Summary
Denne protokollen beskriver eksperimentelle prosedyrer for å vurdere differensiering av plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer patch fra vanlige dendrittiske cellen stamfedre, ved hjelp av teknikker som involverer FACS-mediert celle isolasjon, hydrodynamisk genoverføring, og strømningsanalyse av immun undergrupper i Peyer patch.
Abstract
Denne protokollen detaljer en fremgangsmåte til å analysere evnen til renset hematopoetiske stamceller for å generere dendrittiske celler plasmacytoid (PDC) i tarmen Peyer patch (PP). Vanlige dendrittiske cellen stamfedre (CDPs, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) ble renset fra benmargen av C57BL6 mus ved FACS og overført til mottaker mus som mangler en betydelig PDC befolkningen i PP, i dette tilfellet, IFNAR - / - mus ble benyttet som overføringsmottakere. I noen mus, ble overekspresjon av den dendrittiske cellen vekstfaktor Flt3 ligand (Flt3L) håndheves før adoptiv overføring av CDPs, ved hjelp av hydrodynamisk genoverføring (HGT) av Flt3L-koding plasmid. Flt3L overekspresjon utvider DC populasjoner som stammer fra overført (eller endogene) blodkreft stamceller. På 7-10 dager etter stamfar overføring, ble PDCs som oppstår fra de adoptively overført progenitors skilles fra mottakercellene pågrunnlag av CD45 markør uttrykk, med PDCs fra overførte CDPs være CD45.1 + og mottakere blir CD45.2 +. Muligheten av overførte CDPs å bidra til PDC-populasjonen i PP og til å reagere på Flt3L ble evaluert ved strømningscytometri for PP enkeltcellesuspensjoner fra mottaker mus. Denne metoden kan benyttes til å teste om andre progenitor populasjoner er i stand til å generere PP PDCs. I tillegg kan denne tilnærming brukes til å undersøke rollen til faktorer som er anslått til å påvirke utvikling PdC i PP, ved å overføre progenitor delmengder med en passende knockdown, utstansing eller overekspresjon av de putative utviklingsfaktor og / eller ved å manipulere sirkulerende cytokiner via HGT . Denne metoden kan også tillate analyse av hvordan PP PDCs påvirke frekvensen eller funksjon av andre immun undergrupper i PP. Et unikt trekk ved denne metode er bruken av IFNAR - / - mus, som viser sterkt utarmet PP PDCs i forhold til vill-type dyr, og dermed allowing tilberedning av PP PDCs i fravær av konfunderende effekter av dødelig bestråling.
Introduction
Her viser vi en protokoll for å vurdere om felles dendrittiske cellen stamfedre (CDPs) er i stand til å gi opphav til plasmacytoid dendrittiske cellen (PDC) befolkningen i Peyer patch (PP). Det overordnede målet med denne metoden var å evaluere utviklings regulering av PDCs i Peyer patch (PP PDCs). Grunnen til at dette er viktig er at PP PDCs avvike fra PDCs funnet i andre vev, inkludert beinmarg, blod og milt, og derfor er det uklart om PP PDCs og andre PDC bestandene er utviklingshemmede og / eller funksjonelt beslektet. Spesielt er PDCs viden kjent for å være den viktigste type I interferon (IFN) produsenter innen blodkreft systemet, svarer til Toll-like receptor 7 og 9 (TLR7 / 9) stimulering av rask IFN sekresjon 1-3. Imidlertid PP PDCs er mangelfull produksjon av type I IFN som reaksjon på TLR agonist stimulering 4,5. Videre PP PDCs også avvike fra PDCs funnet i benmarg og milt ikrever signaler fra type I interferon (IFN)-reseptor (IFNAR1) eller IFN signale molekyl STAT1 for deres utvikling og / eller akkumulering 5. Disse data har antydet muligheten for at forskjellige reguleringsmekanismer styre PP PDCs versus PDCs i andre organer (f.eks benmarg, milt) 5.
