Summary
Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.
Abstract
Dit protocol detailleert een methode om het vermogen van gezuiverd hematopoëtische voorlopers aan plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) in intestinale Peyer's Patch (PP) genereren analyseren. Gemeenschappelijke dendritische cel voorlopers (CDP, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) werden gezuiverd uit het beenmerg van C57BL6 muizen door FACS en overgebracht naar ontvangende muizen die een aanzienlijke pDC bevolking PP beschikken, in dit geval, IFNAR - / - muizen werden als ontvangers overdracht. In sommige muizen, werd overexpressie van de dendritische cel groeifactor Flt3 ligand (Flt3L) voorafgaand aan de overdracht van de CDP adoptief afgedwongen, met behulp van hydrodynamische genoverdracht (HGT) van Flt3L-codering plasmide. Flt3L overexpressie breidt DC populaties afkomstig van overdracht (of endogene) hematopoëtische voorlopers. Op 7-10 dagen na voorlopercellen overdracht is pDCs die voortkomen uit de adoptief overgedragen voorlopers onderscheiden van ontvangende cellen op debasis van CD45 marker expressie, met pDCs uit overgedragen CDP's zijn CD45.1 + en ontvangers zijn CD45.2 +. Het vermogen overgedragen CDP bijdragen aan de PDC bevolking PP en reageren Flt3L werd geëvalueerd door flowcytometrie PP enkelvoudige celsuspensies van ontvangende muizen. Deze werkwijze kan worden getoetst of andere populaties voorlopercellen kunnen genereren PP pDCs. Bovendien kan deze benadering worden gebruikt om de rol van factoren die voorspeld beïnvloeden pDC ontwikkeling PP, door overdracht progenitor subsets met een geschikt knockdown, knockout of overexpressie van de vermeende ontwikkelingsfactor en / of door het manipuleren van circulerende cytokinen via HGT onderzocht . Deze methode kan ook de analyse van de manier waarop PP pDCs invloed op de frequentie of de functie van andere immuun subsets in PPs mogelijk te maken. Een uniek kenmerk van deze methode is het gebruik van IFNAR - / - muizen, die ernstig uitgeput PP pDCs opzichte van wildtype dieren, waardoor allowi tonenng reconstitutie van PP pDCs in afwezigheid van verstorende effecten van letale bestraling.
Introduction
Hier tonen we een protocol om te beoordelen of gemeenschappelijke dendritische cel voorlopers (CDP's) in staat zijn die aanleiding geven tot de plasmacytoide dendritische cel (PDC) bevolking in de Peyer's patch (PP). Het algemene doel van het gebruik van deze methode was om de ontwikkelingsdoelen regulering van pDCs in Peyer's patch (PP pDCs) te evalueren. De reden dat dit belangrijk is dat PP pDCs verschillen pDCs gevonden in andere weefsels, zoals beenmerg, bloed en milt, en daarom is het onduidelijk of PP pDCs en andere pDC populaties ontwikkelingsgebied en / of functioneel gerelateerd. Specifiek worden pDCs alom bekend als de belangrijkste type I interferon (IFN) producenten binnen het hematopoietische systeem, het reageren op Toll-like receptor 7 en 9 (TLR7 / 9) stimulatie door snelle IFN secretie 1-3. Echter, PP pDCs zijn deficiënte type I IFN reactie op TLR agonist stimulatie 4,5. Bovendien PP pDCs ook verschillen pDCs gevonden in beenmerg en miltwaarbij signalen van het type I interferon (IFN)-receptor (IFNAR1) of IFN-signalerend molecuul STAT1 voor hun ontwikkeling en / of accumulatie 5. Deze gegevens hebben de mogelijkheid dat verschillende regulerende mechanismen beheersen PP pDCs versus pDCs in andere organen (bijvoorbeeld beenmerg, milt) 5 voorgesteld.
