Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen. Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zal dienen als instrument van de moleculaire chirurgie en moleculaire geneeskunde.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen.

We zijn begonnen met Cre, een 38-kDa recombinase, dat een 34-bp double-stranded DNA-sequentie bekend als loxP herkent. Omdat Cre kan effectief elimineren genomische sequenties hebben we besloten om op maat een recombinase dat de sequentie tussen de 5'-en 3'-LTR LTR van een geïntegreerde HIV-1 provirus kon verwijderen. Als eerste stap die we geïdentificeerd sequenties in de LTR sites die vergelijkbaar waren met loxP en getest voor recombinatie activiteit. Aanvankelijk Cre en gemutageniseerd Cre bibliotheken niet aan de gekozen loxLTR sites van de HIV-1 provirus recombineren. Als het begin van een gerichte moleculaire evolutie-proces vereist ten minste restactiviteit, werden de oorspronkelijke asymmetrische loxLTR sequenties te splitsen in subgroepen en opnieuw worden getest voor recombinatie activiteit. Optreden als tussenproducten, was recombinatie activiteit getoond met de subsets. Vervolgens recombinase bibliotheken werden verrijkt door herhalend evolutie cycli. Vervolgens werden verrijkt bibliotheken geschud en opnieuw gecombineerd. De combinatie van verschillende mutaties bleek synergetische en recombinases werden gecreëerd die in staat waren om loxLTR1 en loxLTR2 recombineren. Dit was het bewijs dat een evolutionaire strategie door middel van tussenproducten succesvol kan zijn. Na een totaal van 126 cycli evolutie individuele recombinases waren functioneel en structureel geanalyseerd. De meest actieve recombinase - Tre - had 19 aminozuur veranderingen ten opzichte van Cre. Tre recombinase was in staat om accijnzen van de HIV-1 provirus van het genoom HIV-1 geïnfecteerde HeLa cellen (zie "HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Instituut voor Experimentele Virologie en Immunologie, Hamburg, Duitsland). Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zullen dienen als instrumenten van "moleculaire chirurgie" en moleculaire geneeskunde.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics