Molekylär evolution av Tre Recombinase

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här rapporterar vi generationen av Tre recombinase genom riktade, molekylär evolution. Tre recombinase känner igen en på förhand definierad målgrupp sekvens inom LTR sekvenser av HIV-1 provirussekvenser, vilket resulterar i excision och utrotning av provirussekvenser från infekterade mänskliga celler. Medan han fortfarande i sin linda, kommer riktad molekylär evolution möjliggöra skapandet av anpassade enzymer som kommer att fungera som verktyg för molekylär kirurgi och molekylär medicin.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Här rapporterar vi generationen av Tre recombinase genom riktade, molekylär evolution. Tre recombinase känner igen en på förhand definierad målgrupp sekvens inom LTR sekvenser av HIV-1 provirussekvenser, vilket resulterar i excision och utrotning av provirussekvenser från infekterade mänskliga celler.

Vi började med CRE, en 38-kDa recombinase, som erkänner en 34-bp dubbelsträngat DNA-sekvens som kallas loxP. Eftersom Cre effektivt kan eliminera genomiska sekvenser, satte vi ut för att skräddarsy en recombinase som kunde ta bort sekvensen mellan 5'-LTR och 3'-LTR av ett integrerat HIV-1 provirussekvenser. Som ett första steg har vi identifierat sekvenser inom LTR webbplatser som liknade loxP och testas för rekombination aktivitet. Inledningsvis Cre och mutagenized Cre biblioteken misslyckats med att kombinera det valda loxLTR platser i HIV-1 provirussekvenser. Som början på något riktad molekylär evolution processen kräver minst restaktiviteten var de ursprungliga asymmetriska loxLTR sekvenser delas in i undergrupper och testas igen för rekombination aktivitet. Agerar som intermediärer, var rekombination aktivitet visas med delmängder. Därefter recombinase biblioteken var berikas genom UPPREPANDE evolutionen cykler. Därefter berikades bibliotek blandas och modifierat. Kombinationen av olika mutationer visade synergieffekter och recombinases skapades som kunde kombinera loxLTR1 och loxLTR2. Detta var bevis för att en evolutionär strategi genom intermediärer kan vara framgångsrika. Efter totalt 126 evolutionen cykler enskilda recombinases var funktionellt och strukturellt analyseras. De mest aktiva recombinase - Tre - hade 19 aminosyra förändringar i förhållande till Cre. Tre recombinase kunde punktskatter HIV-1 provirussekvenser från genomet HIV-1 infekterade HeLa celler (se "hiv-1 proviral DNA Excision Använda en Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-institutet för experimentell virologi och immunologi, Hamburg, Tyskland). Medan han fortfarande i sin linda, kommer riktad molekylär evolution möjliggöra skapandet av anpassade enzymer som kommer att fungera som verktyg för "molekylär kirurgi" och molekylär medicin.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics