Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

En enkel och tillförlitlig metod beskrivs här för att analysera en uppsättning funktioner NK cell såsom degranulering, cytokin och kemokin produktion inom olika NK cellundergrupper.

Introduction

Som en del av det medfödda immunförsvaret naturliga mördarceller (NK-celler) bidrar till den första försvarslinjen mot virusinfekterade eller malignt transformerade celler. Ett system av hämmande och aktiverande receptorer gör det möjligt att skilja mellan friska och transformerade celler utan föregående antigen priming i motsats till T-celler. Vid målcellen möter NK-celler frigör innehållet i sina cytotoxiska granuler (t.ex. perforin, granzymes) in i den immun synapsen för att döda deras mål. Dessutom NK-celler producerar och utsöndrar olika cytokiner (t.ex. interferon-y: IFN-γ; tumörnekrosfaktor-α: TNF-α) och kemokiner (t.ex., makrofaginflammatoriskt protein-1β: MIP-1 p) vid målcell interaktion eller cytokinstimulering 1.

Tillräckliga funktioner NK cell såsom cytotoxicitet, kemokin och cytokinproduktion har en stor inverkan på öde olika dislättar. Leukemipatienter visar ökad återfall om de uppvisar en defekt NK-celler profil vid diagnos består av minskad produktion IFN-γ och minskat uttryck att aktivera NK cellreceptorer 2. En tidig återhämtning av NK cell nummer och funktion inklusive cytokinproduktion vid interaktion målcell är förknippad med en minskad återfall och förbättrad överlevnad hos patienter som får allogen stamcellstransplantation 3. Dessutom vid initiering av interferonbehandling hos patienter hepatit C-virusinfekterade degranulering kapacitet perifera NK-celler är starkare i tidiga responders än hos icke-responders 4. Nummer NK-celler (> 80 / l) på dag 15 efter autolog stamcellstransplantation (autoSCT) hos patienter som lider av lymfom eller multipelt myelom är prediktiva för en förbättrad progressionsfri och total överlevnad fem. I melanompatienter uttrycket av T-cell immunoglobulin- och mucin-domän-containing molekyl-3 (TIM-3), ett immunreglerande protein på NK-celler, korrelerar med sjukdomsstadium och prognos 6.

Forskare har följt NK cellfunktioner under de senaste decennierna. Den inledande analysen av NK cytotoxicitet mot tumörceller utan föregående priming riktades med hjälp av en 51 Cr-frisättningsanalys 7. Mer nyligen, forskare utvecklat en icke-radioaktiv metod för att utvärdera cytotoxiciteten av expanderade NK-celler 8. Cytokin och kemokin produktion har ofta utvärderas med hjälp av enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) tekniker 9,10. Under de senaste decennierna dessa metoder har kompletterats med flödescytometri-baserade analyser. Användningen av proteinhämmare transport (t.ex. Brefeldin A och monensin) och cell permeabilization metoder i kombination med konventionell ytfärgning protokoll har gjort det möjligt för forskare att studera kemokin och cytokinproduktion i olika specifika lymfaocyte grupper (t.ex. T, B eller NK-celler) 11. Dessutom har olika flödes cytometry baserade analyser utvecklats för att övervaka T och NK-cell cytotoxicitet. År 2004 beskrev Alter et al. Ytan uttryck av lysosomen-associerat protein CD107a (Lampa 1) på NK-celler på målcell möter som en markör för degranulering av cytotoxiska granuler 12. Eftersom ett stort antal olika fluorokromer och flerkanaliga flödescytometrar finns i våra dagar har det blivit möjligt att samtidigt övervaka olika NK cellfunktioner (cytotoxicitet, cytokin och kemokin produktion) i olika NK cellgrupper. Detta blir särskilt viktigt i situationer där provstorleken är begränsad, till exempel, i biopsier eller blodprover från patienter som lider av leukopeni.

För att testa globala NK cellfunktioner kan olika flödescytometri baserade analyser effektivt kombineras. Theorell et al. Stimulerade NK-celler från healthy donatorer med tumörcellinjen K562 och analyserades NK-cell degranulering, inifrån och ut-signal och kemokinproduktion via flödescytometri 13. Nyligen NK cellgrupper, fenotyper och funktioner i tumörpatienter under autoSCT analyserades med flödescytometri-baserade analyser. Det visades att NK-celler kunde degranulate och producera cytokiner / kemokiner vid tumörcelligenkänning i mycket tidiga tidpunkter efter autoSCT 11.