De reden die leidde tot de ontwikkeling van deze methode was gebaseerd op de recente vooruitgang in het begrip dendritische cel (DC) biologie. De meeste, zo niet alle, DC subsets afkomstig van hematopoëtische voorlopers die het FMS-achtige tyrosinekinase receptor 3 (Flt3) 6-10 expressie, maar is DC ontwikkeling niet beperkt tot de klassieke myeloïde en lymfoïde wegen. Bijvoorbeeld, Flt3 + gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) aanleiding geeft tot CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which verder differentiëren in pDCs en conventionele DC (CDC) 9,10. Daarentegen Flt3 + gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen (CLPs, lin - IL-7R + SCA-1 lo c-kit lo) ontwikkelen voornamelijk in pDCs 11. Daarom voorafgaande studies geven pDCs voortvloeien uit minstens 2 verschillende hematopoietische voorlopercellen bevolking onder de regulering van Flt3L, hoewel de typische analyse is beperkt tot het beenmerg, de milt en / of bloed pDC subsets. Zo is de stamvader populatie (s) die PP pDCs genereert vereist onderzoek. Begrijpen van de oorsprong van PP pDCs zal licht werpen op de vraag of zij gemeenschappelijke ontwikkelingstrajecten met andere pDC bevolking, of gebruik maken van verschillende mechanismen tijdens hun generatie in PP.
Een uniek voordeel van de hierin beschreven benadering is het gebruik van muizen die een ernstig tekort in PP pDCs als ontvangers voor de adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers tonen. Muizen met gentic deletie in het gen dat codeert IFNAR1 (IFNAR - / - muizen) of STAT1 (Stat1 - / -) bleek een opvallende afname in PP pDCs 5. Daarom zijn deze stammen bieden een omgeving waarin PP pDCs gereduceerd, waardoor adoptieve overdracht studies bij afwezigheid van krachtige cel ablatie regimes als letale bestraling worden uitgevoerd. Een extra sterkte van de hier gepresenteerde methode het gebruik van hydrodynamische genoverdracht (HGT) verhoogde circulerende hoeveelheden Flt3L stimuleren. Dit levert een rendabele aanpak Flt3L induceren in vivo versus injectie van recombinant eiwit. Talrijke studies, waaronder die in ons laboratorium hebben HGT gebruikt om cytokine bedragen induceren in een verscheidenheid van experimentele omstandigheden 5,12,13.
De verdeling van arbeid en precieze immuunfuncties voor ontwikkelingslanden is van groot belang in de immunologie. Vooral pDCs zijn belangrijke mediatoren van orale tolerantie en systemische antiviralereacties, maar ze lijken ook bijdragen aan de ontwikkeling en persistentie van auto-immuniteit en kanker 14-17. De hierin beschreven protocol zal de ontwikkeling mechanismen tot regeling van PP pDCs meer te worden onderzocht. Bovendien kan deze aanpak laten studies naar PP PDC-functie te beoordelen, en kan worden uitgebreid tot het begrip van de regulatie en functie van andere immuun-populaties in PP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionele goedkeuring moet worden verkregen bij voorbaat voor alle experimentele manipulaties hierin beschreven waarbij muizen. Deze omvatten het gebruik van C57BL6 muizen voor isolatie van beenmerg stamcellen, IFNAR - / - muizen als ontvangers voor adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers en het gebruik van HGT voor cytokine overexpressie in vivo. Passende huisvesting en verzorging van dieren moeten ook worden verleend door de onderzoeker of instelling. Bovendien kan institutionele goedkeuring vereist voor de plasmiden gebruikt in hydrodynamische gentransfer (dwz recombinant DNA goedkeuring). De hier beschreven studies werden goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de UT MD Anderson Cancer Center.
1. Hydrodynamische Gene Transfer (HGT)
Deze stap moet 2 dagen uitgevoerd te worden voordat de adoptieve overdracht van CDP induceren circulerende Flt3L DC expansie in vivo 5. Prepare minstens 5 ontvangende muizen / groep.
- Om efficiënte HGT bereiken, de bloedvaten van de ontvanger IFNAR - / - muizen moet (CD45.2 +) worden verwijd door het blootstellen van muizen een warmtelamp gedurende 5-10 minuten.
- Plaats de muis in een restrainer apparaat en te desinfecteren zijn staart met 70% ethanol.
- Injecteer 5 ug van plasmide dat codeert Flt3L in 2 ml steriele PBS in de staart ader met behulp van een 27 G naald. Voor de controle cohort, injecteren 5 ug van lege vector (Porf) via de staart ader zoals aangegeven.
- Monitor muizen voor 15-30 minuten om ervoor te zorgen dat er geen schadelijke effecten van de staart ader injectie. Terug muizen tot huisvesting faciliteit voor 2 dagen.
2. Isolatie van hematopoëtische voorlopers van Mouse Bone Marrow
Deze stap moet worden uitgevoerd 2 dagen na HGT. Gebruik congenic CD45.1 + muizen als de bron van het beenmerg voorouders voor adoptieve overdracht in ontvangende IFNAR - /- dieren (CD45.2 +). In dit protocol zijn congene stammen moeten donor en ontvanger-afgeleide DCs te onderscheiden, en om te voorkomen immuun-gemedieerde depletie door MHC mismatch. Ongeveer 10-20 muizen zullen moeten voldoende aantallen hematopoietische progenitorcellen (10 5 cellen / ontvanger muis) voor de overdracht experimenten.
- Euthanaseren 10 congenic CD45.1 + muizen door CO 2 stikken en cervicale dislocatie.
- Plaats elk karkas op een dissectie tray en steriliseer de buik en benen met 70% ethanol.
- Maak een insnijding in het midden van de buik en snijd door de huid van de buik om elk been, snijden huid over de lengte van het been.
- Verwijder voorzichtig de huid van elk been, en af en haal de poten van het karkas aan het heupgewricht met behulp van scherpe een schaar.
- Verwijder voorzichtig de spieren van het bovenbeen en onderbeen van elk been met een scherp mes.
- Verwijderenbeide uiteinden van de femur en de tibia met een scherpe scalpel en plaats botten in een kweekschaal met compleet RPMI (RMPI met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat en 50 uM β-mercapto-ethanol) .
- Bereid een spuit met 1 ml compleet RPMI, verbonden met een 27 G naald.
- Breng de 27 G naald in een uiteinde van de femur of tibia. Spoel het beenmerg van de femur of tibia voorzichtig injecteren complete RPMI in het bot. Controleer of beenmergcellen worden uit het been verwijderd, dit kan worden bereikt door visueel detecteren verdreven media die troebel weergegeven.
- Herhaal het spoelen elk bovenbeen en onderbeen 3x om beenmergcellen grondig te verwijderen.
- Bereid een enkele cel schorsing door de pipet voorzichtig cellen op en neer 3-5x in de cultuur schotel.
- Verwijder vuil door het passeren van de beenmergcellen door een 40 uM cel zeef, het plaatsen van de straalde cellen in een nieuwe culture gerecht. Breek een cel klonten die op de zeef door lichte druk met het uiteinde van een steriele spuitplunjer.
- Lyse de rode bloedcellen (RBC) in de totale beenmerg celsuspensie commerciële RBC lysisbuffer instructies van de fabrikant. Gebruik 2 ml RBC lysis buffer/4-6 x 10 7 cellen (gewoonlijk cellen van een muis) en een incubatietijd van 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de beenmergcellen van pellets cellen door centrifugatie gedurende 4 minuten bij 500 xg voorzichtig opzuigen het kweekmedium resuspenderen in 10 ml FACS-buffer (1x PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), omhullingen cellen door centrifugering en voorzichtig opzuigen wash buffer.
- Herhaal het wassen, zoals beschreven in stap 2.13, voor een totaal van 2 wasbeurten.
3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te CDP Isoleer
Deze stap vereist toegang tot een MidiMACS celseparator en MACS LD kolommen voor een eerste negatieve selectie procedure,alsmede een FACS machine met minstens 3 lasers om de veelkleurige progenitor deelverzameling zuiveren na kleuring met fluorescent geconjugeerde antilichamen.
- Na de tweede wasbeurt in stap 2.14, tel de beenmergcellen. Pellet de cellen door centrifugatie zoals beschreven in stap 2.13 en resuspendeer in FACS buffer tot een eindconcentratie van 4 x 10 7 cellen per 30 ui FACS buffer bereiken.
- Om cellen voor FACS bereiden, zijn lineage-negatieve cellen eerst verrijkt door een negatieve selectie techniek die geslacht-positieve cellen verwijdert uit het beenmerg mengsel met behulp van magnetische kraal kolomchromatografie. Voor de negatieve selectieprocedure, voeg 1 ug van elk van de volgende commerciële rat anti-muis antilichamen (Abs) die hematopoietische afkomst merkers herkennen: CD3, CD19, CD 11 c, CD 11 b, en Ter-119 Abs. De Abs worden toegevoegd in een volume van 2 pl / Ab de 30 pi celsuspensie in FACS-buffer.
- Incubeer de celsuspensie bij 4 ° C gedurende 30min. Na de incubatie, was de cellen tweemaal met 10 ml FACS-buffer zoals beschreven in stap 2.13.
- Resuspendeer cellen om een eindconcentratie van 4 x 10 7 cells/40 pi FACS-buffer bereiken. Voeg 20 ul van geit anti-rat IgG magnetische microbolletjes per elke 40 pi celsuspensie. Meng voorzichtig en incubeer bij 4 ° C 30 minuten. Was de cellen met 10 ml FACS-buffer zoals beschreven in stap 2.13.
- Resuspendeer tot 10 8 beenmergcellen in 500 ui FACS-buffer.
- Laad een MACS LD kolom op een MidiMACS celseparator instructies van de fabrikant en voorspoeling de kolom met 2 ml FACS-buffer.
- Breng het beenmerg celsuspensie op de kolom laden tot 5 x 10 8 cellen in 2,5 ml van FACS-buffer. Zorgen voor een verzameling buis (15 ml conische buis) in de kolom geplaatst. Was de kolom 3x met 2 ml FACS buffer / wasbeurt en verzamel de cellen die doorheen de kolom, die wordt verrijktlineage-negatieve cellen. Tel de cellen in het geëlueerde materiaal (was-through) van de kolom.
- Om positieve selectie van hematopoietische voorlopercellen subsets uitvoeren door FACS, vlek cellen met de volgende fluorescent geconjugeerde Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, plus een mengsel van afstamming marker Abs gericht tegen CD3, CD19, CD 11 c, CD11b, F4/80 en Ter119 (alle gelabeld met PerCP Cy5.5). Gebruik 0,5-1 ul van elk Ab in een totaal volume van 100 pl. Incubeer celsuspensie bij 4 ° C gedurende 20-30 minuten.
- Was de cellen zoals in stap 2.13 en resuspendeer in FACS buffer bij een concentratie van 2-3 x 10 7 cellen / ml. Filter cellen door een 35 uM cel zeef cap tube naar cel klonten te verwijderen. Deze laatste stap is cruciaal om te voorkomen dat verstopping van de FACS-machine.
- Plaats de celsuspensie in een FACS buis op de FACS podium en sorteren CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) op debasis van de aangegeven merkerprofiel. Verzamel gezuiverde cellen in een 15 ml buis met 5 ml compleet RPMI.
- Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen aan het einde van de FACS run. Pellet de cellen door centrifugatie zoals in stap 2.13 en resuspendeer in steriele PBS gedurende adoptieve overdracht experimenten.
4. Adoptieve overdracht van CDP
Deze stap wordt meestal gedaan in het dierenverblijf waar de ontvangende muizen gehuisvest. Afhankelijk van de locatie van de FACS gebruikt, kan dit transport van de gezuiverde voorlopercellen celpopulaties omvatten in het dierenverblijf voor adoptieve overdracht. Stamceltransplantatie schorsingen moeten steriel worden bewaard en vervoerd op ijs.
- Bereid celsuspensies voor injectie door verdunning 10 5 gezuiverd CDP in een totaal volume van 100 pi steriel PBS. Plaats celsuspensie in een injectiespuit bevestigd aan een 27 G naald.
- Expose de ontvanger IFNAR - / - +) een warmtelamp gedurende 5-10 minuten efficiënte injectie bereiken via staartader.
- Plaats de muis in een restrainer apparaat en te desinfecteren zijn staart met 70% ethanol.
- Injecteer 10 5 FACS-gezuiverd CDP's in 100 ul PBS in de staart ader met behulp van een 27 G naald.
- Monitor muizen voor 15-30 minuten om ervoor te zorgen dat er geen schadelijke effecten van de staart ader injectie. Terug muizen tot huisvesting faciliteit.
5. Isolatie van PP en waardering van pDC Bedragen
- Op 7-10 dagen na adoptieve overdracht, euthanaseren de ontvangende muizen. Open voorzichtig de muis door dissectie en de darm bloot.
- Verwijder de gehele darm en plaats het op PBS-doordrenkte papieren handdoeken. Verzamel alle zichtbare PP's langs de wand van de dunne darm met behulp van fijne tang en schaar. C57BL6 en IFNAR - / - muizen hebben gewoonlijk 5-10 PP / muis, die verschillen van geïsoleerde lymfefollikels gevonden zijnlangs de dunne darm 18. Merk op dat de PP's zijn vaak structureel verschillende zelfs binnen een enkele muis, zo zorgvuldig zorgen dat alle PP's worden geïdentificeerd en ontleed.
