Name: 注射脂多糖对小鼠肠道屏障破坏后微生物源产物的模拟进入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解利用脂多糖注射模拟肠道屏障破坏后微生物产物进入的小鼠模型。该方法通过检测脾脏、肝脏和结肠中的促炎细胞因子表达，为研究炎症性肠病中的免疫反应提供了一种无需手术的简便方法。

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JHN 得到瑞士国家科学基金会（SNSF 310030_146290）的支持。

小鼠在巴塞尔大学生物医学系（瑞士巴塞尔）动物实验设施的无特定病原体（SPF）条件下进行繁育和饲养。所有小鼠实验均依照瑞士联邦和州级法规进行（动物实验许可编号 2816 [巴塞尔城市州]）。
1. LPS 溶液的制备
<ol>
	<li>在无菌条件下打开来自 Escherichia coli 0111:B4 的脂多糖（LPS）储备液，用水重悬至浓度为 5 mg/mL。</li>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将 LPS 储备液稀释至工作浓度 0.2 µg/µL。</li>
</ol>
2. 小鼠腹腔注射LPS
<ol>
	<li>在超净工作台中，用带有30 G针头的0.5 mL注射器吸取LPS工作液。</li>
	<li>称量雌性C57Bl/6小鼠（6至10周龄），并计算需注射的LPS剂量：按10 µL（2 µg）/g体重给药。 
	注意：例如，若小鼠体重为20 g，则需注射20 g × 10 µL = 200 µL的LPS工作液。</li>
	<li>轻柔但稳固地抓握小鼠，用一只手固定动物，确保其呼吸顺畅，同时防止其扭动或翻转。</li>
	<li>将小鼠鼻部略微朝向地面，以暴露腹部注射区域。找到腹部中线，并在中线左侧或右侧的下腹部确定注射部位。对照组小鼠则腹腔注射等量PBS而非LPS。</li>
	<li>用另一只手将适当体积（步骤2.2中计算出的体积）的LPS工作液注入腹腔。确保针头已进入腹膜腔，以免误注入腹肌层。但针头插入腹膜腔不宜过深，以防损伤该区域内的内脏器官。</li>
	<li>小心将动物放回笼中，每笼最多饲养5只小鼠。</li>
</ol>
3. 监测小鼠
<ol>
	<li>在注射时及注射后8小时内每2小时监测一次动物内毒素血症的发生情况及其严重程度。因此，使用根据先前发表的文献修改的评分表（表1）24。</li>
	<li>根据表1中列出的以下参数对注射LPS的小鼠进行评分
	<ol>
		<li>检查毛发外观，正常情况下毛发应光滑。若毛发出现蓬乱、竖立或肿胀，提示存在不适和/或疼痛，分别评分为1、2或3分。</li>
		<li>检查小鼠的活动情况。 
		注：正常小鼠通常在笼内自由活动，包括进食、饮水和攀爬，活动减少或受限可能是疼痛的表现。</li>
		<li>检查意识水平。 
		注：小鼠通常具有较强的好奇心，会在笼内四处探索周围环境。活动缺乏或减少可能提示存在疼痛和不适。</li>
		<li>检查眼睛状态。 
		注：健康小鼠的眼睛应完全睁开；眼睛部分或完全闭合，可能伴有分泌物，可能是疼痛的表现。</li>
		<li>检查呼吸频率。 
		注：健康小鼠通常呼吸频率正常且较快，呼吸频率降低可能提示存在不适。</li>
		<li>检查呼吸质量。 
		注：费力呼吸，无论是否伴有喘息，均为疼痛的征象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于核糖核酸（RNA）提取与匀浆的组织取样
<ol>
	<li>准备收集/匀浆管：向预装有1.4 mm陶瓷珠的2 mL离心管中加入1 mL单步RNA提取试剂。</li>
	<li>在适当的时间点（注射LPS前（0 h）以及注射后2 h、4 h和8 h），通过过量麻醉剂（异氟烷）处死小鼠，随后进行放血，并立即开始解剖。</li>
	<li>使用剪刀剪开皮肤和肌肉层，暴露含有内脏器官的腹腔。</li>
	<li>小心分离脾脏、肝脏和结肠，清除器官周围的脂肪组织，并将其置于冰上含PBS的容器中保存。</li>
