Summary
Показан протокол расширительной микроскопии удержания этикеток (LR-ExM). LR-ExM использует новый набор трифункциональных анкеров, который обеспечивает лучшую эффективность маркировки по сравнению с ранее введенными микроскопиями расширения.
Abstract
Расширительная микроскопия (ExM) - это метод подготовки образцов, который можно комбинировать с большинством методов световой микроскопии для увеличения разрешения. После встраивания клеток или тканей в набухающий гидрогель образцы могут быть физически расширены в три-шестнадцать раз (линейный размер) по сравнению с исходным размером. Поэтому эффективное разрешение любого микроскопа увеличивается на коэффициент расширения. Основным ограничением ранее введенного ExM является снижение флуоресценции после полимеризации и процедуры пищеварения. Чтобы преодолеть это ограничение, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая предотвращает потерю сигнала и значительно повышает эффективность маркировки с использованием набора новых трифункциональных анкеров. Этот метод позволяет достичь более высокого разрешения при исследовании клеточных или субклеточных структур в нанометрическом масштабе с минимальными потерями флуоресцентного сигнала. LR-ExM может использоваться не только для иммунофлуоресцентной маркировки, но и с самомаркировкой белковых меток, таких как SNAP- и CLIP-метки, тем самым достигая более высокой эффективности маркировки. В этой работе представлена процедура и устранение неполадок для этого подхода, основанного на иммуноокрашении, а также обсуждение подходов к самомаркировке маркировки LR-ExM в качестве альтернативы.
Introduction
Расширительная микроскопия (ExM) используется исследователями с тех пор, как она была впервые представлена в качестве удобного подхода для достижения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычных микроскопов, таких как эпифлуоресценция и конфокальные микроскопы 1,2,3,4,5,6,7 . Используя ExM, можно достичь бокового разрешения ~ 70 нм даже с обычными конфокальными микроскопами. Когда ExM сочетается с изображениями со сверхвысоким разрешением, разрешение еще больше улучшается. Например, можно достичь разрешения примерно 30 нм при структурированной микроскопии освещения (SIM) и примерно 4 нм при стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM)1,5.
Однако низкая эффективность маркировки является критической проблемой для стандартных методов ExM. Потеря флуоресценции может варьироваться в зависимости от типа флуоресцентных групп и времени пищеварения. В среднем, однако, сообщалось, что более 50% флуорофоров теряются после полимеризации и стадий переваривания белка ExM, что наносит ущерб качеству изображения 3,4.
Так, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая может эффективно удерживать метки и уменьшать потери сигнала1. Ключевым новшеством LR-ExM является использование набора трифункциональных анкеров вместо простого использования флуоресцентных красителей, как в стандартной процедуре ExM, для окрашивания интересующих белков. Эти трифункциональные линкеры состоят из трех частей: (1) соединитель (например, N-гидроксисукцинимид (NHS)) для соединения с антителом, (2) якорь (например, метакриламид (MA)) для закрепления белков к полимеру и (3) репортер (например, биотин или дигоксигенин (DIG)) для сопряжения с органическим красителем. Трифункциональные анкеры выдерживают этапы полимеризации и переваривания белка и, следовательно, предотвращают потерю флуорофора.
Кроме того, этот метод обладает большим потенциалом, поскольку он совместим с самомаркирующими ферментативными тегами, такими как SNAP или CLIP. Ферментативные подходы имеют некоторые преимущества по сравнению с иммуноокрашивающим подходом в отношении высокой специфичности и эффективности маркировки 8,9,10.
В этой рукописи показана подробная процедура LR-ExM. LR-ExM - это высокоэффективный и гибкий метод для достижения высокого пространственного разрешения с повышенной эффективностью маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура
- Используйте клетки U2OS, культивируемые в среде McCoy 5A, дополненной 10% FBS при 37 ° C в 5% CO2.
- Культивируйте клетки на 16 хорошо съемное камерное покровное стекло (площадь культивирования 0,4см2) для удобства обработки.
2. Фиксация и пермеабилизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия фиксации и пермеабилизации зависят от оптимизированных протоколов иммуноокрашения. Ниже приведен протокол фиксации и пермеабилизации для коиммуноразморазвитых микротрубочек и ямок с клатриновым покрытием (CCP).
- Как только количество клеток достигнет ~0,04 х 106, зафиксируйте ячейки со 100 мкл 3,2% параформальдегида (PFA) в буфере PEM (100 мМ PIPES, 1 мМ EGTA и 1 мМ MgCl2, pH 6,9) в течение 10 мин при комнатной температуре (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация с помощью PFA выполняется в сертифицированной защитной вытяжке. - Промывайте клетки три раза в течение 5 мин каждая 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Пермеабилизируйте клетки 100 мкл буфера пермеабилизации при комнатной температуре в течение 15 мин (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к маркировке как можно скорее, чтобы избежать деградации целевого белка, РНК или ДНК и получить оптимальный результат. Однако, если это необходимо, фиксированные образцы могут храниться в течение длительного времени (до месяца) в буфере PBS при 4 °C. Замените любую испарившуюся PBS и защитите образец от фотоотбеливания.
3. Блокирование эндогенного стрептавидина и биотина
- Инкубировать клетки раствором стрептавидина, разбавленным в клеточном блокирующем буфере (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре (таблица 1).
- Ненадолго промойте 200 мкл буфера блокировки клеток.
- Инкубировать клетки со 100 мкл раствора биотина, разбавленного в клеточном блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подхода к самомаркировке тегов, такого как использование тегов SNAP- или CLIP-, пропустите шаг 4 и перейдите к шагу 5.1: подход к самовымещению тегов.
4. Первичное окрашивание антителами
- Инкубировать клетки с антителом против α-тубулина крыс (разведение 1:500) и антителом с тяжелой цепью против клатрина кролика (разведение 1:100) в 100 мкл буфера блокировки клеток в течение 16 ч при 4 °C или 1 ч при комнатной температуре. Удвоение времени инкубации образцов тканей.
- Промывайте образцы четыре раза 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.
5. Окрашивание LR-ExM специфическими вторичными антителами
- Конъюгируют антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как N-гидроксисукцинимид (NHS) - метакриламид (MA) -биотин или NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et al.1. Подход к самовымещению маркировки: конъюгированные антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как MA-бензилгуанин (BG)-Биотин или MA-бензилцитозин (BC)-Dig (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et al.1.
- Инкубировать клетки с ослиными анти-кролик-Dig-MA (разведение 1:100) и ослиным анти-крысо-биотин-МА (1:100 разведение) вторичными антителами в 100 мкл клеточного блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре. Удвойте это время инкубации для образцов тканей.
- Промывайте образцы четыре раза в 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.
6. Дополнительная анкеровка
- Инкубировать клетки с 0,25% глутаровым альдегидом (GA) в PBS (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы закрепить белки на гидрогеле. В качестве альтернативы для анкеровки используют эфир метакриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (MA-NHS) 25 мМ. Рекомендуется одночасовая инкубация при комнатной температуре.
- Промывайте образцы три раза в PBS в течение 5 минут каждый.
7. Гелеобразование
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость расширения определяется временем диффузии соли и воды наружу или в гель; таким образом, литье тонких гелей ускоряет время расширения.
- Удалите верхнюю структуру 16-луночной гелевой пластины. Добавьте 40 мкл раствора мономера в каждую лунку, чтобы кондиционировать клетки на льду. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Для приготовления раствора мономера см. Таблицу 2.
- Приготовьте гелеобразный раствор на льду. Добавьте двойную дистиллированную воду и 10% N,N,N',N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор мономера (10% TEMED: раствор мономера = 1:47); пока не добавляйте инициатора (таблица 3).
- Для камеры клеточной культуры площадью 0,4см2 используют гелеобразующий раствор объемом около 40 мкл. Приготовьте 45 мкл гелеобразующего раствора для каждой лунки.
- Добавьте 10% персульфат аммония (APS) в гелеобразный раствор, инкубируйте на льду и немедленно выпейте 40 мкл раствора для гелеобразования в каждую силиконовую прокладку на льду. Инкубировать на льду в течение 3 мин (10% APS:10% TEMED:раствор мономера = 1:1:47).
- Защитите образец от света и переместите покровное стекло в чашке Петри 10 см в инкубатор при температуре 37 °C в течение 1,5 ч для гелеобразования. Чтобы сохранить влажность геля во время инкубации 37 °C, накройте чашку Петри крышкой и положите несколько капель воды в чашку Петри.
8. Пищеварение
- После гелеобразования снимите стакан, чтобы отделить гель и переложить гель на 6-луночную пластину. Переваривайте внедренные клетки с 2 мл буфера пищеварения (таблица 1) в течение ночи при комнатной температуре или 4 ч при 37 °C. Используйте не менее 10-кратного избыточного объема буфера пищеварения.
- Гели для мытья с по крайней мере 10-кратным избыточным объемом воды, чем конечный объем геля. Повторяйте этап стирки четыре раза в течение 20-30 минут каждый раз. Гель расширяется примерно в два раза в каждом измерении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы геля могут храниться до 1 месяца в буфере PBS при 4 °C. Замените испарившуюся воду, чтобы избежать высыхания и защитить образец от света во время хранения. Чтобы избежать деградации трифункциональных анкеров, образцы следует окрашивать как можно скорее после переваривания и промывки.
