트레 Recombinase의 분자 진화

Biology

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Summary

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다. 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 분자 수술과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

여기 우리는 감독, 분자 진화를 통해 트레 recombinase의 생성을보고. 트레 recombinase는 감염된 인간의 세포에서 provirus의 절단 및 박멸 그 결과, HIV - 1 provirus의 LTR 시퀀스 내에서 미리 정의된 대상 시퀀스를 인식합니다.

우리는 Cre 호텔, loxP로 알려진 34 - BP 더블 좌초된 DNA 시퀀스를 인식 38 KDA의 recombinase와 시작했다. Cre 호텔 효과적으로 게놈 시퀀스를 없앨 수 있기 때문에, 우리는 맞게하기 위해 통합 HIV - 1 provirus의 5' - LTR과 3' - LTR 사이의 순서를 제거할 수있는 recombinase를 설정합니다. 첫 단계로서 우리는 loxP 재조합과 유사하고 활동에 대한 검사를했던 LTR 사이트 내에서 시퀀스를 식별. 처음 Cre 호텔 및 mutagenized Cre 호텔 라이브러리는 HIV - 1 provirus의 선택 loxLTR 사이트를 재결합에 실패했습니다. 어떤 감독 분자 진화 과정의 시작은 적어도 잔류 활동을 필요로 원래의 비대칭 loxLTR 시퀀스는 하위 집합으로 분할 및 재조합 활동을 위해 다시 테스트되었습니다. 중간체 역할, 재조합 활동은 하위 집합으로 표시되었다. 다음 recombinase 라이브러리 되풀이하는 진화 사이클을 통해 풍부하게되었습니다. 이후, 풍부한 라이브러리가 단행하고 recombined했다. 다른 변이의 조합 시너지 입증하고 recombinases는 그 loxLTR1 및 loxLTR2를 재결합하는 수있었습니다 만들어졌습니다. 이 중간체를 통해 진화 전략은 성공할 수있다는 증거했습니다. 126 진화 사이클 총 후에 개인 recombinases은 기능과 구조적으로 분석했다. 가장 활성화된 recombinase - 트레은 - Cre 호텔에 비해 19 아미노산을 변경했다. 트레 recombinase는 소비세 게놈 HIV - 1 감염 헬라 세포 (참조 "진화 Recombinase을 사용하여 HIV - 1 Proviral의 DNA 절단"Hauber J., 실험 바이러스학 및 면역학에 대한 하인리히 - Pette - 연구소에서 HIV - 1 provirus을 수있었습니다 함부르크, 독일). 아직 초기에있는 동안, 감독 분자 진화는 "분자 수술"과 분자 의학의 도구가 될 것입니다 정의 효소의 생성을 허용합니다.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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