	<li>使用剪刀或手术刀从每个器官上切下一小块组织（约0.5 cm长）。 
	注意：每次应尽可能从每只小鼠的相同部位取样（如肝脏的同一叶、结肠的近端或远端部分）。</li>
	<li>用滤纸短暂吸干组织表面液体，然后将其放入收集/匀浆管中，确保组织完全浸没于RNA提取试剂中。</li>
	<li>使用高速台式匀浆器对组织进行匀浆。对于脾脏、肝脏和结肠等软组织，设置匀浆速度为6.00，运行30秒，进行1个匀浆循环。</li>
	<li>将样品在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将离心管小心浸入液氮中，快速冷冻组织裂解液。将速冻后的裂解液储存于-80 °C，直至进行RNA提取。</li>
</ol>
5. 从组织中提取 RNA
注意：RNA 提取试剂、氯仿和醇类被视为危险物质。应在化学通风橱中进行 RNA 提取。使用经过认证的无 RNase 试剂和设备，以维持无 RNase 的环境。
<ol>
	<li>相分离
	<ol>
		<li>将冻存的组织裂解液置于冰上解冻。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，使残留的组织碎片沉淀。</li>
		<li>将上清液转移至新的无核酸酶 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>每 1 mL RNA 提取试剂中加入 200 µL 冰冷氯仿，用手剧烈振荡 10–15 秒。</li>
		<li>室温孵育 2–3 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。 
		注意：此时样品分为三层：下层为红色酚-氯仿相，中间层和上层为无色水相。RNA 存在于上层水相中。</li>
		<li>收集上层水相（约占总体积的 50%），转移至新的无核酸酶 1.5 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 沉淀
	<ol>
		<li>每 1 mL RNA 提取试剂中加入 0.5 mL 冰冷异丙醇，通过轻轻颠倒离心管 5–6 次混匀。</li>
		<li>室温孵育 10–15 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。 
		注意：此步骤中应可见 RNA 沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 沉淀洗涤
	<ol>
		<li>小心移除含有异丙醇的上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>每 1 mL 初始裂解所用的 RNA 提取试剂中加入 1 mL 冰冷的 75% 乙醇洗涤沉淀。</li>
		<li>短暂涡旋混匀样品。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 7,500（或 12,000）× g 离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶解 RNA
	<ol>
		<li>小心完全移除上清中的乙醇，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将离心管开盖置于通风橱中 3–5 分钟，使 RNA 沉淀在室温下空气干燥（切勿过度干燥，否则 RNA 难以溶解）。</li>
		<li>用 20–50 µL 无核酸酶水通过移液枪轻柔吹打，溶解 RNA 沉淀。</li>
		<li>在 55 °C 孵育 10–15 分钟，以进一步促进 RNA 溶解。 
		注意：此步骤后，RNA 可在 -80 °C 保存，直至后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 剩余DNA的消化
<ol>
	<li>使用分光光度计测定RNA浓度：取2 µl样品加入分光光度计中，测定后调整至推荐浓度。</li>
	<li>在50 µl无核酸酶水中，最多使用10 µg RNA开始消化污染性DNA。</li>
	<li>每份样品加入0.1体积的10x DNase I缓冲液和1 µl rDNase I，通过上下吹打轻轻混匀。</li>
	<li>在37 °C孵育20–30分钟。</li>
	<li>涡旋混匀DNase失活试剂，然后向样品中加入0.1体积的该试剂，并用移液器充分混匀。</li>
	<li>室温孵育5分钟，期间偶尔手动轻轻混匀。</li>
	<li>在10,000 × g离心1.5分钟。</li>
	<li>将含有无DNA RNA的上清液转移至新的无核酸酶离心管中。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA的浓度和质量。</li>
</ol>
7. 逆转录
<ol>
	<li>使用市售的脱氧核糖核酸cDNA逆转录（RT）试剂盒进行逆转录。 
	注意：此处最多可将2 µg RNA进行逆转录。</li>
	<li>计算含有2 µg RNA的体积。用移液器将2 µg RNA加入新的PCR管中。</li>
	<li>向PCR管中的样品加入无核酸酶的水，使最终体积达到10 µL。</li>
	<li>通过混合表2中列出的以下组分，制备2x主混合液。</li>
	<li>将10 µL 2x主混合液加入10 µL RNA中，以在总体积为20 µL的条件下获得1x主混合液。</li>
	<li>盖紧聚合酶链式反应（PCR）管，并短暂离心使样品沉降至管底。</li>
	<li>将样品放入PCR扩增仪中，并设置表3中列出的程序参数。</li>
	<li>将生成的cDNA储存于-20 °C，以用于后续分析。</li>
</ol>
8. 定量 PCR（qPCR）
<ol>
	<li>使用市售试剂盒进行qPCR反应。</li>
	<li>在使用前，自行设计并测试跨内含子的引物，并用不同浓度的模板cDNA进行验证。通过绘制标准曲线分析引物的扩增效率，选用扩增效率高且熔解曲线正确的引物。 
	注意：本实验所用引物序列见表2。</li>
	<li>按照表4中所述的反应体系，在384孔板中配制定量聚合酶链式反应（qPCR）反应体系。</li>
	<li>配制反应混合液时，将所有溶液和反应板置于冰上，并用铝箔包裹，防止反应板受潮。</li>
	<li>所有反应均设置三个重复。</li>
	<li>在热循环仪上按照表5所列程序进行PCR扩增。</li>
	<li>计算三个重复反应的平均Ct值。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）看家基因的表达水平为参照，通过计算2^(-ΔCt)对所有目标基因进行归一化处理。 
	注意：所有平均Ct值&#62;35的目标基因均视为低于检测限。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案模拟了微生物来源产物入侵后发生的免疫学过程。方案中的关键步骤包括小鼠品系的选择、小鼠的卫生状况、脂多糖（LPS）的剂量、动物内毒素血症发生情况的监测以及实验终止时间点的确定。尤为重要的是必须考虑小鼠品系的遗传背景。不同小鼠品系对LPS的敏感性存在差异。例如，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr小鼠对LPS诱导的内毒素血症具有抗性21,25此外，动物的卫生状况可能会影响脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症进程。最常使用的是无特定病原体（SPF）动物。这类小鼠不携带特定清单中的病原体，但其完整的微生物群组成尚不明确。26,27无菌动物（不携带任何微生物群）与SPF小鼠不同26无菌动物在定植单一微生物或微生物群落（已知菌群动物）后，与无特定病原体动物相比，可能在脂多糖注射后影响诸如IL-19等基因的表达。8此外...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