- Pps een petrischaal met PBS en een tang om ontlasting te verwijderen. Herhaal deze procedure twee keer te reinigen PP.
- Digest PP met 1 mg / ml collagenase IV in 10 ml 1 x Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een 50 ml kolf onder krachtig roeren gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Plaats het verteerde PP in het bovenste compartiment van een 40 um cel zeef en kracht cellen door zeef met een steriele spuit zuiger. Verzamel de PP celsuspensie in een 15 ml conische buis.
- Pellet gespannen PP cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 6 ml 37% Percoll-oplossing (37% Percoll in RPMI-medium). Plaats voorzichtig 6 ml 70% Percoll-oplossing (70% Percoll in RPMI medium) onder de celsuspensie, een Percoll stapgradiënt vormen.
- Centrifugeer cellen gedurende 20 min eent 800 xg met de centrifuge afbreken. Mononucleaire cellen migreren naar de 37/70% interface. Na centrifugatie dient de mononucleaire celpopulatie verzameld door voorzichtig pipetteren op het grensvlakgebied. Pellet cellen verzameld door centrifugatie en tweemaal wassen in 50 ml compleet RPMI / was. Een groot volume wordt gebruikt om volledige verwijdering te garanderen Percoll.
- Vlekken op de verzamelde PP cellen met de volgende antilichamen tegen muizen pDCs die voortvloeien uit de adoptief overgedragen voorlopercellen (CD45.1 +) of ontvangende muizen (CD45.2 +) op te sporen: CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) en PDCA-1 (FITC) Abs. Voer flowcytometrie analyse van PP cellen zoals aangegeven in stap 3.9 en 3.10. Identificeer pDCs door hun CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fenotype. PDC absolute getallen kan worden bepaald door de volgende vergelijking:% pDCs x teTal PP aantal cellen = PP pDCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze resultaten tonen de gating strategie voor de isolatie van CDP uit beenmergcellen van de muis (figuur 1), zoals beschreven in de Protocollen 2 en 3. CDP's bevatten ongeveer 0,1% van de totale beenmergcellen, en ongeveer 4-6 x 10 4 CDP's kunnen worden geïsoleerd van een muis. Bij adoptieve overdracht, CDPs differentiëren in pDCs en CDCs 10.
Figuur 1. Gating strategie voor FACS zuivering van CDP. Beenmergcellen werden verzameld uit C57BL6 muizen. Lineage-positieve cellen werden uitgeput met Abs tegen lineage markers (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) met behulp van MACS-microbead gemedieerde selectie. De verrijkte lineage-negatieve beenmerg bevolking werd gekleurd met fluorescent gelabelde Abs voor CDP en lineage markers, en gezuiverd door FACS zoals afgebeeld. aub klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Om pDCs in PPs identificeren, gebruiken we een eerste voorwaartse en zijwaartse verstrooiing gating strategie, gevolgd door gating voor CD 11 c + Siglec-H + cellen (Figuren 2A en 2B) IFNAR -. / - Muizen een significante vermindering pDCs van PPs opzichte wild-type muizen (Figuur 2B) 5. Daarentegen CD11c + Siglec-H - CDCs zijn te vinden op vergelijkbare bedragen in beide genotypen (Figuur 2B). Vandaar IFNAR - / - muizen bieden een kans om PP pDC reconstitutie te bespreken zonder effecten van dodelijke bestraling 5. Bijvoorbeeld, de adoptieve overdracht van wild type CDP in IFNAR - / - muizen, zoals beschreven in stap 4, stimuleert een toename van PP pDCs (figuur 2B). Bovendien voorbehandeling met Flt3L HGT (stap 1) verder verbeterd pDC expansie PPs (figuur 2B), implicerend overgedragen CDP en de mogelijkheid endogene Flt3 + voorlopers reageren Flt3L door het induceren PP pDCs. Beide voorwaarden stimuleerde ook CD11c + Siglec-H - CDCs bedragen, in overeenstemming met de ontwikkeling oorsprong van CDCs 6. pDCs in PPs uiten traditionele pDC markers inclusief PDCA-1, Siglec-H en de B220, en missen CD11b (figuren 2B-D) 4,5. Bovendien analyse van PPs van IFNAR - / - muizen die zowel Flt3L HGT ontvangen en overgedragen CDP bleek dat de meerderheid (~ 70%) van pDCs waren afkomstig van donor (CD45.1 +) muizen (figuur 2E). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat adoptieve overdracht van CDP induceert PP pDC bevolking in reactie op Flt3L-bemiddelde signalen in vivo.
inhoud "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
. Figuur 2 Analyse van PP pDC in IFNAR - / - muizen op Flt3L HGT en adoptieve overdracht van CDP IFNAR -. / - Muizen werden intraveneus geïnjecteerd met 5 ug van plasmide dat codeert Flt3L of een lege vector (Porf) door HGT. Twee dagen later werden 10 5-FACS gezuiverd CDPs adoptief overgedragen via staartaderinjectie. Zeven dagen na de CDP-overdracht, PP werden verzameld en geanalyseerd op pDC bedragen (A, B). CD 11 c + Siglec-H + pDCs in muizen die CDP + Flt3L HGT ontvangen werden verder geanalyseerd op PDCA-1, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 en CD45.2 (E) expressie. Het expressiepatroon van PDCA-1, B220 en CD11b was vergelijkbaar in alle pDCs in 3 groepen (dataniet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De adoptieve overdracht techniek hierin beschreven onderzocht de bijdrage van CDP aan de PP pDC bevolking in de ontvangende muizen die deficiënt zijn in PP pDCs zijn (bv. IFNAR - / - muizen). In toekomstige experimenten, zal het belangrijk zijn om de mogelijkheden van andere voorlopercellen subsets te evalueren in het genereren van PP pDCs, met name of PP pDCs ontlenen Flt3 + CLPs. Deze vraag is belangrijk, want het blijft onduidelijk waarom PP pDCs zijn uniek gevoelig voor IFNAR-STAT1 signalen voor PP opbouw 5, en als PP pDCs volgen soortgelijke ontwikkeling aanwijzingen als pDCs in andere organen.
In theorie zou deze werkwijze ook worden uitgevoerd in muizen die pDC populaties alle organen missen. Bijvoorbeeld, muizen met een tekort in de transcriptiefactor E2-2, de PDC "master regulator" (dwz TCF4 - / - muizen), tonen opvallende pDC uitputting 19. Echter, TCF4 - / - mice zijn embryonaal lethaal en dus TCF4 - / - beenmerg chimere muizen zou moeten worden gebruikt als recipiënten voor adoptieve overdracht experimenten. Het blijft echter onbekend of PP pDCs gevoelig voor straling en zou effectief waaruit TCF4 - / - chimeren. Bovendien dodelijke bestraling heeft brede gevolgen voor het hematopoietische systeem en ondersteunende stromale bevolkingsgroepen die mogelijk van invloed PP pDC reconstitutie. Zo is het gebruik van IFNAR - / - muizen als ontvangers het vermogen van adoptief overgedragen progenitor subsets PP pDCs genereren evalueren misschien voorkeur TCF4 - / -. chimeren Stat1 - / - muizen een opvallende vermindering van PP pDCs en kunnen worden gebruikt als ontvangers voor adoptieve overdracht studies studie PP pDC ontwikkelingsstoornissen oorsprong 5. Een nadeel van het gebruik van IFNAR - / - of Stat1 - / - muizen zijn immunodeficiënte toestand, which invloed kunnen PP pDC reconstitutie of functie in onbekende manieren. Zo zou onafhankelijke benaderingen van PP pDC ontwikkelingsstoornissen oorsprong beoordelen het vertrouwen in interpretatie van gegevens te verbeteren.
Technisch gezien moet worden opgemerkt dat de CDP bevolking gevonden op een zeer lage frequentie in totaal beenmerg, waardoor uitputting van afstammings marker-positieve cellen door magnetische bead-gemedieerde kolomchromatografie voor FACS is belangrijk voor een efficiënte zuivering van de progenitorcellen door FACS. Deze uitputting stap verrijkt lineage-negatieve cellen, wat resulteert in verminderde FACS tijd (en kosten) voor voorlopercellen zuivering. De afbrekende werkwijze hierin beschreven gebruikt een mengsel van afstammings-specifieke antilichamen die is gecombineerd voor elk experiment. Commercieel afstamming antilichaam cocktails zijn ook beschikbaar en kunnen worden gebruikt voor het verwijderen van afstammings-positieve cellen, in plaats van het mengsel die wij beschrijven. Het voordeel van de beschreven aanpak is de flexibiliteit in het zijn aanpasbaar voor DIFlende uitputting doeleinden, door instelling van de antilichamen die aanwezig zijn in het mengsel.
Bij de bereiding van enkelvoudige celsuspensies van PP, is het belangrijk om zoveel mogelijk van het intestinale weefsel rondom de PP mogelijk verwijderen. Dit kan worden bereikt door zorgvuldige dissectie van de PP. Voldoende vertering van PP met collagenase is een belangrijke stap om leukocyten te bevrijden van het darmweefsel. De Percoll dichtheid-gradiëntcentrifugering beschreven techniek is een aangewezen methode om leukocyten te verrijken uit verteerd PP monsters. Bovendien is het belangrijk op te merken dat de PDC merkereiwit PDCA-1 type I IFN en andere stimuli 20 worden geregeld. Daarom wordt Siglec-H voorkeur als een pDC marker voor studies met cytokine manipulatie.
Het gebruik van HGT heeft een duidelijk voordeel in termen van zeer kosteneffectief. Terwijl Flt3L HGT werd gebruikt in dit onderzoek, het vermogen van andere cytokinen of oplosbare factoren regUlate PP pDCs kon worden getest met behulp van HGT, in de afwezigheid of aanwezigheid van adoptieve cel overdracht van hematopoietische voorlopercellen. Echter, HGT leidt aanhoudende productie van cytokinen van de overgedragen plasmide versus meer tijdelijke toename waargenomen tijdens recombinant cytokine injectie, die afhankelijk cytokine halfwaardetijd 5,13. De grote hoogten circulerende cytokine mogelijk niet fysiologische bereikt tijdens noodsituaties hematopoietische of een infectie reacties bedragen. Deze waarschuwing moet in gedachten worden gehouden tijdens de experimentele planning en evaluatie van gegevens.
In de toekomst werken, selectieve manipulatie van de PP pDC bevolking, zoals hierin beschreven, kan helpen bij het aanpakken van PP PDC. PP pDCs worden geconditioneerd door bemiddelaars aanwezig in de mucosale milieu en hebben een tekort aan type I IFN productie op TLR activering 4,5. Analyse van PP pDCs opgelost binnen Stat1 - / - muizen toonde deze cells hebben een relatief laag vermogen om vorm te induceren I IFN op TLR9 triggering ten opzichte van PP pDCs voortvloeiende natuurlijk (niet getoond), wat aangeeft PP pDCs ontleend overgedragen CDPs tenminste deze eigenschap van natuurlijke PP pDCs behouden. De verminderde type I IFN productie van PP pDCs contrast met de robuuste type I IFN secretie van andere pDC bevolking en roept een vraag op over de functionele rol van PP pDCs. Bovendien PP pDCs lijken pDCs die zich ontwikkelen in de aanwezigheid van type I IFN, PDC bevolking die aantoont efficiënte stimulatie van IL-17 producerende CD4 + T-lymfocyten (Th17 cellen) 5. Terwijl Th17 cellen algemeen geacht een-inflammatoire inducerende bevolking, ze beschermend en pathogene rol in de darm 21. Afzonderlijk, zijn pDCs gemeld aan systemische tolerantie voor oraal toegediende antigeen 15 bemiddelen. De rol van PP pDCs in lokale en systemische immuniteit is van groot belang, zoals het begrijpen van dit punt kan ne onthullenw benaderingen intestinale immune en inflammatoire responsen in ziektetherapie manipuleren.
Concluderend, de hierin gepresenteerde methode kan de beoordeling van het vermogen van ontwikkeling van hematopoïetische voorlopercellen subsets voor het genereren PP pDCs. Deze procedure biedt muizen met gereconstitueerde PP pDCs. Aldus kan deze benadering worden gebruikt niet alleen voor het evalueren PP pDC hematopoietische oorsprong, maar ook voor het begrijpen van de bijdrage van PP pDCs immune functies binnen het intestinale milieu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Alex Gelbard en Willem Overwijk voor advies over hydrodynamische gentransfer. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (AI098099, SSW), het MD Anderson Cancer Center for Epigenetica, de MD Anderson Centrum voor kanker en inflammatie (SSW), en de RE Bob Smith Fund Onderwijs (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