Här ett protokoll beskrivs att utvärdera NK cellfunktioner vid interaktion med tumörceller inkluderande degranulering kapacitet, kemokin och cytokinproduktion med användning av en flödescytometri-baserad analys som gör det möjligt att övervaka NK cellfunktioner i olika undergrupper samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med rekommendationerna från lokala etiska kommittén vid universitetet i Frankfurt.

1. Odling av K562-celler

  1. Kultur K562-celler i R10 media (RPMI1640 med glutamin-medium, 1% penicillin / streptomycin, 10% fetalt kalvserum) vid en densitet av 0,5-1 x 10 6 celler per ml i en cellkultur kolv vid 37 ° C och 5% CO 2.
  2. Harvest K562-celler 24 h före starten av ett nytt experiment.
    1. Avlägsna cellkulturflaska innehållande K562-celler från inkubatorn. Återsuspendera de K562-celler inom odlingsmedia genom att försiktigt pipettera upp och ner.
    2. Överför odlingsmedia innehållande K562-celler i en 15 eller 50 ml rör och pelletera cellerna vid 400 xg under 8 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml R10 media och blanda väl.
    3. Överföring 20 pl av cellen lösningen in i en brunn i en 96-U-brunnar. Tillsätt 20 ^ il trypanblått ochBlanda väl genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger. Pipettera 10 | il av lösningen i en cell räknekammare och räkna cellerna.
    4. Pelletera cellerna vid 400 xg under 8 minuter. Återsuspendera cellerna i R10 medier och justera cellkoncentrationen K562 till 0,5-1 x 10 6 celler per ml.
    5. Inkubera K562-celler i en cellkultur kolv vid 37 ° C och 5% CO2 tills de användes.

2. Isolering av NK-celler

  1. Enligt godkännande och riktlinjer för lokala etiska kommittén, få en skriftlig informerat samtycke från frisk donator eller patienten före insamlingen av 6-10 ml av antingen EDTA eller hepariniserat perifert blod.
  2. Förvara reagenser för NK cellisolering vid 4 ° C fram till början av experimentet och sedan använda dem vid rumstemperatur (RT) under sterila förhållanden. Isolera NK-celler från perifert blod med hjälp av magnetiska mikropärlor och en specifik magnet för cellisolering enligt tHan tillverkarens anvisningar.
    1. Lös upp en flaska av den frystorkade NK-celler negativ isolering antikropp cocktail genom att pipettera 7,5 ml av den medföljande buffert A (ingår i NK-cellisoleringskit) i flaskan. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
      OBS: Se till att suspensionen är homogen före varje användning.
    2. Förbered slutliga cocktail lösning genom att blanda lämpliga volymer av den färdigberedda pelleten från steg 2.2.1 och buffert B (ingår i NK-cellisoleringskit). För att bestämma dessa volymer, definiera volymen av helblodprovet i ml som volym = 1,0. Använd 0,25 volymer av den färdigberedda pellet (från steg 2.2.1) och 0,25 volymer buffert B för att behandla en volym av helblod.
    3. Överför blandningen till en lämplig rör innehållande helblodprovet. Pipettera ej upp och ned för att undvika förlust av blod inuti pipetten. Istället, förslut röret och flytta den försiktigt upp och ner tills uppskovsionen är homogen. Inte virvel.
    4. Ytterligare homogenisera provet med användning av ett rör rotator under 5 min vid RT.
    5. Under sterila betingelser, ta bort locket och placera röret i den magnetiska separatorn under 15 minuter såsom rekommenderas av tillverkaren. Se till att röret etiketter vänd mot baksidan av magneten för att möjliggöra ostörd synlighet separationslinjen. Flytta inte magneten under separation, eftersom detta förfarande skulle störas.
    6. Försiktigt överföra supernatanten till ett nytt 15 ml rör och fyll upp med komplett medium (CM, hematopoetisk cellmedia, 1% penicillin / streptomycin, 5% humant serum). Pelletera cellerna vid 400 xg under 8 minuter.
      1. Valfritt: Om pelleten är röd, återsuspendera cellerna i 1 ml erytrocyt lyseringsbuffert (t.ex., 1 ml av en ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffert: 155 mM NH4CI, 0,1 mM EDTA; 10 mM KHCO3 i 1 L destillerat vatten (DW)) och inkubera under 8 min vid rumstemperatur. Alternativt kan du använda en LANythrocyte utarmning kit.
        OBS: Tänk på att användningen av ACK buffert kan påverka negativt NK cellfunktioner 14.
      2. Snabbt späda ut ACK-buffert genom att tillsätta åtminstone 1 ml av CM för att stoppa lys och centrifugera vid 400 xg under 8 minuter för att pelletera cellerna.
    7. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml CM och fortsätt med att räkna. Överföra 20 | il av NK-cell lösningen på en 96-U-brunnar. Tillsätt 20 | il av metylen blå till varje brunn och blanda väl genom att pipettera upp och ner under minst 5 gånger. Pipett 10 ul av lösningen i en cell räknekammare och räkna celler. Alternativt kan du använda 30 pl outspädd cellsuspensionen för att räkna med ett kommersiellt tillgängligt cellräknare.
    8. Justera cellerna till en koncentration av åtminstone 2 x 10 4 NK-celler per 100 | il CM.
    9. Utföra en yta antikroppsfärgning av den isolerade NK-cellpopulationen för att kontrollera renheten med användning av en flödescytometer.
      1. prepare en masterblandning lösning genom blandning av volymerna av de angivna antikropparna enligt tabell 1.
      2. Återsuspendera cellerna i 88,5 pl tvättbuffert (WB, 0,5% bovinserumalbumin (BSA), 0,1% NaN3 i PBS) och tillsätt 11,5 l av Master Mix lösning. Inkubera cellerna i 20 minuter vid 4 ° C i mörker.
        Varning: NaN3 är giftig och mutagen. Hantera det följaktligen till motsvarande säkerhetsdatabladet (MSDS).
      3. Tillsätt 1 ml WB och pelletera cellerna vid 400 xg under 4 minuter.
      4. Återsuspendera cellerna i 300 pl färgningsbuffert plus DAPI. Förvärva de celler med användning av en flödescytometer.
        OBS: Fortsätt vidare med försöket endast om NK-cell renhet är åtminstone 80% av alla levande lymfocyter.