Begrunnelsen som førte til utviklingen av denne metoden var basert på nyere fremskritt i forståelsen av dendrittiske celler (DC) biologi. De fleste, om ikke alle, DC undergrupper stammer fra hematopoetiske stamceller som uttrykker den fms-lignende tyrosin-kinase-3-reseptor (Flt3) 6-10, men er like utvikling ikke er begrenset til de klassiske myeloid-og lymfoide trasé. For eksempel, FLT3 + felles myeloide stamceller (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) gi opphav til CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), hh ytterligere differensiere i PDCs og konvensjonelle DCs (CDCS) 9,10. I motsetning Flt3 + felles lymfoide stamceller (CLPs, LIN - IL-7R + Sca-en lo c-kit lo) utvikler primært inn PDCs 11. Derfor er tidligere studier indikerer PDCs oppstår fra minst 2 forskjellige hematopoietiske progenitor populasjoner under regulering av Flt3L, selv om den typisk analyse har vært begrenset til benmarg, milt-og / eller blod PDC undergrupper. Dermed kreves stamfar befolkningen (e) som genererer PP PDCs etterforskning. Forstå opprinnelsen til PP PDCs vil belyse om de har felles utviklingsforløp med andre PDC populasjoner, eller benytte forskjellige mekanismer i løpet av sin generasjon i PP.
En unik fordel med den metode som her er beskrevet er anvendelse av mus som viser en alvorlig mangel i PP PDCs som mottakere for adoptiv overføring av hematopoetiske stamceller. Mus med genettic sletting i genet som koder IFNAR1 (IFNAR - / - mus) eller STAT1 (STAT1 - / -) avslørte en slående uttømming i PP PDCs fem. Derfor er disse stammer gi et miljø hvori PP PDCs er redusert, slik at adoptive overførings undersøkelser som skal utføres i fravær av potente celle ablasjon regimer som letal bestråling. En ytterligere styrke av fremgangsmåten presentert her er bruken av hydrodynamisk genoverføring (HGT) for å stimulere forhøyede sirkulerende mengder av Flt3L. Dette gir en kostnadseffektiv metode for å indusere Flt3L in vivo, sammenlignet med injeksjon av rekombinant protein. Tallrike studier, inkludert de i vår lab, har ansatt HGT å indusere cytokin mengder i en rekke eksperimentelle forhold 5,12,13.
Arbeidsdelingen og presise immunfunksjoner for DCs er av stor interesse for immunologi. Spesielt PDCs er viktige mediatorer av oral toleranse og systemisk anti-viralsvar, men de synes også å bidra til utvikling og utholdenhet av autoimmunitet og kreft 14-17. Den protokoll som er beskrevet heri vil tillate den utviklingsmessige mekanismene som regulerer PP PDCs vil bli mer fullstendig utforsket. I tillegg kan denne tilnærming tillater undersøkelser for å vurdere PP PDC-funksjonen, og kan forlenges til å forstå regulering og funksjon av andre immun populasjoner i PP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institusjonell godkjennelse må innhentes på forhånd for alle eksperimentelle manipulasjoner beskrevet her involverer mus. Disse inkluderer bruk av C57BL6 mus for isolering av stamceller i benmarg, IFNAR - / - mus som mottakere for adoptiv overføring av blodkreft stamceller og bruk av HGT for cytokin overekspresjon in vivo. Egnede boliger og dyr omsorg må også gis av utprøver eller institusjon. Videre kan institusjonelle godkjennelse være nødvendig for plasmidene som brukes i hydrodynamisk genoverføring (dvs. rekombinant DNA-godkjennelse). Studiene er beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UT MD Anderson Cancer Center.
En. Hydrodynamisk Gene Transfer (HGT)
Dette trinnet skal utføres to dager før adoptiv overføring av CDPs å indusere sirkulerende Flt3L for DC ekspansjon in vivo fem. Prepare minst fem mottaker mus / gruppe.
- For å oppnå effektiv HGT, blodårene til mottakeren IFNAR - / - bør mus (CD45.2 +) skal utvides ved å utsette musene til en varmelampe for 5-10 min.
- Plasser musen i en rainer enhet og desinfisere halen med 70% etanol.
- Injiser 5 pg av plasmid som koder Flt3L i 2 ml sterilt PBS inn i halevenen ved bruk av en 27 G nål. For med kontrollgruppen, injiserer 5 ug tom vektor (pORF) via halevenen som angitt.
- Overvåk mus i 15-30 min for å sikre at det ikke er noen skadelige effekter av haleveneinjeksjon. Returner mus til bolig anlegg for 2 dager.
2. Isolering av Hematopoietiske stamfedre fra benmarg fra mus
Dette trinnet skal utføres to dager etter HGT. Bruk congenic CD45.1 + mus som kilden til benmargsstamfedre for adoptiv overføring til mottaker IFNAR - /- dyr (CD45.2 +). I denne protokollen, congenic stammer som kreves for å skille donor-og mottaker-avledet DC, så vel som for å unngå immunmediert uttømming grunn av MHC mismatch. Omtrent 10-20 mus vil være nødvendig for å gi tilstrekkelig antall blodkreft stamceller (10 5 celler / mottaker mus) for overføring eksperimenter.
- Avlive 10 congenic CD45.1 + mus ved CO 2 kvelning og halshugging.
- Plasser hvert kadaver på en disseksjon skuffen og sterilisere magen og beina med 70% etanol.
- Gjør et snitt på midten av magen og skjære gjennom huden fra magen til hver fot, kutte huden ned lengden på beinet.
- Forsiktig fjerne hud fra hver etappe, og kutte og fjerne beina fra kadaveret på hofteleddet ved hjelp av skarp saks.
- Fjern forsiktig musklene fra femur og tibia av hvert ben med en skarp kniv.
- Fjernbegge ender av femur og tibia med en skarp skalpell og plassere ben i en dyrkningsskål inneholdende komplett RPMI (RMPI med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, 1 mM natrium-pyruvat og 50 uM β-mercaptoethanol) .
- Forbered en sprøyte som inneholder en ml komplett RPMI, koblet til en 27 G nål.
- Sett 27 G nål inn i den ene enden av femur eller tibia. Skyll beinmarg fra femur eller tibia ved forsiktig å injisere hele RPMI i beinet. Sørg for at benmargceller blir fjernet fra benet, og dette kan gjøres ved visuell gjenkjenning utvist media som vises skyet.
- Gjenta spyle hver femur og tibia 3x å grundig fjerne celler fra beinmargen.
- Forbered en enkelt celle suspensjon ved forsiktig pipettering celler opp og ned 3-5x i kulturen fatet.
- Fjern rusk ved å sende benmargceller gjennom en 40 mikrometer celle sil, plassere de utstrålte celler inn i et nytt kulturelte fatet. Forstyrre eventuelle celle klumper som vises på silen ved milde press med enden av en steril sprøytestempelet.
- Lyser de røde blodceller (RBC) presenterer i total benmarg cellesuspensjon med kommersiell RBC buffer per produsentens instruksjoner. Bruk 2 ml RBC buffer/4-6 x 10 7 celler (generelt celler fra en mus) og en inkubasjonstid på 5 min ved RT.
- Vask benmargceller ved å pelletere cellene ved sentrifugering i 4 minutter ved 500 xg, forsiktig aspirering av kulturmediet, resuspendere i 10 ml FACS-buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), granulatorer cellene ved sentrifugering og aspirering forsiktig vask buffer.
- Gjenta vasketrinn, som beskrevet i trinn 2.13, for en total av to vaskinger.
