一个荧光识别GIRK通道调制器的筛选试验

该程序的总体目标是确定调节 grk 通道的新药。这是通过首先在 96 孔板中铺板 A TT 20 细胞来实现的。第二步是使用 Verset 液体板处理系统稀释测试化合物。

接下来，使用 verset 将稀释的测试化合物施加到细胞上。最后一步是将 96 孔板插入 Synergy 两个荧光读板器中，并将对照和生长抑素溶液注入孔中。最终，荧光读板器用于显示改变生长抑素诱导的荧光信号，从而调节 Grk 通道的化合物。

与膜片钳记录等现有方法相比，该程序的优势在于可以快速筛选大量化合物以确定它们是否调节 gerk 通道。该技术的意义延伸到疼痛的治疗，因为可以识别激活 Gerk 通道的化合物，导致抑制 FI 伤害性传递 演示涂层程序。96 孔板和电镀细胞是 Maribel Vasquez。

我实验室的一名学生通过在 37 摄氏度的加湿气氛中，在 5% CO2 的潮湿气氛中培养垂体 A TT 20 细胞，开始此过程。通过使用标准化程序每 5 到 7 天对细胞进行传代培养来维持培养物。接下来涂上黑色透明液的孔。

底部 96 孔板，含 50 μL 聚 L 赖氨酸。让孔在培养箱中干燥 30 分钟。然后去除多余的多聚 L 赖氨酸板，将 96 孔板中的细胞板中含有 200 微升培养基，密度为每孔 30， 000 个细胞。

之后，将细胞在培养箱中储存 3 到 4 天。使用抽吸装置从细胞单层中缓慢吸出培养基，然后用 200 μL 正常缓冲溶液洗涤细胞。随后，向每种溶液中加入 200 微升含有膜电位敏感染料的缓冲溶液。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。40 分钟后，从培养箱中取出 A TT 20 细胞，让它们恢复到室温，吸出旧缓冲液。然后将含有 MPD 的新鲜缓冲溶液应用于细胞中。

接下来，使用液体处理系统将不同浓度的测试化合物和对照溶液施加到细胞中。在 96 孔板中，将细胞与测试化合物一起孵育 5 分钟，以进行荧光测量。在此过程中，将 96 孔板插入 biotech synergy 两个荧光读板器中。

获得 520 纳米的渗出波长和 560 纳米的任务波长的荧光背景信号。然后，将 G PCR R 配体或对照溶液应用于孔中，以使用 Synergy 双注射器系统激活 GIR 通道。然后在第 302 个采样周期内以 10 秒的间隔收集数据点。

在激发波长和发射波长处。计算 Z 因子以确定测定的可靠性。Z.0.5 至 1.0 范围内的因子表明检测质量非常好。

Z 因子低于 0.5 的板被排除在外。从分析结果是，在两毫摩尔氯化钡或 500 纳摩尔特拉平 Q 存在下重新测试调节荧光信号的化合物，以确认向内整流钾通道特异性，此处显示的是具有代表性的 HLB 0 2 1 1 15 2 荧光信号，在添加生长抑素或对照溶液的情况下，在 A TT 20 细胞中随时间测量。通过将生长抑素或对照溶液存在下的信号除以加入生长抑素或对照溶液之前测得的基线信号来计算 Y 轴上荧光强度的比率。

这里显示的是具有 500 纳米磨牙的 A TT 20 细胞的处理。Terapin Q 通过结合 2 并阻断 G 通道来抑制生长抑素介导的荧光信号降低。这里显示的是用 20 微摩尔普罗帕酮处理 A TT 20 细胞，它还抑制生长抑素介导的荧光信号降低一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在两个小时内完成。

观看此视频后，您应该对如何使用荧光读板机识别调节 grk 通道的药物有很好的了解。