3. Skörd av K562-celler för NK cellstimulering

  1. Ta cellodlingskolv innehållande K562-celler (från steg 1,2) från th e inkubator. Återsuspendera de K562-celler inom odlingsmedia genom att försiktigt pipettera upp och ner.
  2. Överför hela odlingsmedier i en 15 eller 50 ml rör och pellets cellerna vid 400 xg under 8 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och blanda väl.
  3. Överföring 20 pl av cellen lösningen in i en brunn i en 96-U-brunnar. Tillsätt 20 l trypan blå och blanda väl genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger. Pipettera 10 | il av lösningen i en cell räknekammare och räkna cellerna. Alternativt kan du använda 30 pl outspädd cellsuspensionen räkna med ett kommersiellt tillgängligt cellräknare.
  4. Pelletera cellerna vid 400 xg under 8 minuter. Återsuspendera celler i CM i en koncentration av åtminstone 2 x 10 4 K562 celler per 100 | il medium.
    OBS: Använd samma K562 och NK cellkoncentrationer för att inkubera både på en effektor: mål (E: T) -förhållande av 1: 1 senare.
"> 4. Stimulering av NK-celler med tumörcellinjen K562 och Cytokiner

  1. Blanda försiktigt cellerna genom pipettering upp dem och ned under minst 5 gånger. Fördela 100 fil / brunn av NK-cell lösningen i de erforderliga brunnar i en 96-V-brunnar.
    1. Använd minst två brunnar för varje donator, en med och en utan en stimulus (t.ex., K562 tumörceller och cytokiner). När det är möjligt, utföra experiment minst två gånger och tillsätt en positiv kontroll (t.ex. forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och jonomycin, slutlig koncentration: 50 nM PMA, 1 ^ M jonomycin per brunn). Förbered uppdaterad flödescytometri kompensation för dagen för experimentet.
      OBS: Titrera antikropparna före användning (se diskussion).
  2. Släck ljuset och lägg anti-CD107a antikropp (2 | il, slutkoncentration: 1: 100) till varje brunn med NK-celler på 96-V-brunnar.
  3. Blanda försiktigt K562-celler genom att pipettera dem upp och ner underminst 5 gånger.
    1. Från brunnarna innehåller NK-celler / anti-CD107a antikroppslösningen identifiera de planerade för stimulering med K562-celler. Tillsätt 100 | il / brunn av K562-cell lösningen i dessa brunnar. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger.
    2. Lägg interleukin-2 (IL-2; slutkoncentration 100 U / ml) och interleukin-15 (IL-15; slutlig koncentration 10 ng / ml) till brunnarna innehållande K562-celler och NK-cell / anti-CD107a antikroppslösningen.
      1. Valfritt: Testa effekten av antingen K562-celler eller cytokiner ensam på de utdelade NK-celler att dechiffrera tumörinducerad mot cytokin-inducerad NK cellfunktioner.
    3. Identifiera brunnarna på 96-V-brunnar planeras som negativa kontroller utan stimulans. Tillsätt 100 l / brunn CM till dessa brunnar innehållande endast NK cell / anti-CD107a antikroppslösningen. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger.
      1. Valfritt: För en positiv kontroll, tillsätt 100 μ; L CM innehållande PMA och jonomycin (slutlig koncentration: 50 nM PMA, 1 ^ M jonomycin per brunn) till en brunn med NK-celler / anti-CD107a antikroppslösningen.
  4. Inkubera cellerna i 3 timmar i mörker vid 37 ° C och 5% CO2.
  5. Bered en inhibitor lösning proteintransporten (t.ex. brefeldin A och / eller monensin) i CM. Efter 1 h av inkubation, tillsätta lösningen till varje brunn i 96-V-brunnar med ljuset avstängd (slutkoncentration: 0.5-1μM brefeldin A och 2-3 pM monensin). Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned under minst 5 gånger. Fortsätta inkubationen för resterande två timmar.

5. Yt- och intracellulär färgning

  1. Efter 3 h inkubationsperiod, blanda cellerna i brunnarna i 96-V-brunnar noggrant genom att pipettera upp och ner under minst 5 gånger och överföra dem till flödescytometri rör. Tillsätt 1 ml / rör av WB. Pellets celler vid 400 xg för 4 min.
    1. Valfritt: Före centrifugering skölj brunnarna med 100 | il / brunn PBS, för att optimera cellåtervinning, genom att pipettera upp och ner under minst 5 gånger innan överföring av cellerna in i respektive FACS-rör.
  2. Kasta bort supernatanten och Fortsätt med ytfärgning.
  3. Inkluderar en aminreaktiv fluorescerande färgämne som är icke-permeant att levande celler med ett emissionsmaximum på 423 nm som en fixerbar döda cellmarkör (DCM). Utför färgningen före (se nedan) eller parallellt med antikroppen ytfärgning beroende på typen av DCM användas.
    1. Återsuspendera celler i 99 | j, l / rör PBS och tillsätt 1 | j, l / rör av fixerbar DCM (slutkoncentration: 1: 100). Blanda cellerna väl med användning av en virvel och inkubera dem i 15 min vid RT i mörker.
    2. Förbered en masterblandning lösning genom att blanda ihop "ytan" antikroppar som anges i tabell 2 (se färgning steg kolumnen markerad med blått). Använd idicated volymer / rör och multiplicera dem med antalet flödescytometri rör som skall färgas.
    3. Efter inkubation ta flödescytometri rör med cellerna och tillsätt 1 ml / rör av WB. Pelletera cellerna vid 400 xg under 4 minuter.
    4. Kassera supernatanten, återsuspendera cellerna i 84 l / rör av WB och tillsätt 16 l / rör av Master Mix lösning. Blanda cellerna väl med hjälp av en virvel. Inkubera cellerna under 20 min vid 4 ° C i mörker.
    5. Efter 20 minuter tillsätt 1 ml / rör WB och pellets celler vid 400 xg under 4 min.
  4. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 ul / rör av en kall fixering lösning (t ex 2% (slutlig) paraformaldehyd eller formaldehyd). Blanda cellerna väl med hjälp av en virvel. Inkubera cellerna under 10 min vid 4 ° C i mörker.
    1. Färga cellerna för intracellulära cytokiner / kemokiner efter detta steg eller lagra dem över natten vid 4 ° C i WB.
      OBS: Efter inkubation över natten, kan en lägre cell återhämtning inträffar.
  5. Tvätta cellerna i 1 ml / rör WB vid 400 xg under 4 minuter och fortsätt med permeabilization steget.
  6. Förbered en permeabilization buffert (PB) (t.ex. 0,2% saponin, 1% BSA-lösning i PBS).
  7. Tvätta cellerna två gånger i 1 ml / rör av PB vid 400 xg under 4 minuter. Fortsätt med intracellulär färgning.
    Varning: Saponin är potentiellt irriterande. Hantera det följaktligen till motsvarande säkerhetsdatabladet (MSDS).
  8. Förbered en Master Mix lösning med hjälp av de angivna "intracellulära" volymer antikropps i tabell 2 (markerad i grönt). Multiplicera dessa volymer med antalet rör som skall färgas.
    1. Återsuspendera cellerna i 90 l / rör PB och tillämpa 10 l / rör av antikropps Master Mix lösning. Blanda väl med hjälp av en virvel och inkubera cellerna under 30 min vid 4 ° C i mörker.
  9. Tvätta cellerna två gånger i 1 ml / rör av PB vid 400 xg under 4 minuter.
  10. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 400 l / rör PB. Blanda cellerna väl med hjälp av en virvel. Placera celler på is i mörker tills mätningen.