人类肠道中定植着大量微生物群落，这些微生物群落构成了肠道微生物组，并在进化过程中与宿主形成了互惠互利的关系。在这种关系中，宿主为微生物组提供稳定的生存环境，而微生物组则为宿主提供维生素、协助营养物质消化以及抵御病原体，其自身也栖居于宿主体内1。当宿主与微生物组之间的这种有益关系被破坏时，便可能引发疾病，例如炎症性肠病（IBD）。IBD 是一种由遗传和环境因素共同作用引起的肠道多因素慢性炎症性疾病，主要表现为两种形式：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。尽管这两种 IBD 形式具有相似之处，但它们在炎症改变的部位和性质上存在特定差异。CD 是一种可反复发作的透壁性炎症性疾病，可能累及整个胃肠道的任何部位，而 UC 则为非透壁性炎症，局限于结肠。此外，核苷酸结合寡聚化结构域样受体 2（NOD2）的突变与 CD 相关；NOD2 是一种模式识别受体（PRR），能够识别大多数革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁组分——胞壁酰二肽（MDP）2。此外，在 CD 患者体内，Escherichia coli (E. coli)、Listeria 和 Streptococci 及其产物均被发现存在于巨噬细胞内，这些微生物是在肠道屏障受损后侵入宿主的3。当细菌或其产物在 CD 发生过程中进入宿主时，免疫系统会产生应答，导致循环中抗细菌抗体的生成4。或许，微生物组在 IBD 发病机制中作用的最有力证据来自小鼠模型。在多数结肠炎模型中，若对动物使用抗生素，或将其饲养于无菌（GF）环境中，疾病严重程度会降低；例如，IL-10-/- 小鼠在无菌设施中不会发展为结肠炎5,6。此外，结肠炎也会扰乱微生物组的组成，表现为组成失衡和多样性降低，即所谓的菌群失调7。IBD 的后果可能是肠道通透性增加，从而导致微生物及其代谢产物进入宿主体内。
在动物体内，葡聚糖硫酸钠（DSS）的施用可诱导肠上皮屏障破裂，导致上皮屏障通透性增加8。患有DSS结肠炎的动物门静脉中脂多糖（LPS）浓度升高9。有趣的是，缺乏C型凝集素受体——特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素同源物相关1（SIGN-R1）的动物对DSS结肠炎和LPS诱导的内毒素血症具有保护作用10。为了进一步扩散至宿主体内，细菌或细菌来源的产物必须穿过血管屏障11、容纳小肠和大肠的腹膜腔、肠系膜淋巴结和/或肝脏12。为了降低该系统的复杂性，本研究使用了一种明确的细菌来源化合物。将脂多糖（LPS）通过腹腔（i.p.）或静脉（i.v.）注射至小鼠体内，以研究白细胞介素Il6和Ilb以及细胞因子Tnfa在LPS刺激下的表达情况13。
脂多糖（LPS）是一种病原体相关分子模式（PAMP），作为革兰氏阴性菌细胞壁的组分表达，其结构包括脂质A（LPS结构中的主要PAMP）、核心寡糖和O侧链14。树突状细胞、巨噬细胞和上皮细胞表达的Toll样受体4（TLR4）可识别LPS15，但需要共受体以实现适当的结合。急性期蛋白LPS结合蛋白（LBP）与LPS结合形成复合物，将LPS转移至分化簇14（CD14），即一种糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白。CD14进一步将LPS转运至淋巴细胞抗原96（MD-2），后者与TLR4的胞外域相关联。LPS与MD-2的结合促进TLR4/MD-2的二聚化，诱导构象变化，从而募集胞内接头分子，激活下游信号通路14，其中包括髓样分化初级反应基因88（MyD88）依赖性通路和含TIR结构域的接头蛋白诱导干扰素-β（TRIF）依赖性通路16。TLR4对LPS的识别进而激活NF-κB通路，并诱导促炎性细胞因子（如TNFα、IL-6和IL-1β）的表达17。
特别是当将LPS注入动物体内时，必须考虑给予动物的LPS浓度、动物的遗传背景以及饮食因素。高浓度的LPS会导致脓毒性休克，其特征为低血压和多器官功能衰竭，最终导致死亡18。与人类相比，小鼠对LPS的敏感性较低，在人类中，仅需2-4 ng/kg体重（BW）的LPS浓度即可引发细胞因子风暴19。对于小鼠而言，半数致死剂量（LD50），即导致一半小鼠死亡的剂量，根据所用小鼠品系的不同，范围为10-25 mg/kg BW20。对于常用的C57Bl/6和BALB/c小鼠品系，其半数致死剂量（LD50）为10 mg/kg BW。相比之下，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr品系对LPS诱导的内毒素血症具有抵抗性，这是由于Tlr4基因发生突变所致21。因此，Tlr4缺陷型小鼠对LPS注射表现为低反应性22。其他基因修饰小鼠品系，例如PARP1-/-小鼠23，也对LPS诱导的中毒性休克具有抗性。
本文所述的小鼠模型通过全身给予亚致死剂量的脂多糖（LPS），以模拟机体表面屏障受损后LPS扩散所引发的后果。所选用的LPS浓度（2 mg/kg 体重）在C56Bl/6小鼠中未引起死亡，但可诱导促炎性细胞因子的释放。