Tre. Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) å isolere CDPs
Dette trinnet krever tilgang til et MidiMACS celleseparator og MACS LD kolonner for en innledende negativ utvelgelsesprosedyre,samt en FACS-maskin med i det minste tre lasere for å rense flerfarget progenitor delsett etter farging med fluorescently konjugerte antistoffer.
- Etter den andre vask i trinn 2.14, telle benmargceller. Pellet cellene ved sentrifugering som beskrevet i trinn 2.13 og resuspender i FACS-buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 4 x 10 7 celler pr 30 ul FACS-buffer.
- For å fremstille celler for FACS, er lineage-negative celler først anriket av en negativ seleksjon teknikk som fjerner lineage-positive celler fra benmargen blandingen magnetiske kuler kolonnekromatografi under anvendelse av. For den negative utvelgelsesprosedyren, tilsett 1 pg av hver av de følgende handels rotte anti-mus antistoffer (ABS) som gjenkjenner hematopoetiske avstamning markører: CD3, CD19, CD11c, CD11b, og Ter-119 Abs. De Abs skal tilsettes i et volum på 2 mL / Ab til 30 pl cellesuspensjon i FACS-buffer.
- Inkuber cellesuspensjonen ved 4 ° C i 30min. Etter inkubering vaskes cellene to ganger med 10 ml FACS-buffer som beskrevet i trinn 2.13.
- Resuspender cellene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 4 x 10 7 cells/40 pl av FACS-buffer. Tilsett 20 ul geite-anti-rotte IgG-magnetiske mikroperler pr hver 40 ul av cellesuspensjonen. Bland forsiktig og inkuber ved 4 ° C i 30 min. Vask cellene med 10 ml FACS-buffer som beskrevet i trinn 2.13.
- Suspender opp til 10 8 benmargsceller i 500 mL av FACS buffer.
- Legg i en MACS LD kolonne på en MidiMACS celleseparator per produsentens instruksjoner og prerinse kolonnen med 2 ml FACS buffer.
- Påfør benmargscellesuspensjon til kolonnen, laster opp til 5 x 10 8 celler i 2,5 ml FACS-buffer. Sikre en samling rør (15 ml konisk rør) plasseres under kolonnen. Vask kolonnen med 3 x 2 ml FACS-buffer / vask, og samle cellene som passerer gjennom kolonnen, noe som vil bli anriket forLineage-negative celler. Tell cellene i materialet eluerte (vaske-through) fra kolonnen.
- For å utføre positiv utvelgelse av blodkreft progenitor undergrupper av FACS, flekk celler med følgende fluorescently konjugert Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-en (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, pluss en blanding av avstamning markør Abs rettet mot CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 og Ter119 (alle merket med PerCP Cy5.5). Bruk 0,5-1 mL av hver Ab i et totalt volum på 100 mL. Inkuber cellesuspensjonen ved 4 ° C i 20-30 min.
- Vask celler som indikert i trinn 2.13 og resuspender i FACS-buffer ved en konsentrasjon på 2-3 x 10 7 celler / ml. Filter celler gjennom en 35 mikrometer celle sil cap tube å fjerne celleklumper. Det siste trinnet er avgjørende for å unngå clogging FACS maskinen.
- Plasser cellesuspensjonen i en FACS rør på FACS scenen og sortere CDPs (LIN - c-kit lo CD115 + Flt3 +) pågrunnlag av den indikerte da profilen. Samle rensede celler i et 15 ml rør inneholdende 5 ml RPMI komplett.
- Ta opp det absolutte antall sorterte cellene ved slutten av FACS løp. Pellet cellene ved sentrifugering slik det er angitt i trinn 2.13 og resuspender i steril PBS for adoptive overføringsforsøk.
4. Adoptiv overføring av CDPs
Dette trinnet er vanligvis gjort i dyret anlegget der mottaker mus er plassert. Avhengig av plasseringen av FACS-maskin, kan det innebære transport av de rensede stamcellepopulasjoner i dyret innretningen før adoptiv overføring. Progenitor-cellesuspensjoner bør holdes sterilt og transportert på is.