6. Flödescytometri Ersättning och Acquisition

  1. Välj de kanaler för de olika fluorokromer (se tabell 2) inom flödescytometri förvärv programvara i parametrar mappen. Dessutom väljer kanalerna för FSC-A och -H samt för SSC-A och -H.
  2. Ladda en ersättning matris skapas för de valda parametrarna i förvärvs filen.
    1. Skapa en kompensationsmatris med användning av isolerade NK-celler från steg 2.2.8 genom att utföra en enda färg fläck för varje använd fluorokrom (se tabell 2). Använd ytan färgningsprotokollet beskrivs i steg 5,1-5,4. Inkludera en ofärgade kontroll (utan antikroppar) liksom isotypkontrollerna och / eller fluorescens minus en kontroller (FMO).
      OBS: Som ett alternativ till cellbaserad ersättning, använda IgG-bindande kulor som kontroller ersättning.
    2. Placera varje rör för enskilda fläckprov och provet utan antikroppar i provinjektionsport (SIP). Klicka på "record" knappen i flödescytometri förvärv programvara och skaffa ett cellantal på minst 5 x 10 3 NK celler per prov.
    3. Använd beräkningen ersättning tillämpningen av cytometri förvärv programvara för att skapa en ersättning matris.
  3. Skapa punktdiagram för att identifiera NK cellpopulationen.
    1. Identifiera enskilda celler med hjälp av FSC-A / FSC-H och SSC-A / SSC-H punktdiagram. Klicka på "polygon gate" -knappen. Rita en grind runt celler, som har en linjär fördelningsmönster i båda punktdiagrammen. Dubbelklicka på grindarna för att öppna en ny punktdiagram.
    2. Välj en FSC-A / SSC-ett punktdiagram för att identifiera lymfocyter/ NK cellpopulation (se figur 1). Rita en polygon grind runt den och dubbelklicka på porten.
  4. Placera varje provrör av NK-cellstimuleringsanalys i SIP. Klicka på "record" knappen och få en cell antal åtminstone 5 x 10 3 NK celler per prov.

