镜或低放大倍率宽场/复合显微镜成像

  1. 荧光显微镜蠕虫的准备
    1. 在标准 NGM 板(即无细菌)顶部的移液器 5-10 μL 100 mM 钠子酱。
      注:应氧化钠浓度可降低至10 mM,尽管在100 mM氧化钠上观察到最健壮的固定性,对荧光信号没有可检测作用。
    2. 在解剖显微镜下,从实验板中挑选10-20只动物,并转移到氧化钠的点。动物在钠阿齐德着陆后不久应该停止运动,紫子钠本身将在几秒钟内蒸发。
    3. 一旦氧化钠蒸发,将动物排列到所需的成像设置。与所有动物的两侧和后侧并排移动动物。立即成像动物。
      注:在钠阿齐德瘫痪后,表3中的任何转录记者在瘫痪后长达15分钟内,没有观察到记者信号的变化。
  2. 使用立体显微镜采集图像
    注:对于此协议,使用了配备 Leica DFC3000G 单色 CCD 摄像机、标准 Leica GFP 滤波器(例如 395-455、EM 480 LP)和 LAS X 软件的 Leica M205FA 显微镜。有关曝光时间的建议设置,请参阅表4
    1. 启动 LAS X 程序。
    2. 启动新项目:打开获取选项卡,单击"打开项目",然后单击"文件夹"以打开新项目。可以通过右键单击文件夹向下滚动以重命名或单击F2来重命名此项目。在采集选项卡中,还可以调整曝光时间和缩放到所需设置。
    3. 将蠕虫样本置于显微镜目标下方,并使用明亮场设置定位蠕虫的正确焦点,以尽量减少荧光漂白。样本的中心是鸡蛋线清晰可见且不模糊的地方。将曝光时间、缩放、对焦和明亮场冷凝器设置为所需的设置。
    4. 使用"捕获图像"按钮获取图像。
    5. 以 .lif(Leica 图像文件)格式保存图像,这样可以保存所有原始图像和元数据。TIFF 也可以通过右键单击图像(或项目)导出,并在"保存为"选项下导出,单击TIFF。这将存储所有通道(例如,明亮场和 GFP)的任何修改(例如,如果调整了对比度,这将保存到 TIFF 中)。
  3. 荧光图像定量分析
    1. 如果将执行定量分析,则拍摄三维图像。这是通过单击右上角标有"z"的 z 节选项来执行的。如果此框为红色,Z 节将处于活动状态。
    2. 通过选择可调选项左下角的范围和切片厚度来优化 z 节。尽可能使用"系统优化"按钮进行最佳设置。
    3. 捕获图像并存储第 5.2 节中所述的图像。将蠕虫与它们之间的空间排列,以便进行更轻松的测量。
    4. 将 TIFF 图像导入首选成像软件(例如 ImageJ)。
    5. 对于 ImageJ,从"分析"菜单中,选择"设置测量"。检查以下内容:面积、平均灰值、集成密度、显示标签。
    6. 使用 ROI(感兴趣区域)工具绘制 ROI。单独测量每个蠕虫。从"分析"菜单中,选择"度量"或"按M"。在没有蠕虫的后台绘制 ROI,然后以相同的方式测量背景。复制或保存显示在"结果"窗口中的测量值。
    7. 从每个测量 ROI 的集成密度中减去背景集成密度。ROI 的背景强度定义为背景值的灰色值和绘制的 ROI 区域。
  4. 使用复合/广域显微镜采集图像
    注:对于使用复合/宽场显微镜对转录记者进行成像,本协议使用配备奥林巴斯 4x 计划氟石 NA 0.13 物镜的 Revolve ECHO R4 显微镜,这是标准奥林巴斯 FITC 滤镜(前 470/40;em 525/50;DM 560),以及用于相机和驱动ECHO软件的 iPad Pro。有关曝光时间的建议设置,请参阅表4
    1. 使用触摸板启动控制程序。创建新的相册和文件名。
    2. 将板置于客观透镜下方。使用基线(EV/控制处理)和正控制设置曝光时间和荧光强度,使信号可见但不饱和。
    3. 保存亮场图像和 GFP/FITC 图像。

6. 使用大颗粒流式圆测仪对记者进行定量测量

注:用于大颗粒流动细胞仪分析的蠕虫的生长和制备可以遵循与第1-5节相同的范例,用于制备用于荧光成像的蠕虫,但需要数量较多的动物除外。每个条件使用 >500 动物,因为有些动物在操作过程中丢失,并非所有动物在定量过程中都通过过滤标准,并且某些动物没有通过流动细胞计正确读取。将 5-10 mL M9 溶液中的板分类到 15 mL 锥形管中,以便随后在流量细胞仪上进行分拣。