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR预混液（2x）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌O111:B4脂多糖（LPS）</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50一次性胰岛素注射器</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430离心机</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R离心机</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G样品制备系统</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

肠上皮屏障将宿主与通常被耐受或忽略的微生物群分隔开。该屏障的破坏会导致细菌或细菌来源的产物进入宿主体内，进入宿主的循环系统和内部器官，引发不受控制的炎症，这在炎症性肠病（IBD）患者中可见，此类患者的特征是肠上皮通透性增加。
为了模拟细菌来源的化合物进入宿主的过程，本研究采用了内毒素血症模型，即将革兰氏阴性菌外细胞壁组分脂多糖（LPS）注射到小鼠体内。在本研究中，通过腹腔注射给予小鼠亚致死剂量的LPS，并在注射后连续8小时利用疾病评分系统对小鼠进行监测。此外，通过qPCR在LPS注射后的不同时间点检测了脾脏、肝脏和结肠中炎症细胞因子Il6、Il1b和Tnfa的表达水平。该模型可用于研究微生物或细菌来源产物因体表屏障受损而侵入后所引发的免疫应答。

为了模拟肠道屏障受损后细菌或细菌来源的产物进入宿主体内所引发的后果，向C57Bl/6小鼠注射亚致死剂量的LPS（2 µg/g体重）。每只小鼠均被监测，并根据评分表中所列参数对其内毒素血症的发生情况进行评分，评分参数包括小鼠的外观、动物的活动性、眼睛状况以及呼吸频率和质量（表1）。动物表现出临床疾病症状，症状在注射LPS后6至10小时达到高峰，并在24小时内恢复（图1）。分别在注射LPS后2小时、4小时和8小时处死各组小鼠。从小鼠的脾脏、肝脏和结肠中采集组织样本。从这些器官中提取RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板进行qPCR，检测Il6（图2A）、Il1b（图2B）、TNFa（图2C）和Il10（<strong class="...

本文介绍了一种模拟肠道屏障受损后细菌来源化合物进入机体的实验方案。向小鼠全身注射低剂量的亚致死浓度脂多糖，并在注射后连续监测24小时。在多个时间点检测脾脏、肝脏和结肠中促炎性细胞因子的表达水平。

肠道上皮屏障将宿主与通常被耐受或忽略的微生物群分隔开来。该屏障的破坏会导致……

本实验的总体目标是建立一种模型，用以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物进入机体的过程。该模型可用于研究微生物入侵后的免疫应答。该方法有助于回答炎症性肠病领域中的关键问题，例如失控性炎症反应，其特征为肠道上皮通透性增加。该技术的主要优势在于，它不仅使用了明确的泵装置，而且是一种无需手术的简便方法，可在任何实验室环境中应用。演示该操作的将是我本人，博士后 Rachel Mak'Anyengo，以及博士生 Berna Kaya。操作小鼠时应轻柔而稳固，用一只手固定动物。确保小鼠被牢固固定且能够正常呼吸。将小鼠鼻部略微朝向地面倾斜，以暴露腹部以便注射。找到腹部中线，并在左下侧或右下侧注射所需体积的脂多糖（LPS）。确保针头进入腹腔以避免注射错误至关重要。同时，针头也不应过深地插入腹腔，以免损伤内部器官。轻柔地将动物放回其饲养笼中。在注射时及之后每两小时监测小鼠内毒素血症的发生情况和严重程度，持续八小时。将观察结果记录在附带的评分表中。通过向预先装有1.4毫米陶瓷珠的2毫升离心管中加入1毫升单步RNA提取试剂，来准备收集管。处死并放血小鼠后，使用剪刀剪开皮肤和肌肉层，暴露含有内脏的腹腔。仔细分离脾脏、肝脏和结肠。清除各器官上的脂肪组织，然后置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。接下来，使用剪刀或手术刀从每个器官上切取一段长约0.5厘米的组织。用一张纸巾短暂吸干组织表面液体，然后将其放入收集管中，确保组织完全浸没于RNA提取试剂中。随后在高速台式匀浆器中对组织进行匀浆处理。对于脾脏、肝脏和结肠等软组织，以高速进行一次30秒的匀浆处理。匀浆完成后，将样品在室温下孵育5分钟。小心地将试管浸入液氮中，以快速冷冻组织裂解液。将速冻裂解液在零下80摄氏度保存，直至进行RNA提取。开始RNA提取时，将冷冻的组织裂解液置于冰上解冻。解冻后，在4摄氏度条件下以1000 × g离心5分钟，使可能残留的组织碎片沉淀。离心后，将上清液转移至新的无核酸酶的1.5毫升离心管中，每1毫升RNA提取试剂加入200微升预冷的氯仿。立即剧烈振荡混匀10至15秒。室温孵育2至3分钟后，在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟。此时样品将包含三个相：下层红色的酚-氯仿相、中间相和上层无色的水相。收集含有RNA的上层水相，并转移至一个新的无核酸酶的1.5毫升离心管中。为沉淀RNA，每1毫升RNA提取试剂中加入0.5毫升预冷的异丙醇，然后通过轻轻颠倒离心管5到6次进行混匀。室温孵育10至15分钟后，在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。离心后，彻底去除含有异丙醇的上清液，注意不要扰动沉淀。然后，每使用1毫升RNA提取试剂进行初始裂解，即用1毫升预冷的75%乙醇洗涤沉淀，并短暂涡旋混匀样品。在4°C条件下，以7500或12,000 × g离心样品5分钟，随后彻底去除上清液，切勿扰动沉淀。将打开

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科研

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