Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Biology

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Summary

Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen. Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der molekularen Chirurgie und Molekulare Medizin dienen.

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen.

Wir begannen mit Cre, ein 38-kDa-Rekombinase, dass ein 34-bp doppelsträngige DNA-Sequenz als loxP bekannt erkennt. Da Cre effektiv beseitigen kann genomischen Sequenzen, machten wir uns auf maßgeschneiderte Rekombinase, dass die Sequenz zwischen der 5'-LTR und 3'-LTR eines integrierten HIV-1 Provirus entfernen konnte. In einem ersten Schritt haben wir identifizierten Sequenzen innerhalb des LTR Sites, die ähnlich loxP und getestet für die Rekombination Aktivität wurden. Zunächst Cre und mutagenisierten Cre-Bibliotheken nicht auf die gewählte loxLTR Seiten des HIV-1 Provirus rekombinieren. Da der Start einer gerichteten molekularen Evolution Prozess erfordert mindestens Restaktivität wurden die ursprünglichen asymmetrischen loxLTR-Sequenzen in zwei Teilmengen und erneut geprüft für die Rekombination Aktivität. Als Zwischenprodukte, war Rekombination Aktivität mit der Teilmengen gezeigt. Als nächstes Rekombinase-Bibliotheken wurden durch reiterative Evolution Zyklen bereichert. Anschließend wurden angereichert Bibliotheken gemischt und neu kombiniert. Die Kombination verschiedener Mutationen nachgewiesen synergistische und Rekombinasen entstanden, die konnten loxLTR1 und loxLTR2 rekombinieren. Das war Beweis dafür, dass eine evolutionäre Strategie durch Zwischenprodukte erfolgreich sein kann. Nach insgesamt 126 Evolution Zyklen einzelner Rekombinasen waren funktionell und strukturell analysiert. Die aktivsten Rekombinase - Tre - hatten 19 Aminosäure-Veränderungen zu Cre verglichen. Tre-Rekombinase konnte Verbrauchsteuern der HIV-1-Provirus aus dem Genom von HIV-1-infizierten HeLa-Zellen (siehe "HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle Virologie und Immunologie, Hamburg, Deutschland). Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der "molecular surgery" und molekulare Medizin dienen.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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