7. Analys och statistik

  1. Öppna flödescytometrianalys programvara. Klicka på lastprovet för att öppna ostimulerade kontrollprovet.
  2. Skapa en grindsystem för de olika NK cellsubpopulationer (se figur 1).
    1. Klicka på punktdiagrammet knappen för att skapa en FSC-A / SSC-A tomt. Klicka på rektangeln gate knappen och rita en rektangel grind över alla händelser med en FSC-A värde> 5 x 10 4 för att utesluta skräp. Öppna porten genom att dubbelklicka på porten.
    2. Välj återigen FSC-A / SSC-A parametrar i den nya punktdiagram och klicka på polygon gate knappen. Draw en polygon grind runt lymfocytpopulationen (se figur 1). Öppna porten.
    3. Välj SSC-A / SSC-H-parametern för nya punktdiagram och rita en polygon grind runt alla enskilda celler. Enstaka celler visar en linjär fördelning över FSC-A / FSC-H och SSC-A / SSC-H parametrar (se figur 1). Öppna porten genom att dubbelklicka på den.
    4. Upprepa steg 7.2.3 med hjälp av FSC-A / FSC-H parametrar denna gång.
    5. Använd parameter CD45 och Dump kanal (CD3, CD14, CD19, DCM) för att utesluta döda celler. Rita en rektangel grind runt hela CD45 positiva och Dump kanal negativa celler. Öppna porten genom att dubbelklicka på porten.
    6. Identifiera hela NK cellpopulationen genom att använda CD56 och Dump kanalparametrar. Skapa en rektangel grind runt CD56 positiva och Dump kanal negativa celler. Öppna porten genom att dubbelklicka på den.
    7. Rita en rektangel grind runt alla tre NK cellgrupper inom en CD56 / CD16 punktdiagram. Idntify de olika undergrupper som CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + och CD56 + CD16 ++ NK cellgrupper.
  3. Analysera NK cellfunktioner för varje enskild NK-cell-subset.
    1. Klicka på en av de tre NK cell delmängd grindar för att öppna den. Skapa tre olika punktdiagram för CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ och CD56 / MIP-1β.
    2. Rita en rektangel grind för CD56 positiva celler, som är positiva såväl för CD107a, IFN-γ eller MIP-1β respektive (se figur 1).
    3. Upprepa steg 7.3.1-7.3.2 för varje återstående NK-cell-subset.
  4. Upprepa steg 7,2 och 7,3 för alla stimulerade prover. Spara alla statistiska värdet för varje enskilt prov genom att klicka på statistiken exporterande knapp inom analysprogram.
  5. Öppna filer som innehåller statistiska värdena för de enskilda prover för att analysera NK cellfunktioner. Välj de värden för enskilda NK-cellergrupper (t.ex. CD56 ++ CD16 - NK-celler) genom att kopiera dem till en annan fil.
    1. Subtrahera andelen CD107a positiva NK-celler, som inte har behandlats med en stimulans från andelen CD107a positiva NK-celler, som har behandlats med en stimulans.
      Anmärkning Använd resultatet att demonstrera degranulering kapaciteten hos denna speciella NK-cellunderuppsättning som svar på stimulus.
    2. Upprepa steg 7.5.1 för IFN-γ och MIP-1SS-positiva NK-celler för att demonstrera cytokin och kemokin produktion som svar på stimulus.
    3. Upprepa steg 7.5.1-7.5.2 för varje återstående NK cell delmängd för att utvärdera deras degranulering kapacitet och cytokin / kemokin produktion vid stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Grindningsstrategi för analys av degranulering, cytokin och kemokin produktion av hela NK-cellpopulationen och tre olika NK cellundergrupper illustreras i Figur 1.

Representativa resultat av en frisk donator illustreras i Figur 2. NK-celler utan någon stimulans producerade varken IFN-γ nor MIP-1β och uttryckte inte CD107a på sin yta (Figur 2A). I kontrast, NK-celler stimulerade med tumörceller och cytokiner producerade signifikanta mängder av intracellulär IFN-γ och MIP-1β. Dessutom degranulated över 20% av dem på tumörcellinteraktion anges genom att uttrycka CD107a på deras yta (figur 2C). PMA och Ionomycin stimulering användes som en kontroll (Figur 2B).

e en "src =" / filer / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
Figur 1:. Grind strategi Efterföljande grindar plottas. Först skräp utesluten i ett FSC-A / SSC-A tomt. Sedan lymfocyter identifieras och dubletter utesluts med hjälp av två tomter med SSC-A / SSC-H och FSC-A / FSC-H. Därefter en grind inklusive alla CD45 + celler och exklusive alla döda, CD3 +, CD14 + och CD19 + celler in genom att rita CD45 / Dump kanal. Därefter NK-celler identifieras genom gating på CD56 + celler. En tomt med CD56 / CD16 kan användas för att identifiera de viktigaste NK cellgrupper. Slutligen, inom hela NK-cellpopulationen, är funktionella markörer identifieras genom plottning CD56 kontra CD107a, IFN-γ och MIP-1β, respektive. Detta kan göras så bra för alla olika typer av NK-cellundergrupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 2:. Representativa resultat från en frisk NK-celldonator Använda grindningsstrategi som beskrivs i figur 1, NK-cell funktionella markörer såsom CD107a (för degranulering), IFN-γ och MIP-1β kan identifieras. Den vänstra kolumnen (A) visar resultaten med NK-celler i frånvaro av ett stimulus. Den mellersta kolumnen (B) visar resultaten i närvaro av den positiva kontrollen PMA / jonomycin. Den högra kolumnen (C) presenteras resultat NK-celler stimulerade med tumörcellinjen K562 och i närvaro av cytokinema IL-2 (100 U / ml) och IL-15 (10 ng / ml). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Tabell Tabell 1: Antikroppar för renhetskontroll.