  1. 使用大型粒子流细胞计进行排序设置
    1. 在打开流量细胞仪之前
      1. 确保护套液体瓶不是空的。在使用分拣机前至少几个小时从 250x 库存中制备护套液体,因为护套液中有少量洗涤剂,这可能导致在采集过程中产生气泡。
      2. 确保所有废容器未满。
    2. 打开流量细胞计
      1. 打开空气压缩机。将其转向"自动"。检查压力表 - 它应该在 30 psi 左右。
      2. 打开仪器。使用仪器左侧电源线旁边的电源开关。
      3. 打开激光。488 nm 光源通常足以用于大多数实验,但如果需要更高的荧光激发,则需要使用 561 nm 光源。
      4. 打开流量引导软件;仪器应对不同的阀门进行一系列咔嗒声。
      5. 单击"开始"打开软件窗口中的激光器。通过单击"运行"在 Argon 激光控制弹出窗口中启动激光。这可能会导致激光打开并达到大约 12 mW。488光源水平将高达12左右。
      6. 单击"完成"关闭窗口。
    3. 在前进之前检查软件
      1. 检查压力表 - 查看窗口底部显示的 4 个压力值。这些值应围绕原始设置(护套 5.5-5.7;样本 5.7-6.0;分拣机 3.1-3.3;清洁 8.5-8.7)。如果它看起来相似,请选中"压力确定"旁边的复选框。
      2. 检查流动性 - 为了确保没有气泡和碎屑阻塞护套/样品通过流动单元的流动,请单击"清洁"几次。
      3. 检查护套流速 -为此,收集 60 s 的护套。关闭排序,然后在手动控制中打开护套以启动护套的流动。收集在15 mL管60s;流量应为 ±9-10 mL/min。
    4. 使用流量细胞仪前进行清洁
      1. 将 #3-5 mL 的 10% 漂白溶液放入收集"杯",然后单击"获取"。让我们运行 30 s,单击"中止",然后用真空去除多余的。
      2. 用去离子水冲洗收集"杯",然后用真空去除。重复 2 倍。
      3. 将 #3-5 mL 的 COPAS 清洁溶液放入收集"杯",然后单击"获取"。让我们运行 30 s,单击"中止",然后用真空去除多余的清洁溶液。
      4. 用去离子水冲洗收集"杯",然后用真空去除。重复 2 倍。
      5. 将 #3-5 mL 的 M9 解决方案放入集合"杯"中,然后单击"获取"。让我们运行 30 秒,单击"停止",然后用真空去除多余的 M9 溶液。
  2. 在分拣机上运行样本
    1. 根据导致对感兴趣的转录机最亮激活的条件调整激光 PMT 功率和尺寸浇注。建议的设置可在表 4中找到。
    2. 将准备好的蠕虫添加到"杯"。单击"获取"。注意确保所有液体未被放入机器中;这将导致流动测速仪在空气中产生气泡。
    3. 当样本低和/或收集了足够的动物时,单击"中止"。
    4. 单击"设置" |数据存储 |仅限门控。这将仅根据大小约束保存数据。单击"存储门控"并保存门控数据。单击"擦除"可擦除数据。
    5. 用去离子水冲洗收集"杯",然后用真空去除。重复 2 倍。
    6. 对其余样品重复步骤 6.2.1-6.2.5。
  3. 校准/质量控制 - 如有必要
    注:这需要运行控制42μMGYR荧光粒子,以校准488激光。
    1. 按样品杯顶部的金属唇以拆下空气管。拧下盖子,使用注射器从样品杯中取出液体。
    2. 在使用前将一瓶控制颗粒混合,并在样品杯中加入几毫升。关闭盖子,按压空气,使其重新打开,直到其咔嗒声到位。
    3. 在软件中,转到"工具"选项,然后单击"运行控制粒子"。
    4. 对于控制粒子,将 PMT 值重置为:绿色 - 325;黄色 - 365;红色 - 575。
    5. 单击"获取"。护套应打开,然后打开样品。一旦珠子开始穿过流动单元,就会在屏幕底部看到流速。最佳时,流量应在 5/s 和 15/s 之间。如果流速过低或为零,请物理顺时针转动样品阀以增加流速。如果流速过高,请逆时针转动样品阀以降低流速。
      注:通常,在珠子保护模式下,在关闭之前读取 500 个珠子。数据可以擦除并重新读取珠子。
    6. 读取完成后,检查 5 个参数以及 CV 值的清洁单个峰值。方差系数 (CV) 应为 <15%。此外,请确保三个不同荧光通道的 CV 值彼此接近。
    7. 记录 QC 检查:在"文件"选项卡下,单击"保存为屏幕图像"。
  4. 清洁和关闭
    1. 使用真空从样品杯中取出样品,并重复第 4.1.4 节。
    2. 将 #3-5 mL 的去离子水放入收集"杯",然后单击"获取",让运行 30 s,然后单击"中止"。在样品杯中留下一些蒸馏水。
    3. 清空样品回收杯和废瓶。
    4. 关闭软件。在"文件"选项卡下,单击"退出"。在弹出式菜单中,单击"关闭而不清除"。
    5. 关闭激光,关闭仪器,然后关闭空气压缩机。关闭舱口以盖住仪器。

