DNA稳定同位素示踪（DNA-SIP）

本实验的总体目标是从已消耗特定生长底物的活性微生物中回收DNA，且无需在实验室进行培养。该方法首先在与原始环境条件相似的情况下，将环境样品与稳定同位素标记的目标底物共同孵育。实验的第二步是从该同位素标记的样品中提取总DNA。

该实验步骤的第三步是将此DNA在氯化铯中进行密度梯度超速离心。实验的最后一步是分段收集密度梯度，以获得重链和轻链DNA，用于后续的分子表征。最终，可通过多种可能的分子技术（包括指纹图谱分析、微阵列、杂交、克隆文库分析以及宏基因组学）获得结果，从而揭示参与特定底物代谢但尚未培养的活性微生物的身份。

大家好，我是来自滑铁卢大学生物学系的 Josh Neufeld。这位是 Eric Dunford，Newfeld 实验室的一名研究生。今天我们将向您展示一种名为 DNA 稳定同位素示踪（DNAS isotope probing），或简称 DNA-SIP 的实验方法。该技术已被广泛用于将未知且可能尚未培养的微生物的分类身份与其利用特定目标生长底物的能力关联起来。

我们在Newfeld实验室使用该方法研究多种陆地和水生环境中碳源的代谢。今天，我们将向您展示将特定碳底物13C葡萄糖应用于土壤样品的操作过程。但需要指出的是，自该方法最初由华威大学Colin Merle研究组开发以来，研究人员已对该方案进行了拓展，使其可应用于多种不同环境，并可使用多种不同的标记同位素，如氮和氧。

今天我们将重点关注碳元素，但该实验方案本身可适用于不同的实验设计。现在让我们开始。在本实验开始之前，按照本方案书面部分所述，准备好所有DNA稳定同位素探针（DNA SIP）或DNA CYP试剂。

DNAC 从样品孵育开始。孵育条件因样品和底物特性的不同而有较大差异。一旦通过实验确定了合适的孵育条件，向环境样品中加入适当的底物改良剂。

如果根据测试培养结果需要促进微生物生长，您也可以选择添加补充营养物质。样品培养设置完成后，盖紧并密封样品，然后对含有标记底物的环境样品进行培养。此处展示的示例是在土壤样品中加入碳13标记的葡萄糖溶液。

接下来，设置一个对照孵育组，作为后续步骤中观察到的核酸标记现象的比较依据。除使用未标记的碳作为底物外，其余条件均保持一致：将环境样品用未标记的底物进行封口并孵育。孵育结束后，采用适用于后续实验应用的提取方法，从微宇宙体系中提取DNA。然后使用琼脂糖凝胶和分光光度计对提取的DNA进行定量，以用于后续的超速离心步骤。

使用垂直或接近垂直的转子进行超速离心，以确保轻链和重链 DNA 实现最大程度的分离。贝克曼库尔特 VTI 65.2 转子具有 16 个孔，用于容纳 5.1 毫升快速密封聚合物管，以制备超速离心样品。首先，计算所需加入超速离心管的提取 DNA 体积，使 DNA 用量达到 0.5 至 5 微克。

根据先前测定的DNA浓度，使用数字折射仪准确测定氯化铯储备溶液的密度。按照书面实验方案中的建议，计算生成合适混合比例所需的梯度缓冲液DNA溶液的体积。

根据这些计算结果，将提取的DNA与梯度缓冲液和4.8毫升氯化铯加入无菌一次性15毫升离心管中。最终体积将超过离心管的标称容量，以确保完全填满离心管。最后通过上下颠倒混匀管子10次完成溶液配制，此为本实验方案的一种变体。

在梯度溶液中使用溴化乙锭（ethidium bromide）等染料，以便在试管中观察DNA。当使用纯培养的DNA制备时，通过改变DNA的密度，例如采用如图所示的溴化乙锭梯度，可特别有效地在每次离心后立即直观确认梯度的形成。该方法的具体操作步骤详见书面实验方案。

首先设置超速离心机时，使用吸球和移液管小心地将梯度溶液加入超速离心管中。用细的永久性记号笔在管肩上标记试管。确保将试管完全填充至管颈底部，因为填充不足的试管在超速离心过程中容易破裂。

当所有所需离心管均装入样品溶液后，记录每根离心管的精确质量，将离心管尽可能配成质量相近的配对管，并添加或移除少量溶液，直至配对管之间的质量差在10毫克以内。保持溶液液面尽可能接近离心管肩部。随后根据制造商说明书，使用离心管盖密封管口。

通过倒置离心管并施加适度压力，检查管子是否密封良好。再次称量离心管，以确认密封后在超速离心前仍保持平衡。仔细检查每个转子孔，确保其清洁且无任何可能在超速离心过程中刺穿管子的灰尘和碎屑。

将离心管插入转子中，将配平的管对放置在相对的位置。记录每个样品的转子位置，因为超速离心过程可能导致标记标签变得难以辨认。按照制造商的说明，小心密封转子孔。

密封转子孔后，将转子装入超速离心机。关闭超速离心机门，并对 VTI 65.2 转子抽真空。设置转速为 44,100 RPM，温度为 20 摄氏度，超速离心时间为 36 至 40 小时。