9. Флуоресцентное окрашивание после пищеварения
- Инкубировать гели в буфере окрашивания стрептавидином (STV)/дигоксигенином (DIG) объемом 2 мл с STV-красителем от 2 до 5 мкМ и/или анти-DIG-красителем в течение 24 ч при комнатной температуре. Храните образцы в темноте.
10. Расширение
- Вымойте и разверните гель четыре раза, запивая водой (2-3 мл) в течение 30 мин до 1 ч каждый раз.
- Для более легкой визуализации клеток под флуоресцентной микроскопией окрашивайте клетки с помощью DAPI во время третьей из пяти промывок. Разбавить концентрацию запаса DAPI (5 мг/мл, хранить при 4 °C) в 1:5000 разведениях в промывочной воде. Инкубировать гель водным раствором DAPI (2 мл) в течение 30 мин - 1 ч.
- Два дополнительных раза промыть 3 мл воды.
- Разверните гели в любой плоской посуде, которая достаточно велика, чтобы содержать образцы. Расширенные гели, которые готовятся на покровном стекле площадью 0,4см2 , хорошо вписываются в стеклянную нижнюю 6-луночную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, окрашенные после расширения, могут храниться до 4 месяцев в буфере PBS при 4°C. Добавьте достаточно воды, чтобы избежать высыхания и защитить образец от фотоотбеливания. Повторите этап расширения и окрашивания DAPI перед визуализацией. Чтобы избежать риска деградации флуорофоров, образцы должны быть изображены как можно скорее.
11. Визуализация
- Покройте камеру визуализации 6-луночного стеклянного дна 0,01% поли-L-лизином (по 3 мл каждая), чтобы обездвижить образцы геля.
- Перенесите образцы геля в камеру визуализации с покрытием.
- Изобразите образцы с любыми желаемыми флуоресцентными прицелами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Котлованные ямы (CCP), покрытые клатрином, иммуноокрашены с использованием трифункциональных анкеров (рисунок 1B), а LR-ExM выполняется, как описано на рисунке 1A. LR-ExM (Рисунок 2C,E) показывает гораздо более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с микроскопией расширения удержания белка (proExM, Рисунок 2A) или биотин-ExM (Рисунок 2B); сигнал для LR-ExM был примерно в шесть раз выше, чем proExM (рисунок 2D). LR-ExM может эффективно захватывать небольшие структуры, такие как CCP, которые даже меньше дифракционного предела (рисунок 2F, G).
Некоторые репрезентативные результаты LR-ExM демонстрируются с использованием иммуноокрашающего подхода. Микротрубочки и CCP коиммунорашиваются с использованием трифункциональных анкеров, включая NHS-MA-DIG и NHS-MA-биотин (рисунок 3A, B). LR-ExM доступен для ферментативного подхода, основанного на тегах. Результат демонстрируется с использованием трифункциональных анкеров BG-MA-biotin (для SNAP-tag) и BC-MA-DIG (для CLIP-tag) на рисунке 3C-F. Кроме того, в LR-ExM можно сочетать как иммуноокрашающий, так и белково-меточный подход, как показано на рисунке 3G-J. Из этих результатов подтверждается, что LR-ExM полезен для получения высококачественных изображений с повышенной эффективностью маркировки и разрешением.
LR-ExM также показывает отличную производительность в образцах тканей. LR-ExM выполняется на мозговой ткани мыши путем совместного иммуноиммунажения пресинаптического маркера фагота и постсинаптического маркера Homer1. Эти две метки четкие и хорошо разделенные, которые поддерживают высокое разрешение и эффективность маркировки (рисунок 4A-E).
Рисунок 1: Рабочий процесс микроскопии расширения удержания этикеток (LR-ExM). (A) Рабочий процесс LR-ExM. (B) Схемы трифункциональных анкеров. Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественная оценка удержания сигнала (A-C) Расширительная микроскопия (ExM) конфокальные изображения ям с покрытием клатрином (CCP) в клетках U2OS, косвенно иммуноокрашенных для клатрина с тяжелой цепью (POI). (A) Удержание белка ExM (ProExM) с использованием AF488-конъюгированных вторичных антител. (B) ExM с пострасширяющей маркировкой с использованием биотин-конъюгированных антител. (C) LR-ExM с использованием антител, конъюгированных с трифункциональными якорями NHS-MA-biotin. Образцы в B и C после расширения окрашены стрептавидином-AF488. D) Количественная оценка интенсивности А-С. Полосы ошибок представляют SD. n = 3 для каждого случая. Коэффициенты расширения длины для изображений в A, B, C и E-G составляют 4,3, 4,5, 4,6 и 4,3 соответственно. Коэффициент расширения длины для образцов, используемых на графике D, составляет 4,5 ± 0,2. Шкала баров, 500 нм (A-C и E) и 100 нм (F и G). Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Арб. у., произвольные единицы; СТВ, стрептавидин. Все изображения получены с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водоиммерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты LR-ExM с использованием конфокальных микроскопов. (A,B) LR-ExM конфокальные изображения микротрубочек, помеченных NHS-MA-биотин-конъюгированными вторичными антителами (пурпурный) и CCP, помеченных NHS-MA-DIG-конъюгированными вторичными антителами (зеленый) в клетке U2OS. (B) Увеличенный вид. (С-Ф) Конфокальные изображения LR-ExM CCP и/или митохондрий в клетках HeLa, помеченные с использованием подхода к белковой метке (C) помеченного тегом SNAP клатрина, (D) меченого тегом CLIP TOMM20 и (E) двухцветного изображения. (F) Увеличенный вид. (G) Двухцветные конфокальные изображения LR-ExM с использованием комбинации иммуноокрашивающего подхода (NPC, red hot) и подхода с белковой меткой (помеченный SNAP lamin A/C (голубой)). (H) Увеличенный вид. (I,J) Виды отдельных каналов H. Обратите внимание, что цитоплазматический фон в G вызван антителом против NUP153. Коэффициенты расширения длины для изображений в форматах A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 и G-J равны 4,5. Шкала баров, 1 мкм для A, 200 нм для B и F, 500 нм для C-E, 2 мкм для G и 500 нм для H, I и J. Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Все изображения получены с помощью вращательно-дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водомерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты LR-ExM на образцах тканей. (A) LR-ExM конфокальное изображение среза мозга мыши, косвенно иммуноокрашенного для пресинаптического маркера фагота (пурпурного) и постсинаптического маркера Homer1 (зеленый). (В,С) Увеличенные изображения синапсов. (Д,Д) Поперечные профили интенсивности вдоль длинных осей желтой коробки. Фагот помечен NHS-MA-DIG-конъюгированными вторичными антителами, а Homer1 помечен NHS-MA-биотин-конъюгированными вторичными антителами. Все образцы после расширения окрашиваются стрептавиндином-AF488 и/или анти-дигоксином-AF594. Коэффициенты расширения длины для изображений в форматах A-C равны 4,2. Шкала стержней, 1 мкм (A) и 200 нм (B,C). Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Все изображения получены с помощью вращательно-дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водомерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Химические вещества и буферы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Мономерное решение Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Раствор для гелеобразования Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевым новшеством LR-ExM является использование трифункциональных якорей для эффективной маркировки целевых белков и улучшения качества изображения. Этот метод ограничен трифункциональными якорями, которые не так легко доступны исследователям. Тем не менее, трифункциональные якоря могут быть переданы другим исследователям по запросу, и аналогичные продукты, такие как зонды ExM от Chrometa, теперь также коммерчески доступны.
В этом протоколе инкубация 1 ч при комнатной температуре была выполнена для первичной и вторичной стадий окрашивания антител. Тем не менее, эти шаги могут быть выполнены ночью при 4 ° C, и наблюдается, что ночное окрашивание снижает фоновый шум.
Чтобы предотвратить структурные искажения, полученные в результате анизотропного расширения гидрогеля, важно выполнить тщательное переваривание белка с использованием протеазы3. Однако предыдущие микроскопии расширения показывают, что более 50% флуоресцентных меток могут быть потеряны после этапов полимеризации и переваривания белка, что приводит к ухудшению качества изображения 3,4. Для решения этой проблемы был разработан LR-ExM, который минимизирует потери сигнала путем введения флуоресцентных этикеток после переваривания1.
LR-ExM может широко использоваться с иммуноокрашивающими методами для изучения структуры мишени. Кроме того, LR-ExM можно комбинировать с подходами к самовымещению белковых меток, такими как подходы, основанные на SNAP- или CLIP-тегах. Это полезно, особенно когда хорошие антитела, представляющие интерес, недоступны или если требуется улучшенная целевая специфичность.
В данной работе представлен протокол LR-ExM с коэффициентом расширения длины около 4. Однако LR-ExM не ограничивается определенными коэффициентами расширения или типами образцов. Фактически, этот метод может быть объединен с любыми ранее существовавшими микроскопиями расширения, такими как расширительная микроскопия X10 4,11 или TREx12 для достижения более высокого разрешения. LR-ExM также можно комбинировать с pan-ExM, так что он эффективно визуализирует весь белковый ландшафт с высоким разрешением, не жертвуя специфичностью13.
Таким образом, LR-ExM может широко использоваться многими исследователями в качестве инструмента для выяснения клеточных структур с высоким разрешением и эффективностью маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (R00 GM126136 to X.S.), Национальным научным фондом США (DMS1763272 to S.P.) и Фондом Саймонса (594598 S.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al.
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