7. 生理测定,以测量C.埃勒甘人的压力敏感性

  1. 使用图尼卡霉素暴露测量ER应力灵敏度
    1. 准备NGM RNAi DMSO板发现与RNAi细菌靶向感兴趣的基因,如第3节。即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中使用 HT115 细菌(参见第 1 节)。记得还要播种 NGM RNAi TM 板(参见表 1)。种子足够数量的板:计划为+5-7组NGM RNAi DMSO板和+2-3组NGM RNAi TM板。
    2. 使用第 2 节中描述的方法同步选择的动物。
    3. 板鸡蛋到NGM RNAi DMSO种子板的选择使用标准建议在表2。请务必准备 2 倍的板材数量,因为一半的样品将转移到 NGM RNAi TM 板。
    4. 在20°C孵育卵子约3-4天(+65-96小时)至成年后第1天。
    5. 在第1天,通过将动物转移到单独的盘子上来准备寿命。为了保存板(TM 成本很高),每个条件使用 8 个板,每状况 15 只动物,每个条件总共 120 只动物。这允许每盘可管理数量的动物进行评分,并允许有足够的动物进行统计分析,即使进行一些审查。
    6. 在最初的5-7天里,每天将成年动物从后代转移到一个新的盘子上,直到后代不再可见。在这个阶段,检查动物被袋装,表现出秃鹰突起/爆炸,或爬上板的两侧,因为这些不是死亡相关的ER应力敏感性。请注意,TM 治疗会导致动物的捕回,因此每 2-3 天仅移动 1-2 次这些动物就足以将生产含 TM 板的相关成本降至最低。野生型动物在DMSO上的平均生存量为15-17天,在Tunicamcyin上平均存活12-14天。
    7. 动物停止后代生产后,每1-2天计分寿命,直到所有动物被评分为死亡或被审查。TM-在成年6-14天每天治疗动物,以获得更高的分辨率。
  2. 利用百草枯的线粒体和氧化应激敏感性测量
    1. 准备发现带有RNAi细菌的板,靶向感兴趣的基因,如第3节。即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中使用 HT115 细菌(请参阅简介)。
    2. 使用第 2 节中描述的方法同步选择的动物。
    3. 盘蛋到NGM RNAi种子板的选择使用标准建议在表1。测定要求每况下60-100只动物,因此要做好相应的准备。
    4. 在20°C孵育卵子约3-4天(+65-96小时)至成年后第1天。
    5. 在 M9 溶液中准备一瓶 100 mM 百草枯的新鲜小瓶。
    6. 移液器 50-75 μL 的 M9_百草枯可根据需要放入平底 96 孔板的井中。一般建议每个水井有+8-10的井,每口井含有+8-10只动物。这允许容易看到数量的动物每井与+80动物每应变。
    7. 根据条件选择8-10只动物,并将其转移到每个装有M9+百草枯的井中。使用挑料将动物转移到井中,而不是移液,以避免数量差异和百草枯浓度的意外变化。
    8. 每2小时,每口井动物死亡得分。轻轻敲击盘子,导致活体动物颠簸或弯曲。请注意,活的动物有时可能瘫痪足够长的时间,可以被记为死亡。因此,如果活体动物的数量超过前一个时间点中活体动物的数量,则动物很可能还活着,应该没有评分(例如,如果在第4小时,2/10的动物被评分为死亡,而在第6小时,只有1/10只动物死亡,第4小时应重新评分为1/10只动物死亡)。
  3. 利用暴露于高温测量热灵敏度
    1. 准备发现带有RNAi细菌的板,靶向感兴趣的基因,如第3节。即使在不涉及 RNAi 击倒的实验中使用 HT115 细菌(参见第 1 节)。
    2. 使用第 2 节中描述的方法同步选择的动物。
    3. 使用表1中推荐的标准,将鸡蛋盘到选择的种子板上。每个条件有60-100只动物进行耐热性测定。对于耐热性测定,使用 L1 抓扣或蛋层测定进行最佳同步,因为根据测定中动物的年龄存在重大变异性。
    4. 在20°C下孵育动物约3-4天(约65-96小时),在成年后第1天进行实验。不要在15°C下生长蠕虫进行热休克实验,因为在15°C与20°C之间经历热冲击的动物之间有细微的差别。
    5. 在第1天,通过将动物转移到单独的盘子上来准备动物。一般建议每板有+10-15只动物,每板4-6个板,总共60只动物。这允许每盘可管理数量的动物进行评分,并允许动物从高温中拉出最少的时间。
    6. 将动物放入37°C孵化器,每2小时计分一次。中位耐热性在+9小时完成,因此第7、9和11小时是关键时间点,尽管由于培养箱和实验室到实验室的变异性,这可能需要每个实验室进行定零。此外,任何减少变异性的方法都会有所帮助(例如,不堆叠板,将板放在单个培养箱的同一区域,尽量减少孵化器打开或关闭的时间,一次从培养箱中取出几块板,以尽量减少动物在37°C之外停留的时间等。有关完整指南,请参阅21
    7. 作为步骤 7.3.6 的替代方案,将动物置于 34 °C 而不是 37 °C。34°C的中位热耐受度略高于14小时,因此时间点12、14和16对于34°C耐热性测定至关重要。

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Representative Results

使用转录记者测量压力反应的激活
在这里,荧光转录记者被使用,作为强大的工具,以测量激活大多数压力反应在C.elegans。GFP 表达式在主转录稳压器的规范目标推动下驱动,用于响应隔间特定的应力。表3提供了常用转录记者的完整名单。

通过展开或错折叠的蛋白质或脂质双层应力干扰ER平衡,导致ER(UPRER)展开的蛋白质反应的激活,恢复ER的质量和功能。UPRER由透膜传感器定义的3个不同的分支组成:肌醇需要蛋白1(IRE1)、激活转录因子6(ATF6)和蛋白激酶RNA(PKR)状ER激酶(PERK),所有这些都保存在C.elegans7,22,23。22,237监测线虫中普遍定期审议ER激活的最常见工具,是在hsp-4促进器(hsp-4p::GFP)7的控制下表示GFP的转录机压力。7该基因hsp-4编码哺乳动物Hsp70、HSPA5(或BiP/Grp78)的正交。在启用 UPRER时,在 ER 应力时,hsp-4p::GFP报告器应变表示 GFP。本报记者在没有压力的情况下基底表达最少,但当动物接触图尼卡霉素时,其GFP表达力强(图1A)。这些差异也可以使用大颗粒流细胞计(图1B)进行量化。此外,hsp-4p::GFP在ER应力下的诱导可以完全抑制的RNAi-击倒xbp-1,因为激活这个转录报告器取决于转录因子XBP-112。

与普普法ER类似,线粒体有其自身保护机制,可防止蛋白毒性应力。这种被称为线粒体UPR(UPRMT)24的机制MT主要受转录因子ATFS-1的调节,由于进口效率降低,由于进口效率降低,该机制在压力下无法进入线粒体,导致ATFS-1进入核25。有趣的是,对线粒体过程的不同扰动可以激活这种反应,包括蛋白质聚集、击倒电子传输链(ETC)复合子单位、线粒体DNA复制应力和线粒体蛋白翻译8,8、26。通过蠕虫表达转基因结构,将GFP置于线粒体陪护基因,hsp-6hsp-608的促进剂的调节下,对普普定期审议MT的激活进行了监测。与hsp-4p::GFP动物类似,hsp-6p::GFP动物在无压力的情况下表现出最小的基底信号。诱导UPRMT的最可靠方法是通过RNAi-击倒以下线粒体蛋白:cox-5B,细胞色素c氧化酶亚单位Vb/COX4(复合IV)20,nuo-4,NADH脱氢20酶蛋白(nuo-4复杂I)27,mrps-5,线粒体核糖体蛋白28,激活hsp-6p。通过此报告器的 GFP 表达式是强健激活的,在这些条件下可以轻松可视化和量化(图 2A-B)。UPRMT也可以通过电子传输链 (ETC) 的化学抑制触发,例如使用抗霉素 A,抑制细胞色素 c 还原酶(复杂 III)。与ETC分量的RNAi-击倒类似,抗霉素A治疗会导致hsp-6p::GFP(2C-D)的强力诱导。

