Tre Recombinase के आण्विक विकास

Biology

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Summary

यहाँ हम निर्देशित आणविक विकास के माध्यम से Tre recombinase की पीढ़ी की रिपोर्ट. Tre recombinase एचआईवी-1 provirus की लीटर दृश्यों के भीतर एक पूर्व निर्धारित अनुक्रम लक्ष्य पहचानता है, छांटना और संक्रमित मानव कोशिकाओं से provirus के उन्मूलन में जिसके परिणामस्वरूप. जबकि अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में, निर्देशित आणविक विकास कस्टम एंजाइमों कि आणविक सर्जरी और आण्विक चिकित्सा के उपकरण के रूप में सेवा करेंगे के निर्माण की अनुमति देगा.

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

यहाँ हम निर्देशित आणविक विकास के माध्यम से Tre recombinase की पीढ़ी की रिपोर्ट. Tre recombinase एचआईवी-1 provirus की लीटर दृश्यों के भीतर एक पूर्व निर्धारित अनुक्रम लक्ष्य पहचानता है, छांटना और संक्रमित मानव कोशिकाओं से provirus के उन्मूलन में जिसके परिणामस्वरूप.

हम Cre, एक 38 केडीए recombinase कि 34 बीपी loxP रूप में जाना जाता है डबल असहाय डीएनए अनुक्रम को मान्यता के साथ शुरू कर दिया. क्योंकि Cre प्रभावी ढंग से जीनोमिक दृश्यों को समाप्त कर सकते हैं, हम दर्जी के लिए एक recombinase कि 5'-लीटर और एक एकीकृत provirus एचआईवी -1 के 3'-लीटर के बीच अनुक्रम निकाल सकता है. एक पहला कदम के रूप में हम लीटर साइटों कि loxP के लिए समान और पुनर्संयोजन गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया के भीतर दृश्यों की पहचान की. शुरू Cre और mutagenized Cre पुस्तकालयों एचआईवी-1 provirus के लिए चुना loxLTR साइटों recombine करने में विफल रहा है. किसी भी निर्देशित आणविक विकास की प्रक्रिया के शुरू के रूप में कम से कम अवशिष्ट गतिविधि की आवश्यकता है, मूल असममित loxLTR दृश्यों सबसेट में विभाजित किया गया और पुनर्संयोजन गतिविधि के लिए फिर से परीक्षण किया. मध्यवर्ती के रूप में अभिनय, पुनर्संयोजन गतिविधि सबसेट के साथ दिखाया गया था. अगला, recombinase पुस्तकालयों बार बार दुहरानेवाला विकास चक्र के माध्यम से समृद्ध किया गया. बाद में, समृद्ध पुस्तकालयों shuffled थे और recombined. विभिन्न म्यूटेशनों के संयोजन synergistic साबित और recombinases बनाया गया है कि loxLTR1 और loxLTR2 recombine करने में सक्षम थे. यह सबूत है कि मध्यवर्ती के माध्यम से एक विकासवादी रणनीति सफल हो सकते हैं. कुल 126 विकास चक्र के एक व्यक्ति recombinases के बाद कार्यात्मक और structurally विश्लेषण किया गया. सबसे सक्रिय recombinase - Tre - 19 एमिनो एसिड परिवर्तन किया था Cre की तुलना. Tre recombinase जीनोम एचआईवी -1 संक्रमित HELA कोशिकाओं (देखें "एचआईवी-1 Proviral डीएनए एक विकसित Recombinase का उपयोग छांटना", Hauber जे, प्रायोगिक विषाणु विज्ञान और इम्यूनोलॉजी के लिए हेनरिक Pette संस्थान से एचआईवी -1 provirus आबकारी करने में सक्षम था हैम्बर्ग, जर्मनी). जबकि अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में, निर्देशित आणविक विकास कस्टम एंजाइमों कि "आणविक सर्जरी" और आण्विक चिकित्सा के उपकरण के रूप में सेवा करेंगे के निर्माण की अनुमति देगा.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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