Grundlegende Methoden der Zell- und Molekularbiologie

Bei vielen biomedizinischen Experimenten muss die Zellanzahl bekannt sein, um genaue, reproduzierbare, und statistisch-relevante Daten zu erhalten. Daher ist es für einen erfolgreichen Biowissenschaftler wichtig zu lernen wie man Zellen zählt. Der häufigste Weg um Zellen zu zählen ist mit der Zählkammer – also mit einem Instrument mit zwei laserbeschrifteten Liniennetzen, das die Zellzählung von Teilproben mit Hilfe eines Lichtmikroskops ermöglicht. Diese Daten können dann verwendet werden, um...

Zelllinien werden häufig in biomedizinischen Experimenten benutzt, da sie eine schnelle Kultur und Expansion von verschiedenen Zellarten für die experimentelle Analyse bereitstellen. Zelllinien werden unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wir frisch isolierte, oder primäre Zellen. Es gibt jedoch ein paar wichtige Unterschiede: Zellinien benötigen ihre eigenen spezifischen Wachstumsfaktormischungen und ihr Wachstum muss im Gegensatz zu primären Zellen häufiger kontrolliert werden, da sie...

Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR, ist eine Methode, bei der DNA durch das sogenannte Thermocycling – also das wiederholte verändern der Temperatur für einen bestimmten Zeitraum – amplifiziert werden kann. Durch die Benutzung einer thermostabilen DNA-Polymerase kann das PCR viele Kopien der DNA, von den DNA Bausteinen, die Deoxy-Nukleotidtriphosphaten, oder dNTPS, genannt werden, herstellen. Es gibt 3 Schritte in einem PCR: die Denaturierung, Hybridisierung, und Elongierung. Die...

Die DNA Gelelektrophorese ist ein Verfahren das benutzt wird, um DNA Moleküle aufzutrennen und nachzuweisen. Ein elektrisches Feld wird auf eine Gelmatrix, die aus Agarose besteht, angewendet. Geladene Partikel migrieren durch das Gel und werden dadurch nach ihrer Größe aufgetrennt. Die negativ geladenen Phosphatgruppen im DNA Rückgrat bewirken das die DNA Fragmente in Richtung der Anode migrieren – also der positive geladenen Elektrode.Das Video erklärt den Mechanismus durch welchen die DNA...

Die Natriumdodecylsulfat Polyacylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE, ist ein häufig angewandtes Verfahren, um Proteingemische auf ihrer Größe basierend aufzutrennen. SDS, ein anionisches Tensid, wird benutzt um eine gleichmäßige Ladung um die ganze Länge des linearisierten Proteins, zu erzeugen. Durch das Beladen und Laufen des Polyacrylamid-Gels mit einem elektrischen Feld werden die Proteine, welche mit SDS umschlossen sind, aufgetrennt. Das elektrische Feld führt dazu, dass die mit SDS...

Die Transformation ist ein Prozess, bei dem Bakterien Fremd-DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen.Transformationen können in bestimmten Bakterien von Natur aus auftreten. In der molekularen Biologie wird der Transformationsprozess durch das Einfügen von Poren in die bakteriellen Zellmembranen künstlich im Labor reproduziert. Bakterielle Zellen, die DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen können, werden auch kompetente Zellen genannt. Im Labor können bakterielle Zellen kompetent gemacht werden. Danach kann...

Das Wort Elektroporation bezieht sich auf die Aufnahme von Fremd-DNA von Zellen. Transformationen können ganz natürlich in Bakterien vorkommen. In der molekularen Biologie kann die Transformation jedoch künstlich erzeugt werden, indem man kleine Poren in die bakterielle Zellwand einführt. Bakterien, die DNA aus ihrer Umgebung aufnehmen können, nennt man kompetente Bakterien. Elektrokompetente Zellen können im Labor produziert werden. Die Transformation dieser Zellen kann mit Hilfe eines...

Ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird normalerweise gemacht um die Anwesenheit und die Menge eines Zielproteins in einer experimentellen Probe nachzuweisen. Der Nachweis des Zielproteins passiert durch Antikörper, was den ELISA zu einen Immunverfahren macht. Durch eine Reihe von Inkubations- und Waschschritten erkennen die Antikörper, die oft an ein Enzym gekoppelt sind, ein Protein das an der Oberfläche einer Mikrowellplatte ist. Wenn es mit einem Substrat in Berührung kommt,...

Die Plasmidpräparation ist ein Verfahren, mit dem man Plasmid-DNA von der bakteriellen genomischen DNA, Proteinen, Ribosomen und Zellwänden trennt und aufreinigt. Ein Plasmid ist ein kleines, ringförmiges, doppelsträngiges DNA Molekül, das als Träger bestimmter DNA Moleküle benutzt wird. Wenn sie in Gastorganismen durch Transformation eingefügt werden, können Plasmids repliziert werden, wodurch vielfache Kopien des DNA Fragments entstehen.In diesem Video stellen wir ein Schritt-für-Schritt...

Die Gelaufreinigung wird verwendet um DNA Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung zurückzugewinnen. Die DNA Rückgewinnung besteht aus 3 einfachen Schritten: dem Binden, Waschen und der Eluierung aus der Silica-Säule. Die DNA bindet das Silica durch Salzbrücken, wenn hohe Salzkonzentrationen vorhanden sind. Nach dem Binden wird die DNA gewaschen um Verunreinigungen wegzuspülen, und dann unter niedrigeren Salzbedingungen, welche die Salzbrücken unterbrechen, eluiert. Dieses Video gibt eine...

Ein Western Blot wird benutzt, um spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe nachzuweisen. Nach der Auftrennung mit Hilfe eines Verfahrens das “Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese”, oder SDS-PAGE, genannt wird, benutzt man einen Westerntransfer um Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran zu übertragen, welche die Proteine in ihrer Position festhält. Danach wird die Membran mit Antikörpern inkubiert – ein Prozess der auch Immunblotting genannt...

Eine Transfektion ist der Prozess durch den man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einfügt. Die Einfügung des Gens ermöglicht die Expression von Proteinen durch die zelleigene Maschinerie, wohingegen RNA in einer Zelle genutzt wird um die Expression eines Proteins durch das Hemmen der Translation zu verhindern. Die transfizierte RNA ist hauptsächlich im Zytoplasma aktiv, wohingegen die DNA für eine effiziente Transfektion in den Nukleus...

In der molekularen Biologie bezieht sich das Wort Ligase auf die Verknüpfung von zwei DNA Fragmenten durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung. Ein Enzym, das auch DNA Ligase genant wird, katalysiert die Ligasereaktion. In Zellen reparieren DNA Ligasen DNA Einzel- oder Doppelstrangbrüche, die während der Replikation auftreten. Im Labor wird die DNA Ligase in der molekularen Klonierung verwendet, um ein DNA Fragment mit einem Vektor (also DNA Moleküle welche die DNA Fragmente in Wirtszellen...

Restriktionsenzyme oder Endonukleasen erkennen und schneiden spezifische DNA Sequenzen. Diese Enzyme treten in Bakterien als Abwehrsystem gegen Bakteriophagen auf – also Viren, die Bakterien infizieren. Restriktionsenzyme in Bakterien schneiden diese invasive Bakteriophagen-DNA, lassen aber die bakterielle DNA unangetastet weil dort Methylgruppen vorhanden sind.Dieses Video erklärt die grundlegenden Prinzipien der Restriktionsenzyme, einschließlich der Nomenklatur von Restriktionsenzymen, der...

Das molekulare Klonieren besteht aus verschiedenen Methoden, die benutzt werden um rekombinante DNA in einen Vektor – also ein Träger-DNA Molekül, das die rekombinante DNA in einem Wirtsorganismus vervielfältigt - einzufügen. DNA Fragmente, wie zum Beispiel Gene, können von prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen isoliert worden sein. Nachdem das gesuchte Fragment isoliert worden ist, müssen sowohl der Vektor als auch das Fragment durch Restriktionsenzyme geschnitten und danach aufgereinigt...