生物体感知和响应氧化应激的能力是一个从细菌到人类的保守过程。在C.elegans中,NRF2同源体SKN-1是一个重要的转录因子,它对全蛋白中活性半胱氨酸引起的氧化还原变化很敏感。SKN-1作为OxSR的转录活化剂之一,通过结合来保存共识序列,高度类似于NRF230约束的抗氧化反应元素。在人类中,NRF2受到KEAP1的负调节,它被认为对红氧核酸的变化敏感,因为反应性半胱氨酸在整个蛋白质31。虽然蠕虫中没有KEAP1的直接正交,但SKN-1受到WD-重复蛋白WDR-23的负调节,其机械方式不同于KEAP1/NRF2抑制32。在氧化应激时,如二丁基氧化过氧化物 (TBHP),SKN-1 激活解毒和抗氧化基因,如gst-4,谷胱甘肽 S-转移酶。为了测量氧化应激,GFP表达被置于gst-4的促进器下,谷胱甘肽S-转移酶33。与此处介绍的其他转录稳压器不同,gst-4p::GFP具有高基底表达。然而,这种表达仍然可以在氧化应激条件下被强有力地激活,这在遗传和化学条件下都可以进行。为了在基因上诱导氧化应激,我们击倒wdr-23,它编码了一种蛋白质,在SKN-134的蛋白体降解中起着一定的作用。wdr-23击倒导致gst-4p::GFP的稳健激活。此外,用化学氧化剂TBHP处理蠕虫,导致gst-4p:GFP(图3)的激活较为温和,但仍然显著。gst-4p::GFP的化学和遗传活化几乎完全可以通过RNAi击倒skn-1,编码OxSR主转录调节器的基因来抑制。

大多数细胞蛋白被转化在细胞质中并存在于那里,即使只是暂时地被定位到别处。因此,细胞质承载着各种陪护器,促进适当的蛋白质折叠和功能,以及负责降解受损、功能失调或过量蛋白质的酶和蛋白质。为了保护细胞质的这种复杂的蛋白质环境,细胞已经进化出几种细胞质应激反应途径,包括热冲击反应(HSR)35,36。35,36HSR是一种致力于在热应力条件下促进蛋白质平衡的途径,由主转录调节器HSF-137调制。在稳定状态条件下,HSF-1 受细胞质护行器 HSP90 和 HSP70/40 的约束,这使得其锁定在单体非活动状态。在高温或类似应力条件下,错误折叠的蛋白质增加导致伴子滴定远离HSF-1,使其可以修剪并转移到细胞核,激活HSR38,39。38,在HSR激活下,HSF-1研究最多的下游目标是热休克蛋白(HSP),如HSP70、HSP90、DNAJ和HSP6017,40。17,40C.elegans中,HSR的转录记者是通过在规范性HSP、hsp-16.2hsp-709,4141的推广器下驱动GFP的表达来合成的。9与其普高人民共和系数和普高埃尔ER对应项一样,hsp-16.2p:GFPhsp-70p:GFP在无应力的情况下显示最小基底表达式。然而,两个记者在热应力条件下都强烈诱导,通过显微镜或使用大颗粒流细胞计进行量化,可以很容易地进行可视化(图4)。两位记者的动态范围都很大,感应完全依赖于hsf-1,因为rnAi-hf-1的击倒完全抑制hsp-16.2p:GFPhsp-70p:GFP的感应。虽然这些报告者可以互换用于大多数情况,但不同组织的表达水平和表达可能存在差异。

生理测定测量C.elegans中的压力敏感性
C. elegans是测量应力敏感性的一个伟大的模型有机体,由于维护和实验成本低,并且使用 RNAi 进行基因组编辑或基因敲除的简便性,它提供了在整个生物体中执行大规模实验的能力。为了对ER应力进行压力耐受性测定,我们向化学剂Tunicamecin暴露C.elegans,通过阻断N相关糖基化10,导致ER中受损蛋白质的积累。动物在发育后会接触到图尼卡霉素,因为药物会导致发育缺陷。当接触图尼卡霉素时,成年蠕虫的寿命明显下降。此外,基因xbp-1的敲除,编码了UPRER诱导中涉及的主要转录因子之一,导致对图尼卡霉素(图5A)12的敏感性显著增加。12因此,这是一个可靠的测定,以测量在成年蠕虫的ER应力敏感性。

为了测量氧化应激和线粒体应激,我们让动物接触化学剂,百草枯。帕拉夸奇通过线粒体基质内ROS的合成引起线粒体应力,然后可转化为过氧化氢,从线粒体扩散出来,造成全细胞氧化损伤13。与ER压力测定类似,我们成年后让动物接触百草枯。然而,我们用液体进行百草枯测定,以降低成本,体力劳动,大多数实验室很难进行基于加板的测定。在这里,我们显示,暴露在液体中百草枯的动物显示平均生存约5小时(5B)。此外,由于DAF-16/FOXO的激活导致参与清除ROS的表达增加,如sd-342,43,,43胰岛素受体的敲除,导致对百草枯的抵抗力增加。百草枯生存测定时间短,持续长达14小时,因此是询问线粒体和氧化应激反应的有效方法。

最后,在高温下生存用于询问对热应力的生理反应。这些测定可以在液体或固体阿加中进行,并且存在许多不同的协议概述21。建议在实验室中标准化单个测定,以减少可变性,这种测定中异乎寻常。热耐受性应在标准加盘的第 1 天成人动物中进行,温度应在 34°C 或 37 °C 下进行。在37°C下,大多数死亡发生在7-11小时之间,这使得这是一个简单的单日测定,而12-16小时在34°C的实验最容易在一夜之间进行(5C-E)。基因ttx-3的突变导致负责热感官神经回路的AIY间神经元的规格失效,导致热敏性44显著增加。虽然耐热性数据可以绘制为生存曲线(图5C),但这些测定应至少执行4-6次,并且所有复制应相互绘制(图5D-E),因为与其他应力测定相比,耐热性表现出令人难以置信的高变异性。这是因为在建立这些实验时存在许多警告,包括兴趣菌株的变异性、孵化器中空气循环不均、agar板不均匀等。在34°C时,中位生存发生在大约14小时,类似于37°C,ttx-3突变体在34°C时表现出生存率下降(图5E)。 ttx-3

Figure 1
图1:使用hsp-4p::GFP作为跨月加系数感应的记者。Ahsp-4p 的代表荧光显微图:GFP 表示在控制空矢量 (EV) 或xbp-1 RNAi 上生长的动物。动物从孵化到20°C的L4,然后用25纳克/μL的Tunicamycin或1%的DMSO在20°C下漂浮在M9中4小时,在OP50板上恢复16小时,在20°C成像前。动物在NGM加盘上的100μM钠阿齐德中瘫痪,并使用立体显微镜进行成像。(B) 使用大型粒子生物分拣机定量分析 (A) .数据表示为整个动物的集成荧光强度,其中每个点代表单个动物;DMSO控制是灰色和通霉素处理的动物是红色。中心线表示中位数,胡须表示四分位数范围。n = 每株 123-291 只动物。p < 0.001 使用非参数曼-惠特尼测试。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:使用hsp-6p::GFP作为UPRMT感应的记者。Ahsp-6p的代表性荧光显微图:GFP 表示在控制空矢量 (EV)、cco-1、mrps-5 或nuo-4 RNAi 上生长的动物。-1 mrps-5动物从孵化开始生长,在成年第1天在20°C时成像。动物在NGM加盘上的100μM钠阿齐德中瘫痪,并使用复合显微镜进行成像。(B) 使用大型粒子生物分拣机定量分析 (A) .数据表示为整个动物的集成荧光强度,其中每个点代表单个动物;EV控制是灰色的RNAi处理的动物是红色。中心线表示中位数,胡须表示四分位数范围。n = 每个菌株 303-384 只动物。p < 0.001 相比,使用非参数曼-惠特尼测试的 EV 控制。(Chsp-6p的代表图像:使用 DMSO 或抗霉素 A 处理的 GFP 动物从 0.2% DMSO 板的孵化口中生长,并转移到含有 0.2% DMSO 或 3 mM 抗霉素 A 的板中,在旋转 ECHO R4 复合显微镜上成像之前 16 小时。所有生长均在20°C下进行。(D) 使用类似于 (B) 的大型粒子生物分拣机对 (C) 进行定量分析.DMSO控制是伟大的,和安提霉素A处理的动物是红色的。n = 495 用于 DMSO,219 表示安蒂霉素 A. =p < 0.001,而使用非参数曼-惠特尼测试的 EV 控制。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3:使用gst-4p::GFP作为OxSR的记者。Agst-4p 的代表性荧光显微图:GFP 表示在控制空矢量 (EV)、skn-1 或wdr-23 RNAi 上生长的动物。 skn-1动物从孵化到20°C的L4阶段在RNAi上生长。动物从孵化到20°C的L4,然后用M9的2 mM TBHP进行治疗,或只在20°C下进行"未经治疗"控制4小时,在20°C的EV板上恢复16小时,在20°C成像前。动物在NGM加盘上的100μM钠阿齐德中瘫痪,并使用复合显微镜进行成像。(B) 使用大型粒子生物分拣机定量分析 (A) .数据表示为整个动物的集成荧光强度,其中每个点代表单个动物;未经处理的控制是灰色的,TBHP处理的动物是红色的。中心线表示中位数,胡须表示四分位数范围。n = 每个菌株 101-204 只动物。p < 0.001 相比,使用非参数曼-惠特尼测试的 EV 控制。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4:使用hsp16.2p::GFPhsp-70p::GFP作为热冲击响应的记者。Ahsp16.2p::GFP表示在控制空矢量 (EV) 或hsf-1 RNAi 上生长的动物的代表性荧光显微图。动物从20°C的孵化口生长在RNAi上,直到第1天。第1天,动物要么留在20°C(未经治疗),或暴露在2小时热应力在34°C,然后在20°C恢复2小时。动物在NGM加盘上的100μM钠阿齐德中瘫痪,并使用立体显微镜进行成像。(B) 使用大型粒子生物分拣机定量分析 (A) .数据表示为整个动物的集成荧光强度,其中每个点代表单个动物;未经处理的控制是灰色的,热冲击的动物是红色的。中心线表示中位数,胡须表示四分位数范围。n = 每个菌株 320-364 只动物。p < 0.001 使用非参数曼-惠特尼测试。(Chsp-70p 的代表荧光显微图::GFP 表示在控制 EV 和hsf-1 RNAi 上生长并处理在 (A) 中所述的动物。(D) 定量分析 (C) 如 (B) 所述.n = 773-941 动物每株应变。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 5
图5:在C.elegans的压力下进行生理生存测定。A) 线虫的寿命在含有 25 纳克/μL Tunicacin (TM) 板的 1% DMSO 上生长。动物从舱口到第1天,在1%的DMSO板上生长,并在第1天转移到各自的TM板。动物从孵化口一直控制在控制空向量 (EV) 或xbp-1 RNAi 上,直到测定结束时在 20°C 下。成年动物每天被手动从后代身边移走,直到第7-8天,当后代不再被检测到时,每2天打一次,直到所有动物都记录为死亡或被审查。袋装、外阴突起/爆炸的动物,或那些爬到盘子两侧的动物被认为是经过审查的。(B) 在 M9 溶液中溶解的 100 mM 百草枯 (PQ) 中线虫的生存曲线。动物生长在EV或daf-2 RNAi从孵化到成年第1天在20°C。动物在20°C的96孔板中放入50μL的M9+PQ溶液中,每2小时可视化一次,直到所有动物都一动不动。(C) 线虫在 37 °C 处的生存曲线。野生型(N2)、ttx-3 (KS5)sur-5p::hsf-1动物从孵化到 20°C 的 EV 板生长。在第1天,动物被转移到37°C,每2小时打一次,直到所有动物被评分为死亡或被审查。(D) 在 37 °C 下执行的所有耐热耐受性测定的汇总数据。数据在热容差测定的第 9 小时表示为活动百分比,每行表示同一天执行的匹配实验。(E) 在 34 °C 下执行的所有耐热耐受性测定的汇总数据。数据在热容差测定的第 14 小时表示为活动百分比,每行表示同一天执行的匹配实验。A-C 的所有统计信息都是使用日志列(Mantel-Cox)测试执行的,可以在表 5中找到。请点击此处查看此图形的较大版本。