确保开启真空，选择最大加速度，并关闭制动，以防止减速干扰梯度。超速离心结束后，立即小心取出转子。注意不要倾斜或碰撞转子，以免扰动管内的梯度。

最后，轻柔地取出用于梯度分部的离心管。可采用分部技术从超速离心管中提取DNA。首先，用含有足量异丙酚蓝染料的无菌蒸馏去离子水填充一支60毫升无菌注射器。

为了获得深蓝色，将注射器放置在注射泵的加载臂上。然后连接装有23号一英寸针头的泵管，并开启泵，直至针头末端有水流出。应避免水源中存在任何气泡，因为气泡会对分级过程产生不利影响。

为每个样品准备12个无菌的1.5毫升微量离心管，管上标记样品编号和组分。接着，用快速而受控的动作将一根超速离心管固定在夹具架上。使用一支新的23号一英寸针头沿离心管接缝处刺穿管底，并旋转针头以确保形成均匀的孔洞。

您可能会发现，与丁腈手套相比，乳胶手套在针管表面能提供更好的抓握力。使用连接在泵管上的针头，沿试管上部肩部接缝处快速而稳定地刺穿试管顶部。请注意，也可先刺穿试管顶部，再刺穿试管底部。

此外，请注意，在管壁肩部涂上少量矿物油有助于防止因上部针头密封不严而导致液体泄漏，尤其是在使用已校准泵速的情况下。将染色水泵入管的顶部，使在12分钟内产生12个425微升的组分。使用计时器，将梯度溶液收集到已标记的微量离心管中。

最后，至少对一个样品或对照梯度的所有组分检测其密度。使用数字折射仪进行测量。预期密度范围为 1.690 至 1.760 克/毫升，中位密度约为 1.725 克/毫升，以从所有组分中沉淀 DNA。

首先，加入 20 µg 线性聚丙烯酰胺作为沉淀载体，并通过倒置混匀。然后加入两倍体积的 PEG 溶液，再次通过倒置混匀。将离心管置于室温下静置两小时，孵育后使 DNA 沉淀。

将样品放入微量离心机中，使离心管朝向一致，以确保沉淀物位置一致。在13,000 G条件下离心30分钟后，从微量离心机中取出样品，小心吸除并弃去上清液。此时在强光源辅助下应可见沉淀物。

离心后，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀。将样品在13,000 ×g条件下离心10分钟，离心后小心吸除并弃去上清液。此时沉淀将更明显，但更容易从管壁上脱落。

将沉淀在室温下干燥15分钟。沉淀干燥后，用50微升TE缓冲液重悬每个沉淀。最后，取各组分5微升在琼脂糖凝胶上电泳，以对梯度组分进行表征，具体方法参见书面实验方案中的讨论。

典型的DNA-SIP结果会通过超速离心形成的密度梯度显示出标记DNA与未标记DNA的分离。理想情况下，高分子量的遗传物质（如含有碳13和氮15标记的DNA）应与未标记的DNA完全分离，尤其是在稳定同位素孵育样品的第4至第8组分中观察到与之相关的独特PCR指纹图谱，而天然底物样品中则不应出现此类图谱。当以两种纯培养物的DNA进行实验时——即碳13标记的Methylomonas capsulatus strain Bath和未标记的Sinorhizobium meliloti ATCC 1021——标记与未标记的基因组DNA会根据其密度差异分别进入相应的梯度组分，从而为特定微生物参与特定标记底物代谢提供有力证据。

在此示例中，重同位素标记的 DNA 可在第 4 至第 5 组分中观察到，而未标记的 DNA 则在第 9 至第 10 组分中浓度较高。对相同组分进行 PCR 扩增后的 DNA 通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析，得到与梯度中包含的两种生物相对应的清晰条带模式。各组分的密度范围约为 1.580 至 1.759 克/毫升，并按从左到右密度递减的顺序排列。

相反，同位素分离和环境样品培养的结果可能较难解释。将加拿大雷索卢特湾的冻原土壤在15摄氏度条件下，分别与碳12或碳13标记的葡萄糖共同孵育14天。纯化梯度组分DNA的琼脂糖凝胶结果显示，在碳12和碳13孵育条件下，第7至第10组分均出现基因组DNA的弥散条带。

然而，当采用16S核糖体RNA基因的变性梯度凝胶电泳（DGGE）来测定特定微生物类群生物量中的碳13富集情况时，碳12葡萄糖孵育土壤的DNA在所有梯度组分中均产生相似的图谱，而碳13葡萄糖孵育样品则在第5至第8组分中产生独特对应的DGGE指纹图谱。箭头所指示的保守条带代表在所有梯度组分中一致存在的优势系统发育型。从碳13葡萄糖孵育土壤中提取的DNA，其系统发育型向较重组分发生偏移。该特定16S核糖体RNA基因的身份可被确定，从而为后续的宏基因组学或基于培养的研究方法提供指导。

我们刚刚向您展示了如何从样品孵育到获得用于分子分析的标记DNA，完成一次DNA稳定同位素探针实验。在进行该实验时，必须仔细考虑实验设计，注意避免添加过多底物，以免使实验结果偏向于快速生长的生物。同时，还应避免过长的孵育时间，以防底物通过食物网扩散至群落中的其他成员，从而造成稀释效应。

因此，您需要使用适量的底物和足够的孵育时间，以便通过高灵敏度的基于PCR的应用在重密度组分中检测到少量标记的DNA。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。