Name: 一个荧光识别GIRK通道调制器的筛选试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 了解利用荧光染料筛选GIRK通道调节剂的高通量方法，该方法使用AT20细胞和荧光酶标仪进行实时药物筛选，可快速识别调控神经元信号传导的化合物，为神经药理学研究提供有效工具。

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本工作得到美国公共卫生署资助项目 NS-071530 的支持。

1. 细胞的制备
<ol>
 <li> 在添加了10%马血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养垂体AtT20细胞，并将细胞培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化环境中维持培养。</li>
 <li> 每5至7天采用标准的胰蛋白酶消化法传代细胞，以维持培养。</li>
 <li> 用50 μL多聚-L-赖氨酸包被黑色、透明底的96孔板各孔，然后将各孔置于培养箱中孵育30分钟使其干燥。</li>
 <li> 将细胞以每孔30,000个细胞的密度接种于含200 μL培养基的96孔板中，并将细胞在培养箱中孵育3至4天。</li>
 <li> 使用一套吸液装置（由一个带塞的4升玻璃瓶组成，一端连接真空泵，另一端连接200 μL移液枪头），缓慢吸除细胞单层上的培养基。</li>
 <li> 用200 μL正常缓冲液（132 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM葡萄糖、5 mM HEPES，用NaOH调节pH至7.4）洗涤细胞。</li>
 <li> 向每孔加入含膜电位敏感性染料（MPD）DiBAC4(3) 或 HLB 021-152（5 μM）的缓冲液200 μL，并在37 °C孵育细胞40分钟。</li> 
</ol>
2. 测试化合物的制备与细胞处理
<ol>
 <li>使用 Versette（ThermoFisher）自动化液体处理系统，从化合物库（96 孔板格式）中制备待测化合物（储备液 = DMSO 中 10 mM）的系列稀释液。</li>
 <li>将含有 AtT20 细胞的 96 孔板从培养箱中取出，使其恢复至室温。吸除旧的缓冲液，并向细胞中加入含有 MPD 的新鲜缓冲液溶液。</li>
 <li>使用液体处理系统，将不同浓度（10 nM 至 10 μM）的待测化合物（2 至 20 μL）以及对照溶液（0.1% DMSO）（溶于含 MPD 的缓冲液中）加入含细胞的 96 孔板中。</li>
 <li>在进行荧光检测前，将细胞与待测化合物共同孵育 5 分钟。</li>
</ol>
3. GIRK 通道的激活、荧光检测与分析
<ol>
 <li>将96孔板插入Biotek Synergy2荧光酶标仪中，在激发波长520 nm和发射波长560 nm的条件下测定荧光背景信号。</li>
 <li>使用Synergy2注射系统向各孔中加入GPCR配体（生长抑素 = 200 nM 或卡巴胆碱 = 10 μM）或对照溶液（仅缓冲液）（20 μL）（总体积 = 220 μL），以激活GIRK通道。在300秒的采样时间内，每隔10秒采集一次数据，激发波长和发射波长分别为520 nm和560 nm。</li>
 <li>使用Biotek Gen5软件获取荧光变化的时间进程和峰值幅度，并将数据导出至Excel进行进一步分析。</li>
 <li>计算Z'因子以评估实验的可靠性。用于Z'因子测定的孔板包含各两行的阳性对照（GPCR配体）和阴性对照（仅缓冲液）。Z'因子定义为：Z' = 1 - (3σP + 3σN) / | μP - μN |，其中μP 和 μN 分别为阳性对照和阴性对照信号的均值，σP 和 σN 分别为阳性对照和阴性对照信号的标准差6。Z'因子在0.5至1.0范围内表明实验质量优良6。Z'因子低于0.5的孔板将被排除在分析之外。</li>
 <li>对能够调节荧光信号的化合物，在存在Ba2+或蜂毒抑素-Q（tertiapin-Q）的情况下重新进行测试，以确认其对内向整流K+通道的特异性。</li>
</ol>
4. 代表性结果
使用GIRK通道检测法测得的荧光信号示例如图2所示。向AtT20细胞中加入GPCR配体生长抑素（200 nM）后，HLB 021-152荧光信号迅速出现随时间依赖性的下降（图2）。相比之下，加入对照溶液仅引起荧光信号瞬时轻微上升，随后随时间恢复至基线水平（图2）。对加入对照溶液和生长抑素溶液的96孔板中荧光峰值进行比较，得到的Z'因子范围为0.5至0.7。为进一步定量分析，将生长抑素记录信号减去对照记录信号，得到生长抑素敏感性信号并进行分析（图2）。
该检测方法可用于快速鉴定调节GIRK通道的药物。例如，抑制GIRK通道的药物可通过阻止细胞内K+外流，从而减弱G蛋白偶联受体（GPCR）配体介导的荧光降低。如图3所示，用tertiapin-Q（一种可阻断GIRK通道的毒素7）处理细胞后，可抑制生长抑素介导的荧光变化。丙苯酮（propafenone）是一种在心脏中阻断GIRK通道的抗心律失常药物8，同样抑制了荧光信号的变化（图4）。该检测方法也可能适用于筛选GIRK通道的激活剂。然而，与对照溶液相比，加入GIRK通道激活剂乙醇（100 和 200 mM）2,3后，荧光信号未发生显著变化（p > 0.5）。
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="GPCR 信号通路示意图，G 蛋白相互作用，钾离子流动，膜电位变化。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. GIRK 通道荧光检测实验设计。AtT20 细胞在含有膜电位敏感型荧光染料（D）的缓冲液中孵育。染料分子进入细胞后，与细胞内蛋白结合并产生荧光（上图）。生长抑素（Som）与其 G 蛋白偶联受体（GPCR）结合后，激活抑制性 G 蛋白（Gi），从而激活 GIRK 通道（下图）。随后细胞内 K+ 外流，导致膜电位变得更负，染料分子随之离开细胞。因此，荧光信号减弱（下图）。
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="静态平衡图，生长抑素效应比较，F/F0 与时间关系，数据分析，对照组标记" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 在AtT20细胞中加入生长抑素或对照溶液后，随时间变化测得的HLB 021-152荧光信号的代表性结果。荧光强度比值（F/FO）通过将加入生长抑素（或对照溶液）后的信号（F）除以加药前测得的基线信号（FO）计算得出。每个数据点代表5–6个孔的平均值±标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素或对照溶液。加入对照溶液导致荧光信号出现轻微的短暂升高，此现象由溶液注入引起的温度变化所致。
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="静态平衡图，生长抑素效应，对照减除，荧光分析，时间与F/F₀的关系。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 使用 tertiapin-Q（500 nM）处理 AtT20 细胞可通过结合并阻断 GIRK 通道，抑制生长抑素介导的荧光信号下降。每个数据点代表 4–6 个孔的平均值 ± 标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素。
<img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="生长抑素抑制作用图；时间-反应效应；图表；药理学研究；分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 用丙吡胺（20 μM）处理 AtT20 细胞也能抑制生长抑素介导的荧光信号降低。每个数据点代表 5–6 个孔的平均值 ± 标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素。

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
<li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li>
<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li>
<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管膜电位敏感型荧光染料已被用于筛选调节离子通道的药物9,10，但本文首次报道了其在神经元GIRK通道药物发现中的应用。本文所介绍的GIRK通道荧光检测法为配体门控K+通道的筛选提供了一种快速、可靠且可实时监测的方法。该检测方法可适用于多种细胞类型，包括表达外源性重组GIRK通道的永生化细胞系（如HEK293、CHO等）11，或表达内源性通道的克隆细胞系（如AtT20、PC-12）。此外，该方法还可调整用于胚胎干细胞及原代细胞培养中的药物筛选。在使用AtT20细胞时，该方法还具有额外优势，即可同时研究多种G蛋白偶联受体配体（如生长抑素和卡巴胆碱）对GIRK通道的作用。与所有荧光检测方法一样，必须进行对照实验，以排除化合物自身荧光造成的假象，并识别化合物与染料分子直接相互作用所导致的误差。还应考虑其他替代方法，例如铊离子内流检测法11和自动化膜片钳技术12。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050-114</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>生长抑素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9129</td><td></td></tr><tr><td>卡巴胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>HLB 021-152</td><td>AnaSpec</td><td>89300</td><td></td></tr><tr><td>Versette 自动液体处理系统</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>650-01</td><td></td></tr><tr><td>Synergy2 荧光酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 分析软件</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt; 特定试剂与仪器列表。</td></tr></tbody></table>

一种用于筛选girk通道调节剂的荧光检测方法

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道作为多种激素和神经递质的细胞内介质，在脑、心脏、骨骼肌和内分泌组织中均有表达1,2。当配体（神经递质、激素、药物等）与细胞膜上的G蛋白偶联受体（GPCRs）结合后，可激活GIRK通道。这种结合会激活G蛋白（Gi和Go），后者继而结合并激活GIRK通道。通道开放后，允许K+外流，使静息膜电位变得更负。因此，神经元中GIRK通道的激活可减少自发动作电位的产生，并抑制兴奋性神经递质的释放。在心脏中，GIRK通道的激活会抑制起搏活性，从而减慢心率。
GIRK 通道是开发治疗神经病理性疼痛、药物成瘾、心律失常及其他疾病新药的潜在靶点3。然而，这些通道的药理学特性在很大程度上仍未被充分研究。尽管包括抗心律失常药、抗精神病药和抗抑郁药在内的多种药物均可阻断 GIRK 通道，但这种抑制作用缺乏选择性，且通常在相对较高的药物浓度下才会发生3。
本文介绍一种用于筛选GIRK通道新型调节剂的实时筛选实验方法。在该实验中，表达GIRK通道的神经AtT20细胞被加载膜电位敏感的荧光染料，例如双(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川基氧化物[DiBAC4(3)]或HLB 021-152（图1）。染料分子被细胞摄取后会表现出强烈的荧光（图1）。当细胞经G蛋白偶联受体（GPCR）配体处理后，可激活GIRK通道开放。由此引发的K+外流使细胞膜电位变得更负，导致荧光信号降低（图1）。因此，可通过荧光酶标仪检测能够调节GIRK通道介导的K+外流的药物。与其它离子通道筛选方法（如原子吸收光谱法4或放射性示踪剂分析5）不同，GIRK通道荧光检测法提供了一种快速、实时且成本低廉的筛选流程。