- Forbered cellesuspensjoner til injeksjon ved å fortynne 10 5 rensede CDPs i et totalvolum på 100 ul steril PBS. Plasser cellesuspensjon i en sprøyte festet til en 27 G nål.
- Expose mottakeren IFNAR - / - +) til en varmelampe for 5-10 minutter for å oppnå effektiv injeksjon via halevenen.
- Plasser musen i en rainer enhet og desinfisere halen med 70% etanol.
- Injiser 10 5 FACS-rensede CDPs i 100 pl PBS inn i halevenen ved bruk av en 27 G nål.
- Overvåk mus i 15-30 min for å sikre at det ikke er noen skadelige effekter av haleveneinjeksjon. Returner mus til boliger anlegget.
5. Isolering av PP og måling av PDC Beløp
- På 7-10 dager etter adoptiv overføring, avlive mottaker mus. Åpne forsiktig musen ved disseksjon og avsløre tarmen.
- Fjerne hele tarmen og legg den på PBS-gjennomvåt papirhåndklær. Samle alle synlige PP langs veggen av tynntarmen ved hjelp av fin pinsett og sakser. C57BL6 og IFNAR - / - mus har vanligvis 5-10 PP / mus, som er forskjellig fra isolerte lymfoide follikler funnetlangs tynntarmen 18.. Merk at PPS er ofte strukturelt distinkt selv innenfor en enkelt mus, så nøye at alle PPs blir identifisert og dissekert.
- Plasser PP i en petriskål inneholdende PBS, og bruke tenger for å fjerne avføring. Gjenta denne prosedyren to ganger for å rengjøre PPs.
- Digest PP med 1 mg / ml collagenase IV i 10 ml 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS) i en 50 ml kolbe under kraftig omrøring i 1 time ved 37 ° C.
- Plasser fordøyd PP i det øverste rommet av en 40 mikrometer celle sil og tvinge cellene gjennom sil med en steril sprøytestempelet. Samle PP cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør.
- Pellet anstrengt PP-celler ved sentrifugering ved 500 xg i 5 minutter og resuspender i 6 ml 37% Percoll-løsning (37% Percoll i RPMI medium). Stikk forsiktig med 6 ml 70% Percoll-løsning (70% Percoll i RPMI medium) på undersiden av cellesuspensjonen, for å danne en Percoll trinngradient.
- Sentrifuger cellene i 20 min ent 800 xg med sentrifugen bryte av. Mononukleære celler vil migrere til 37/70%-grensesnitt. Etter sentrifugering, bør det mononukleære cellepopulasjon bli samlet ved forsiktig pipettering ved grenseflateområde. Pellet som samles cellene ved sentrifugering og vaskes to ganger i 50 ml komplett RPMI / vask. Et stort volum er brukt for å sikre fullstendig fjerning av Percoll.
- Flekk de innsamlede PP-celler med følgende antistoffer å oppdage murine PDCs som stammer fra de adoptively overført stamfedre (CD45.1 +) eller mottaker mus (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) og PDCA-en (FITC) Abs. Utfør flowcytometri analyse av PP-celler som er angitt i trinn 3,9 og 3,10. Identifiser PDCs av deres CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fenotype. Absolutte PDC tall kan bestemmes av følgende ligning:% PDCs x tiltal PP celle nummer = PP PDCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre resultater viser at portstyringsstrategi for isolering av CDPs fra musebenmargceller (figur 1), som beskrevet i protokoller 2 og 3. CDPs utgjør omtrent 0,1% av de totale benmarg-celler, og omtrent 4-6 x 10 4 CDPs kan bli isolert fra en mus. Ved adoptiv overføring, CDPs differensiere i PDCs og CDCS 10.
Figur 1. Gating strategi for FACS rensing av CDPs. Benmargceller ble samlet inn fra C57BL6 mus. Lineage-positive celler ble tømt med Abs mot avstamning markører (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) bruker MACS microbead-mediert utvalg. Den beriket avstamning-negative benmarg befolkningen var farget med fluorescently-merket Abs for CDP og avstamning markører, og renset ved FACS som vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Å identifisere PDCs i PP, bruker vi en innledende frem og side scatter gating strategi, etterfulgt av gating for CD11c + Siglec-H + celler (figur 2A og 2B) IFNAR -. / - Mus har en betydelig reduksjon i PDCs i PP i forhold til villtype mus (figur 2B) 5. I motsetning CD11c + Siglec-H - CDCS er funnet på tilsvarende beløp i begge genotyper (Figur 2b). Derfor IFNAR - / - mus gir en mulighet til å undersøke PP PDC tilberedning uten effekter av dødelig stråling fem. For eksempel den adoptive overføring av villtype CDPs inn IFNAR - / - mus, som beskrevet i trinn 4, stimulerer en økning i PP PDCs (figur 2B). Videre forbehandling med Flt3L HGT (trinn 1) ytterligere forbedret PDC ekspansjon i PPs (figur 2B), noe som tyder på overførte CDPs og mulighet endogene FLT3 + stamfedre svare på Flt3L ved å fremkalle PP PDCs. Begge forholdene også stimulert CD11c + Siglec-H - CDCS utgjør, i samsvar med den utviklingsmessige opprinnelse CDCS seks. PDCs i PPs uttrykke tradisjonelle PDC markører inkludert PDCA-en, Siglec-H og B220, og mangler CD11b (Tall 2B-D) 4,5. I tillegg er analysen av PP fra IFNAR - / - mus som fikk både Flt3L HGT og overført CDPs viste at de fleste (~ 70%) av PDCs var avledet fra donor (CD45.1 +) mus (figur 2E). Sammen er disse data viser at adoptiv overføring av CDPs induserer PP PDC-populasjonen i respons til Flt3L-medierte signaler in vivo.
innhold "fo: keep-together.within-page =" always ">
. Figur 2 Analyse av PP PDC i IFNAR - / - mus ved Flt3L HGT og adoptiv overføring av CDPs IFNAR -. / - Mus ble injisert intravenøst med 5 mikrogram av plasmid koding Flt3L eller en tom vektor (pORF) av HGT. To dager senere ble 10 5 FACS-renset CDPs adoptively overført via halevenen injeksjon. Syv dager etter CDP overføring, ble PP som samles inn og analyseres for PDC mengder (A, B). CD11c + Siglec-H + PDCs i mus som fikk CDPs + Flt3L HGT ble videre analysert for PDCA-en, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 og CD45.2 (E) uttrykk. Uttrykket mønster av PDCA-en, B220 og CD11b var lik i PDCs i alle tre gruppene (dataikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adoptivoverføringsteknikk beskrevet her vurderes bidraget av CDPs til PP PDC befolkningen i mottaker mus som er mangelfull i PP PDCs (f.eks IFNAR - / - mus). I senere eksperimenter, vil det være viktig å vurdere potensialet i andre progenitor undergrupper i generere PP PDCs, særlig hvorvidt PP PDCs utlede fra FLT3 + CLPs. Dette spørsmålet er viktig siden det er fortsatt uklart hvorfor PP PDCs er unikt følsomme for IFNAR-STAT1 signaler for PP opptjening 5, og hvis PP PDCs følger lignende utviklings signaler som PDCs i andre organer.