试剂 食谱
莱索根·布罗斯 (LB) 在此协议中,使用了商用 LB(参见材料),但使用百托锥、酵母提取物和 NaCl 的所有标准 LB 自制配方都就足够了。
内马托德增长媒体 (NGM) 1 mM CaCl2,5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(v)agar,0.25%(w/v)巴托-肽,51.3 mM NaCl
漂白液 1.8%(v/v)次氯酸钠,0.375 M KOH
M9 解决方案 22 mM KH2PO4 单体,42.3 mM Na2HPO4,85.6 mM NaCl,1 mM MgSO4
NGM RNAi 板 1 mM CaCl2,5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(w/v)a加,0.25%(w/v)巴氏-肽,51.3 mM NaCl,1 mM IPTG,100 μg/mL 卡贝辛/安培霉素。在黑暗中储存在4°C下长达3个月
四环素 100%乙醇10毫克/mL库存溶液(500倍)。储存在-20°C
卡贝尼西林 水中 100 毫克/mL 库存溶液(1000x)。在 4 °C 下储存长达 6 个月或 -20 °C,用于长期储存
阿齐德钠 1 M 库存 (+6.5%)水中应氧化钠的库存溶液。以 4 °C 的天黑处储存。这是一个 10 倍的解决方案,在大多数成像实验中被稀释为 100 mM 工作库存
图尼卡霉素 2.5 毫克/mL 库存溶液,100% DMSO。储存在-80°C,长期储存。这是一个 100x 解决方案(25 纳克/μL 工作解决方案)
抗霉素 A 15 mM 抗霉素 A 库存溶液,100% DMSO。储存在-20°C。这是一个 5000x 解决方案(3 μM 工作库存)
百草 枯 50 μM 溶液在水中 – 应新鲜制备
二丁基氧化氢(TBHP) 7.7 M 溶液在水中。这是一个 3850x 解决方案(2 mM 工作库存)
NGM RNAi = DMSO0.2 1 mM CaCl2,5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(w/v)a加,0.25%(w/v)巴氏-肽,51.3 mM NaCl,1 mM IPTG,100微克/mL卡贝辛/安培霉素,0.2% DMSO-in
(抗霉素 A 的控制)
NGM RNAi = 抗霉素 A 1 mM 卡Cl2, 5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(w/v)agar,0.25%(w/v)巴氏-肽,51.3 mM NaCl,1 mM IPTG,100微克/米叶白素/安皮素,0.2%DMSO,3 mM抗霉素Acl
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2,5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(w/v)a加,0.25%(w/v)巴氏-肽,51.3 mM NaCl,1 mM IPTG,100 μg/mL卡贝西林/安培霉素;1% DMSO
(控制图尼卡霉素)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2,5 μg/mL 胆固醇,25 mM KPO4 pH 6.0,1 mM MgSO4,2%(w/v)a加,0.25%(w/v)巴氏-肽,51.3 mM NaCl,1 mM IPTG,100 μg/mL卡贝西林/安培霉素;1% DMSO, 25 纳克/μL 图尼卡霉素
IPTG 水中 1 M 溶液。

表1:所用试剂的建议配方。此处概述了该协议中使用的试剂的所有确切配方。购买试剂的特定公司也可在材料表中查阅。对许多不同的化学品来源进行了测试,材料表中所列的化学品是具有最可靠和可重现结果的化学品。

板尺寸 细菌类型 动物到达第1天成年* 动物到达L4级的 *
60 毫米 OP50 100-150 150-300
60 毫米 HT115 70-100 120-200
100 毫米 OP50 600-1000 1500-2000
100 毫米 HT115 350-600 700-1300

表2:建议动物数量在同步后盘,以避免饥饿。为了避免饥饿,我们建议根据条件电镀特定数量的动物。由于OP50比HT115密度高,可以镀更多的动物。此处列出的所有数字都是我们实验室使用的指南,由于几个变量和实验室条件之间的差异,数字可能略有不同。因此,或建议的数字位于下侧,以粗体显示。最大数字是我们实验室在最佳条件下可以镀,而不会达到饥饿,但不建议在不首先对条件进行定印的情况下使用这些值。所有数字均以假设细菌被播种到板上,并允许在将蠕虫放在板上之前在环境温度 (+22 °C) 下生长 24 小时。虽然在电镀鸡蛋或L1时饥饿率没有显著差异,但我们建议在电镀鸡蛋时电镀+10%的数字,因为并非所有鸡蛋在漂白后都会孵化。

应变名称 转基因 目的 压力的推荐应用
SJ4005 hsp-4p::GFP 普普埃尔 25 μg/mL 图尼卡霉素 CGC
SJ4100 hsp-6p::GFP 普普瑞MT 3μM抗霉素A; CGC
RNAi 对抗 ETC 或线粒体核糖体
SJ4058 hsp-60p::GFP 普普瑞MT 3μM抗霉素A; CGC
RNAi 对抗 ETC 或线粒体核糖体
CL2070 hsp-16.2p::GFP 热冲击响应 34 °C 2 小时 CGC
AM446 hsp-70p::GFP 热冲击响应 34 °C 2 小时 森本实验室
CL2166 gst-4p::GFP 奥克斯施尔 50mM百草枯; CGC
2 mM 特丁基水氧化物
CF1553 草皮-3p::GFP OxSR 和胰岛素信号 RNAi对抗daf-2(胰岛素受体) CGC
AU78 T24B8.5p:GFP 先天免疫反应 病原体暴露(例如,P. aeruginosa) CGC

表3:用于评估细胞压力反应激活的转录记者。此处列出的菌株均可通过 CGC 或向实验室的特殊请求获得,用于本手稿中描述的定性和定量成像方法。这些菌株都来自布里斯托尔N2背景。还提供了应用压力以激活记者的推荐方法。除草-3p::GFP45T24B8.5p:GFP46外,所有记者均在文本中进行了说明。

转基因 压力的推荐应用 使用 Leica M2250FA 立体显微镜的曝光时间 使用旋转 ECHO 显微镜的曝光时间 使用联盟生物识别COPAS生物分拣器的PMT值
hsp-4p::GFP 25 μg/mL Tunicamycin(过夜回收4小时) 200 毫秒 275 毫秒 450
hsp-6p::GFP 3 μM 抗霉素 A (+16 小时); 100毫秒 50 毫秒 350
RNAi 对抗 ETC 或线粒体核糖体(从舱口)
hsp-60p::GFP 3 μM 抗霉素 A (+16 小时); 200 毫秒 100 毫秒 450
RNAi 对抗 ETC 或线粒体核糖体(从舱口)
hsp-16.2p::GFP 34 °C 2 小时 400 毫秒 200 毫秒 500
hsp-70p::GFP 34 °C 2 小时 400 毫秒 300 毫秒 500
gst-4p::GFP 50mM百草枯(约2小时); 100 毫秒 50 毫秒 350
2 mM tt-丁基氧化氢(+4小时,过夜回收)
草皮-3p::GFP RNAi对抗daf-2(胰岛素受体) 300 毫秒 300 毫秒 475
T24B8.5p:GFP 病原体暴露(例如,P. aeruginosa) 100 毫秒 50 毫秒 350

