注射脂多糖对小鼠肠道屏障破坏后微生物源产物的模拟进入

该实验的总体目标是提出一个模型，模拟肠道屏障突破后微生物衍生产品的进入。该模型可用于研究微生物入侵后的免疫反应。这种方法可以帮助回答炎症性肠病领域的关键问题，例如不受控制的炎症，其特征是肠上皮通透性增加。

这种技术的主要优点是它不仅使用确定的泵，而且是一种不需要手术的简单方法，可以在各种实验室环境中使用。演示该程序的是我自己、博士后 Rachel Mak'Anyengo 和博士生 Berna Kaya。轻柔而牢固地握住老鼠，用一只手束缚动物。

确保鼠标握持牢固并能正常呼吸。将鼠标鼻子稍微向地板倾斜，露出腹部进行注射。找到腹部中线，并在左下角或右侧注射所需的 LPS 体积。

确保针头进入腹膜腔以避免误注射非常重要。针头也不宜深入腹膜腔，以免损伤内部器官。轻轻地将动物放回家笼中。

在注射时监测小鼠内毒素血症的发生和严重程度，此后每 2 小时监测一次，持续 8 小时。在随附的评分表中记录观察结果。将 1 毫升单步 RNA 分离试剂添加到预装有 1.4 毫米陶瓷球的两毫升试管中，以制备收集管。

老鼠实施安乐死并放血后，用一把剪刀剪开皮肤和肌肉层，露出腹腔和内脏。仔细解剖脾脏、肝脏和结肠。清洗每个器官的脂肪，然后放入冰上的 PBS 中。

接下来，用剪刀或手术刀从每个器官上剪下一块 0.5 厘米长的片。在一张纸巾上短暂擦干组织，然后将其放入收集管中，确保其完全浸入 RNA 分离试剂中。然后在高速台式匀浆器中匀浆组织。

对于脾脏、肝脏和结肠等软组织，使用一个高速匀浆循环，持续 30 秒。均质化后，将样品在室温下孵育 5 分钟。小心地将试管浸入液氮中，以快速冷冻组织裂解物。

将速冻裂解物储存在零下 80 摄氏度，直至 RNA 分离。通过在冰上解冻冷冻组织裂解物来开始 RNA 分离。解冻后，将样品在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心 5 分钟，以沉淀可能残留的剩余组织颗粒。

离心后，将上清液转移到新的无核酸酶的 1.5 mL 试管中，并在每 1 mL RNA 分离试剂中加入 200 μL 冰冷的氯仿。立即摇晃 10 到 15 秒。在室温下孵育样品 2 至 3 分钟后，在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 15 分钟。

样品现在将包含三个相，下部红色酚氯仿相、间相和上部无色水相。收集含 RNA 的上层水相，并转移到新的、不含核酸酶的 1.5 mL 试管中。要沉淀 RNA，每 1 毫升 RNA 分离试剂中加入 0.5 毫升冰冷的异丙醇，并倒置试管 5 至 6 次，轻轻混匀。

在室温下孵育 10 至 15 分钟后，在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 10 分钟。离心后，完全去除含有异丙醇的上清液，不要干扰沉淀。然后，每 1 毫升用于初始裂解的 RNA 分离试剂中加入 1 毫升冰冷的 75% 乙醇洗涤沉淀，并短暂涡旋样品。

在 4 摄氏度下以 7500 或 12， 000 倍 G 离心样品 5 分钟后，在不干扰沉淀的情况下完全去除上清液。将打开的试管放在化学罩下 3 到 5 分钟，以便在室温下风干 RNA 沉淀。接下来，小心地上下吹打，将 RNA 沉淀溶解在 20 至 50 μL 无核酸酶水中。

然后将样品在 55 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟，以进一步改善 RNA 的溶液。首先将不含核酸酶的水加入最多 10 μg RNA 中，以消化污染的 DNA，使添加缓冲液和酶后的最终体积为 50 μL。然后，每个样品加入 5 μL 10X DNase 1 缓冲液和 1 μL 重组 DNase 1，并通过上下吹打轻轻混匀。

在 37 摄氏度下孵育 20 至 30 分钟。孵育后，涡旋活化试剂中的 DNase，然后向样品中加入 5 μL 并充分混合。在室温下孵育 5 分钟，偶尔用手混合。

以 10， 000 x G 离心 1 分半钟后，将含有不含 DNA 的 RNA 的上清液转移到新的无核酸酶试管中。最后，通过分光光度计测量 RNA 浓度和质量。注射 LPS 后，疾病评分，包括对动物外观和活动、眼睛睁开程度以及呼吸速率和质量的评估，在 Y 轴上绘制，在 X 轴上绘制时间。

定量细胞因子表达的 QPCR 显示，Il6 在脾脏和结肠注射 LPS 后 2 小时达到峰值，在肝脏注射后 4 小时达到峰值。所有组织中 Il1 β 、 Tnf α 和 Il10 的表达在注射后 4 小时达到峰值。在 8 小时内，Il6 、 Il1 β 、 Tnf α 和 Il10 的表达恢复到基线水平。

在尝试该程序时，重要的是要记住考虑 LPS 的剂量、小鼠的卫生状况、实验终止的时间点，最重要的是，小鼠品系的遗传背景。观看此视频后，您应该对如何模拟细菌衍生化合物在屏障突破后进入宿主的情况有很好的了解。系统注射到小鼠体内的低、亚致死剂量的 LPS 诱导促炎细胞因子的上调，其通过 RGQ PCR 分析进行定量。