tabell 2
Tabell 2: Antikroppar för extra- och intracellulär färgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det beskrivna förfarandet är ett enkelt, snabbt och pålitligt tillvägagångssätt för att studera NK cellfunktioner från helblod från friska givare eller patienter. Denna metod erbjuder den stora fördelen att direkt rena NK-celler från helblod, som man undviker den tidsödande densitetsgradientcentrifugering, som är obligatoriskt för många andra reningsmetoder 15. Dessutom kräver det ett mindre urval storlek jämfört med "klassiska" NK-celler isolering / anrikningsmetoder, vilket gör det till ett lämpligt alternativ för prover av barn och / eller immun-brist patienter. Detta protokoll kan användas för att erhålla basvärden NK cellfunktioner ex vivo, men det gör också att ytterligare NK kultur och expansion, som på detta sätt kompletterar med andra metoder som tidigare beskrivits 8. Ändå vissa kritiska steg måste tas med i beräkningen. Eftersom analysen är baserad på extra- och intracellulär antikroppsfärgning, är det viktigt att bestämma den optimala working koncentration för varje antikropp först. Speciellt för intracellulär färgning, är en noggrann utvärdering av de använda antikropparna rekommenderas. Ett bra tillvägagångssätt är att testa en utspädningsserie av den använda antikroppen (t.ex., 1: 100 till 1: 12,5) i en cellsuspension stimulerades med eller utan PMA / jonomycin. Därefter förhållandet mellan positiva händelser mellan stimulerade och un-stimulerade proverna beräknas och plottas. Antikroppen utspädning med den högsta positiva faldig förändring förhållande (bästa signal-till-bakgrundsförhållandet) bör användas för ytterligare experiment 16. Dessutom kan användningen av kontroller som isotype- och FMO kontroller visar sig vara grundläggande särskilt för intracellulär färgning för att gate korrekt på de positiva cellpopulationer.

Det finns dock några viktiga begränsningar av den beskrivna metoden. CD107a uttryck är en degranulering markör och därför endast indirekt visar NK cell cytotoxicitet. NK-cell cytotoxicitet ennd degranulering kapacitet kan vara annorlunda. Uppreglering av autophagy vägen i tumörceller resulterar i nedbrytningen av utsöndrat granzym B och minskar celldöd vid NK-cellinteraktion 17. Därför ytterligare DCM (t.ex. klyvs kaspas 3) kan läggas till färgning panelen för att övervaka celldödshändelser inom målceller 18. Dessutom är NK-cell cytotoxicitet påverkas av mängden av cytotoxiska proteiner inom deras granuler (t.ex. perforin, granzym B), som kan kvantifieras genom en intracellulär färgning 19,20.

Vidare finns det olika möjligheter att modifiera protokollet. I stället för isolerade NK-celler, kan perifera mononukleära blodceller (PBMC) användas. Även om man måste vara medveten om att det absoluta NK cellantalet i PBMC befolkningen skiljer sig åt mellan olika givare och även mellan prover från samma donator vid olika tidpunkter. NK-cell degranulation är mycket beroende av E: T-förhållande. För att jämföra NK cellfunktioner mellan olika givare eller vid olika tidpunkter, bör det absoluta NK-cellnummer inom PBMC-populationen användas för att upprätta en konstant E: T-förhållande i alla experiment. Om NK cellfunktioner övervakas vid olika tidpunkter inom samma donator kan PBMC frysas och analysen kan göras på en gång för alla olika tidpunkter för att minska inter-experimentella variationer 11.