本文描述了一种用于实时筛选与G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道相互作用药物的检测方法。该检测技术利用对膜电位敏感的荧光染料来测量GIRK通道的活性。该方法可适用于多种细胞系。

一种用于筛选GIRK通道调节剂的荧光检测方法

G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道作为多种激素和神经递质的细胞内效应分子，在……中表达

本实验的总体目标是鉴定能够调节 grk 通道的新药物。首先，将 A TT 20 细胞接种于 96 孔板中。第二步，使用 Verset 液体处理系统对测试化合物进行稀释。 接下来，使用Verset将稀释后的待测化合物加入细胞中。最后一步是将96孔板放入Synergy二型荧光酶标仪中，并向各孔加入对照溶液和生长抑素溶液。最终，通过荧光酶标仪检测能够改变生长抑素诱导的荧光信号、从而调节Grk通道的化合物。与现有的方法（如膜片钳记录）相比，该方法的优势在于能够快速筛选大量化合物，以确定它们是否调节 Gerk 通道。该技术的应用意义延伸至疼痛治疗领域，因为可以鉴定出激活 Gerk 通道从而抑制 FI 伤害性信号传递的化合物。以下由 Maribel Vasquez 演示包被 96 孔板及细胞接种的操作步骤。我实验室中的一名学生开始该实验时，需在含10%马血清的DMEM培养基中培养垂体A TT 20细胞，37°C、5%CO2的加湿环境中培养。每五至七天使用标准化程序传代一次以维持细胞培养。接下来，用黑色透明包被剂包被培养板的孔。在96孔板底部加入50微升多聚赖氨酸。将培养板置于培养箱中孵育30分钟使其干燥。随后吸除多余的多聚赖氨酸，将细胞接种于含有200微升培养基的96孔板中，接种密度为每孔30,000个细胞。此后将细胞置于培养箱中孵育三至四天。使用吸液装置缓慢吸去细胞单层上的培养基，然后用 200 微升正常缓冲液洗涤细胞。随后，向每个样品中加入 200 微升含有膜电位敏感性染料的缓冲液。将细胞在37摄氏度下孵育40分钟。40分钟后，从培养箱中取出A TT 20细胞，使其恢复至室温，吸除旧的缓冲液，然后向细胞中加入含有MPD的新鲜缓冲液。接下来，使用液体处理系统将不同浓度的待测化合物和对照溶液加入细胞中。在96孔板中，使细胞与待测化合物共同孵育五分钟，随后进行荧光检测。在此步骤中，将96孔板插入BioTek Synergy 2荧光酶标仪中。在激发波长520纳米和发射波长560纳米的条件下获取荧光背景信号。随后，使用Synergy二进样器系统向孔中加入G蛋白偶联受体配体或对照溶液，以激活GIR通道。然后，在302秒的采样时间内，每隔10秒采集一次数据点。在激发和发射波长下，计算Z因子以确定检测方法的可靠性。Z因子在0.5至1.0范围内表明该检测方法的质量优异。Z 因子低于 0.5 的孔板被排除。在分析中，对能够调节荧光信号的化合物在含有 2 毫摩尔氯化钡或 500 纳摩尔terapin Q 的条件下重新进行测试，以确认内向整流钾通道的特异性。此处显示的是在 A TT 20 细胞中加入生长抑素或对照溶液后，随时间变化测得的代表性 HLB 0 2 1 1 15 2 荧光信号。Y 轴上的荧光强度比值是通过将加入生长抑素或对照溶液后的信号除以加入前测得的基线信号计算得出的。图中显示的是用 500 纳摩尔浓度的 Terapin Q 处理 A TT 20 细胞。Terapin Q 通过结合并阻断 G 蛋白门控内向整流钾通道（G channels），抑制了生长抑素介导的荧光信号下降。图中还展示了用 20 微摩尔浓度的普罗帕酮（propafenone）处理 A TT 20 细胞，该药物同样可抑制生长抑素介导的荧光信号下降。一旦掌握，该技术若操作得当，可在两小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何使用荧光酶标仪鉴定可调节 grk 通道的药物。

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本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

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