表4:使用大型颗粒生物分拣机推荐荧光显微镜和定量设置。此表作为大型粒子生物分拣机荧光显微镜或 PMT 值推荐曝光时间指南。这些将作为良好的起点,但应为每个实验调整曝光时间和 PMT 值,以确保不发生饱和,荧光值超过背景信号的检测限制。如果已知具有实验最亮信号的样品(例如,应力感应的正控制),这些样本可用于确定可在不饱和信号的情况下使用的最高暴露时间或 PMT。如果最亮的样本不知道,则可以使用该控件,并且可以使用系统动态范围中心的曝光时间或 PMT。

相应的图 应变, 治疗 中位寿命 • 死亡/* 总计 中位寿命变化百分比 p 值(日志排名;曼特尔-考克斯)
5A N2,矢量 RNAi,1% DMSO 22 天 95/120 -- --
N2, xbp-1 RNAi, 1% DMSO 14 天 92/120 -36.4 < 0.001
N2,矢量 RNAi,25 ng/μL TM 14 天 97/120 -36.4 < 0.001
N2,xbp-1 RNAi,25 纳克/μL TM 12 天 98/120 -45.4 < 0.001
5B N2,矢量 RNAi,100 mM PQ 5 小时 73/73 -- --
N2,daf-2 RNAi,100 mM PQ 6.5 小时 74/74 30 < 0.001
5C N2,矢量 RNAi,37 °C 8 小时 59/60 -- --
ttx-3 (KS5), 矢量 RNAi, 37 °C 7 小时 60/60 -12.5 0.002
sur-5p::hsf-1,矢量RNAi,37°C 9 小时 59/60 12.5 0.012

表5:寿命和压力生存测定的统计数据。此处提供了图 5的所有样本大小、统计信息和审查率。

压力响应 目标基因 正向引引 反向引底器
普普埃尔 hsp-3 TCGCTGGATTGAACGTTCG GTTGCGTTCTCTTCTTTG
普普埃尔 hsp-4 加卡塔特克茨格特格格格格格格 加卡塔特克茨格特格格格格格格
普普埃尔 塞尔-11 TTGATCTCCGGAAAAACG TTGATCTCCGGAAAAACG
普普埃尔 ire-1 TCCTCACCCAT TCCTCACCCAT
普普埃尔 xbp-1 GGACTCTCTCTCTGGGGT GGACTCTCTCTCTGGGGT
普普埃尔 xbp-1(拼接) GGTGGATGGG加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加 GGTGGATGGG加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加
普普埃尔 crt-1 加塔塔加加格加格加加理事会 加塔塔加加格加格加加理事会
普普埃尔 T14G8.3 CACCAT卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡特 CACCAT卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡特
高铁 hsp-17 TCGTTTTCCACTCCCCCA TGTTTGCGGCCCAGTT
高铁 hsp-70 TGTTTGCGGCCCAGTT TTCGATGAGAAGGCGACT
高铁 F44E5.4 TTCGATGAGAAGGCGACT CGTTGTGCTCTTTT
高铁 hsp-16.2 TCCATCTCTCTGGATT
GTTA
TGGTTACTGTGAGAGGGA
高铁 hsf-1 TTTGCTTTGTGTTGTTGTC CtATTTCCCACACGTGT
普普瑞MT hsp-6 加加茨格格格加加加加 CGGCATTCTTCTTTTTT
普普瑞MT hsp-60 CGGCATTCTTCTTTTTT CGTCGTTGCAAGAAGAAGAAGAGAGAGAGAGAG
普普瑞MT 伊梅尔-1 卡萨阿加特格格茨格格格格格 TTCTCATGTCCCAGT
普普瑞MT clpp-1 茨加塔格加加加加格特加茨加 加特加特格加特加格加加
普普瑞MT 隆普-1 CGATGATGGCCTGTGGG CGCTTTGAAAATATT卡特卡特卡特茨卡特茨卡特
Cca
奥克斯施尔 格斯特-4 加特格格格格特格茨茨格茨格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格 CCGAATTGTTCCCCCGAC
奥克斯施尔 格斯特-6 CCGAATTGTTCCCCCGAC 特茨格加格特特加格
奥克斯施尔 格斯特-7 特茨格加格特特加格 TGGGTATCTGGGTTTG
奥克斯施尔 gcs-1 TGGGTATCTGGGTTTG ATGTTTGCCTCGATGTT
奥克斯施尔 skn-1 GGACAGAATAAAGG TCAGGACGTCAACAAGAC
奥克斯施尔 苏迪-3 格塔加格格格加塔加茨加格 GCGAGAGATTATGAC
奥克斯施尔 点-1 亚贸中心 卡CTCTCTCTCTCTCTCTTT
卡阿理事会
参考 pmp-3 TGGCCGATGTGTCGC 加加卡加萨加萨加加理事会
参考 Y45F10.4 CGAGAACCCGCGAATGTCGGA CGGTTGCCAGG加加加加茨
参考 sap-49 TGGCGGATCGTGTTCC ACGAGTCTCGTGTGTCCCA
参考 tba-1 TCAACTGCCCGCC TCCAAGC加加加委员会

表6:用于测量应激反应基因转录调的推荐基因靶点和引素对。

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Discussion

在这里,用荧光转录机和生理应激生存测定法来描述在C.elegans中询问细胞压力反应的方法。记者都利用GFP表达驱动下下游转录目标的促进器,该指标涉及细胞压力反应的转录因子。使用 hsp-4p::GFP由 XBP-1s 介导的 UPRER调制,hsp-6p::GFP由 ATFS-1 介导的 UPRMT控制,gst-4p::GFP在 SKN-1 介导的 OxSR 下,hsp16.2p:GFPhsp-70p::在HSF-1 介导的热冲击响应下控制 GFP。其他标准化转录记者见表3。这里介绍的所有转录记者都有广泛的动态范围,可以通过遗传扰动或接触引起压力的化学物质来强效。此外,这些记者都可以被被雇佣的推广人上游的抄录因素所压制。最后,每个转录报告器都与特定的生理应激生存测定配对,以提供激活或抑制特定应激反应影响的生理读出。