Eftersom färgning paneler med upp till 18 färger är möjliga, kan analys av NK-cellfunktioner utökas till en mycket större detalj. Använda ytterligare ytmarkörer inklusive CD57, NKG2A och mördarcell immunoglobulin-liknande receptorer (KIRs), kan ytterligare NK cellgrupper identifieras. Utbildade NK-celler som uttrycker åtminstone ett själv KIR degranulate starkare vid interaktion med K562-celler än outbildade NK-celler. Däremot mer differentierad CD57 + CD56 + - CD56 + NK-celler 21. Dessutom kan andra markörer för cellfunktionen NK tas upp. LFA-1 är en viktig molekyl för NK-cellvidhäftning och uttrycks i sitt öppna konforma upon NK-cellaktivering. Denna så kallade "inside-out signal" är en tidig NK-cellaktiveringsmarkör 22.

Slutligen kan de stimuli för provning av NK-cellfunktioner modifieras också. I vår erfarenhet nyisolerade NK-celler endast degranulate dåligt på K562 cellinteraktion om inga cytokiner tillsätts. Använda nyisolerade PBMC utan ytterligare cytokin dessutom kringgå denna fråga på grund av påverkan av bystander celler. Dessutom cytokinproduktion, i synnerhet IFN-γ och TNF-α, kan inledas när IL-12 och IL-18-stimulering 23. IFN-γ produktion inom cellgrupper NK kan skilja depending på den använda stimulus (cytokin- mot mål-inducerad stimulering) 24. Dessutom, istället för att använda K562-celler som målceller, primära tumörceller härledda från tumörpatienter skulle kunna användas för att testa NK cellfunktioner mot autologa tumörceller före eller under immunmodulerande terapier (t.ex. monoklonala behandlings antikropp eller immunmodulerande läkemedel (IMiDs)).

Under de senaste åren har det gäller immunoterapi har snabbt utvecklas med den kliniska godkännande av immun checkpoint-hämmare (t.ex. ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 och framgångsrika försök med genetiskt modifierade chimära antigenreceptorn (CAR) uttryckande T-celler samt som CAR-NK-celler (översikt i referens 26), för behandling av hematologiska tumörpatienter 27. Därför NK cellbaserad immunoterapi blir allt mer i fokus. Anti-CD20-antikroppar har varit en stor framgång i att bearbent av maligna lymfom under de senaste två decennierna 28. Den stora majoriteten av NK-celler uttrycker lågaffinitets Fc-receptor CD16 som gör det möjligt för cellerna att känna igen och döda antikroppsmärkta målceller (antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet - ADCC). Antikroppens förmåga att utlösa NK-cellfunktioner kan testas in vitro med användning av beskrivna protokollet 29. Terszowski et al. Analyserade NK-celler "ADCC mot en B-lymfoblastoid cellinje med olika kliniskt godkända anti-CD20-antikroppar. Medan ADCC induceras vid rituximab behandling (första kliniskt godkända anti-CD20-antikropp 30) påverkades negativt av KIR / HLA interaktion, var denna effekt inte observerats vid användning av obinutuzumab (en ny glycoengineered typ II CD20 monoklonal antikropp) 31, 32. Dessutom är NK-cellfunktioner påverkas av olika nya antitumörläkemedel såsom IMID lenalidomid 33 och olika tyrosin-kinase-hämmare (TKI) 34. För närvarande NK cellspecifika checkpoint inhibitorer testas i kliniska prövningar. Exempel på detta är användningen av anti-KIR 35,36 eller anti-NKG2A antikroppar (NCT02331875) såväl som aktiverande agonister som en anti-CD137-antikropp (NCT01775631; NCT02110082).

Viktigare, har adoptiv NK cellöverföring utförts på en mängd olika maligna sjukdomar med lovande kliniska effekter 37. I syfte att välja den bästa givaren, kan NK-cellfunktioner mot patientens tumör testas in vitro med användning av blodprover från potentiella NK celldonatorer.

Sammanfattningsvis är den beskrivna protokoll utformat för att analysera olika NK cellfunktioner från friska donatorer eller patienter. kan övervakas dessa funktioner i olika NK cellgrupper på olika stimuli vid utvalda tidpunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

Immunologi NK-celler CD107a cytotoxicitet funktion IFN-y MIP-1 p K562-celler
Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter