トレリコンビナーゼの分子進化

Biology

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Summary

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化、分子手術と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。

我々は、Cre、loxP部位として知られている34 - bpの二本鎖DNA配列を認識する38 kDaのリコンビナーゼ、作業を開始しています。 Creを効果的にゲノム配列を排除することができますので、調整に統合されたHIV - 1プロウイルスの5' - LTRと3' - LTRの間にシーケンスを削除することができるリコンビナーゼを設定します。最初のステップとして、我々はloxP部位に類似し、組換えの活性について試験したLTRサイト内の配列を同定した。当初のCreと変異誘発CREのライブラリは、HIV - 1プロウイルスの選ばれたloxLTRサイトを再結合に失敗しました。どんな指示分子進化のプロセスの開始が、少なくとも残存活性を必要とするため、オリジナルの非対称loxLTRシーケンスはサブセットに分割し、再結合活性を再び検査した。中間体として機能する、組換え活性は、サブセットで示された。次に、リコンビナーゼのライブラリが何度も繰り返され進化のサイクルによって濃縮した。その後、濃縮されたライブラリがシャッフルし、再結合されました。さまざまな変異の組み合わせは、相乗証明とリコンビナーゼはloxLTR1とloxLTR2を再結合することができたが作成されました。これにより、中間体を介して進化戦略が成功を収めることができるという証拠だ。 126進化のサイクルの合計した後、個々のリコンビナーゼは、機能的及び構造的に分析した。最もアクティブなリコンビナーゼ - トレは - のCreと比較して19個のアミノ酸の変化がありました。トレリコンビナーゼは、消費税ゲノムHIV - 1感染HeLa細胞(参照してください"進化リコンビナーゼを用いたHIV - 1プロウイルスDNAの切り出し"、Hauber J.、実験的ウイルス学と免疫学のためのハインリヒ- Pette研究所、からHIV - 1プロウイルスをすることができたハンブルク、ドイツ)。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化は、"分子手術"と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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