要成功地使用转录记者,必须确定每个记者的动态范围。由于介质、agar、环境环境等差异导致实验室到实验室之间的主要变异性,建议使用我们的建议作为基准,对每种药物或应力感应范式进行定位或应力诱导模式,以集中和定时。其次,确保动物健康、正确同步至关重要。经历过某种压力的动物(如饥饿、长期暴露在光线下、暴露于高温等)应在实验前恢复几代。使用第 2 节中概述的方法可以实现正确的同步,因为在老化过程中,多个应力响应具有不同的激活级别,因此这一点至关重要。最后,映像协议对于标准化至关重要,因为存在各种影响图像和数据质量的事情。例如,应尽量减少动物在氧化钠中的持续时间,因为这给动物造成压力,并可能影响报告信号。此外,应正确设置显微镜和生物分拣器规格,以最大化信噪比和动态范围,而不会造成饱和。饱和像素在样品定量分析中会引起主要问题,因为最大荧光信号可能严重低估。

虽然这里描述的转录记者提供了一种强大和有效的方法来测量压力反应的激活,但关键是要了解它是已知转录因子的单一基因靶点。因此,虽然它作为大规模屏幕或兴趣菌株的第一次测试的可靠方法,但应执行适当的验证。我们建议执行qPCR测量在诱导每个受激反应被测定后激活的几个规范靶基因。建议的基因靶点列表见表6。此外,通过RNA-seq的转录图谱分析是一次更广泛地观察对多个转录目标的影响的另一种选择。特别值得注意的是,荧光记者的成像提供了有关受扰动影响组织的空间信息。此类信息不能从 qRT-PCR 或 RNA-seq 获得,因为它使用全蠕虫提取物,除非使用 scRNA-seq、FISH 和组织特定的 RNAAseq 协议47。最后,这些压力报告者通常被描述为特定于他们的压力反应机制。然而,重要的是要记住,并非所有的应力响应范式都是独特和独特的。例如,ER应力可以激活OxSR,反之亦然48,热冲击反应和ER应力反应之间的重叠通常被发现49。这些只是交叉交流和压力反应重叠文献中的几个例子,因此必须了解,所有测定也应经过特殊性测试,得出最终结论。

所述方法的另一个限制是,通过生物分拣机进行成像和定量的吞吐量有限。虽然生物分拣机定量可以在96孔板中进行,以更高的吞吐量,但它仍然受到将蠕虫转移到溶液的必要性的限制,而成像则受到研究者制备蠕虫和执行显微镜的能力的限制。因此,大型屏幕很可能只涉及荧光报告信号的视觉筛选,只有点击被图像和量化。

使用这些荧光报告器的一个重要警告是,激活或抑制压力反应并不总是有助于生理上有意义的表型,或可能反映其他全球影响(例如,蛋白质合成的减少)。因此,每个转录记者都配对一种测定压力生存的方法。建议对普普森电子百草枯生存测定、普高珠MT和OxSR进行图尼卡霉素生存测定,并在高温下进行热休克反应。虽然这些测试通常健壮、快速和简单,但它们需要密集的体力劳动,因此可扩展性受到严重限制。此外,几乎所有热耐受性测定发布至今都有重大变异性,使得大量复制几乎是必不可少的21。虽然图尼卡霉素和百草枯生存测定没有遭受这种缺乏可重复性的影响,但它们有他们自己的挑战,包括大量的实际劳动和协议的持续时间。随着新技术在自动化寿命和生存测定中诞生,这些压力生存测定很可能也可能成为高通量50。然而,在这些自动测定成为标准之前,生存测定目前仅限于验证在改变应激反应活动动力学的生理后果。

除了这里描述的压力生存测定之外,还有许多其他方法来测量动物的生理。例如,商业上可用的海马XFp分析仪可以监测细胞呼吸,这提供了额外的机械洞察力51。转录记者的另一种选择是使用核本地化的荧光标记转录因子。该技术有许多变体,但此处描述的方法特别感兴趣:HSF-1::GFP用于热冲击响应52、UPRMT53的DVE-1::GFP和DAF-16::GFP和SKN-1:GFP为OxSR54,55,55。最后,可以直接询问特定感兴趣的器官的形态。例如,线粒体形态学可以通过利用线粒体基质的荧光波,使用线粒体定位序列56来可视化。ER形态可以通过利用荧光波,通过信号序列融合到N-terminus和HDEL熔融到C-terminus57或GFP熔融到ER膜蛋白58。最后,行为性细胞骨骼完整性可用作HSF-1下游热应力灵敏度的代理。作用性细胞骨架受HSF-1的转录靶点调节,特别是在老化和热应力期间,因此可以可视化行为因子组织,以确定HSF-1和与热相关的应力59、60,60的功能读出。

这里描述的所有方法都可以独立使用或相互结合,以全面分析感兴趣的基因或药物及其对压力反应的影响。大型屏幕可以使用高通量转录记者检测进行,二级屏幕可对这些记者进行定量分析。一旦确定了更多可管理的候选基因/药物列表,就可以进行生理检测,以确定那些对整个动物生理学有直接影响的候选者。上面建议的其他方法也可以用作验证或进一步调查。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

R.BZ得到EMBO长期奖学金和拉里·希尔布洛姆基金会的支持。R.H.S 通过国家老龄研究所 (NIA) 和格伦医学研究基金会博士后奖学金获得 5F32AG032023-02 的资助。A.F. 通过 NIA 获得授予 F32AG051355 的支持。H.K.G. 通过国家科学基金会研究生研究奖学金计划获得 DGE1752814 资助。M.G.M. 支持 1F31AG060660-01 通过 NIA。A.D. 由托马斯和斯塔西·西贝尔基金会、霍华德·休斯医学研究所以及 4R01AG042679-04 和 5R01AG055891-02 支持,以及来自 NIEHS 的 5R01ES021667-09。我们感谢拉里·乔、梅丽莎·桑切斯、纳梅·凯莱特和阿内尔·埃斯奎维尔提供的重要技术援助。我们感谢森本实验室和CGC(由NIH研究基础设施项目P40 OD010440资助)菌株。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

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References

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