I teorien kan denne metoden også bli utført i mus som mangler PDC populasjoner i alle organer. For eksempel mus med mangel på transkripsjonsfaktor E2-2, PDC "master regulator" (dvs. Tcf4 - / - mus), viser slående PDC uttømming 19. Men Tcf4 - / - mice er i sin spede dødelig, og dermed Tcf4 - / - beinmarg kimære musene ville trenge for å bli brukt som mottakere for adoptiv overføring eksperimenter. Imidlertid er det fortsatt ukjent om PP PDCs er følsomme for stråling og ville være effektivt tømt i Tcf4 - / - chimeras. Videre har dødelig bestråling brede effekter på blodkreft system og støtter stromal populasjoner som kan påvirke PP PDC tilberedning. Således, ved bruk av IFNAR - / - mus som mottakere for å vurdere evnen til adoptively overført progenitor undergrupper å generere PP PDCs kan bli foretrukket til Tcf4 - / -. chimeras STAT1 - / - mus viser også en slående reduksjon i PP PDCs og kunne brukes som mottakere for adoptivoverføringsstudier til Studien PP PDC utviklings opprinnelse fem. En påminnelse til bruk av IFNAR - / - eller STAT1 - / - mus er deres immunodeficient status, noe som tilsvarerlm kunne påvirke PP PDC tilberedning eller funksjon i ukjente måter. Dermed ville uavhengige tilnærminger for å vurdere PP PDC utviklings opprinnelse styrke tilliten til tolking.
Teknisk sett bør det bemerkes at CDP populasjonen er funnet at en meget lav frekvens i total benmarg, således uttømming av lineage markør-positive celler magnetiske kuler-mediert kolonnekromatografi før FACS ved er viktig for en effektiv rensing av progenitorcellene ved FACS. Denne utarmingen trinnet beriker avstamning-negative celler, noe som resulterer i redusert FACS tid (og kostnadene) på stamcelle rensing. Den nedbrytende fremgangsmåte som er beskrevet heri anvender en blanding av lineage-spesifikke antistoffer som er kombinert for hvert eksperiment. Kommersielle avstamning antistoff cocktails er også tilgjengelige og kan brukes for fjerning av lineage-positive celler, i stedet for den blanding som vi beskrive. Fordelen med den beskrevne metoden er dens fleksibilitet i å være tilpasningsdyktig for diflige uttømming formål, ved å justere de antistoffene som er tilstede i blandingen.
Ved fremstilling av enkeltcellesuspensjoner fra PP, er det viktig å fjerne så mye av tarmvevet som omgir PP som mulig. Dette kan oppnås ved forsiktig disseksjon av PP. Tilstrekkelig fordøyelse av PPs med collage er et viktig skritt for å frigjøre leukocytter fra tarmvevet. Den Percoll densitet-gradientsentrifugering teknikk som er beskrevet er en foretrukket metode for å berike leukocytter fra fordøyd PP prøver. I tillegg er det viktig å merke seg at PDC markørprotein pdca-1 kan reguleres av type I-IFN og andre stimuli 20.. Derfor er Siglec-H foretrukket som en PDC markør for studier som involverer cytokin manipulasjon.
Bruken av HGT har en klar fordel i forhold til å være svært kostnadseffektivt. Mens Flt3L HGT ble benyttet i denne studien, til evnen til andre cytokiner eller løselige faktorer regUlate PP PDCs kunne bli testet ved hjelp HGT, i fravær eller tilstedeværelse av adoptiv celle overføring av blodkreft stamceller. Imidlertid resulterer HGT i vedvarende produksjon av cytokiner fra de overførte plasmid versus flere forbigående økning observert i løpet av rekombinant cytokin injeksjon, som er avhengig av cytokin halveringstid 5,13. Den utvidede heving av sirkulerende cytokin ikke nødvendigvis den fysiologiske mengder oppnådd i løpet av akutt blodkreft eller infeksjon svar. Dette forbeholdet bør holdes i bakhodet under eksperimentelle planleggingsfasen og vurdering av data.
I det videre arbeidet, selektiv manipulering av PP PDC populasjonen, som beskrevet heri, kan hjelpe til å ta opp PP PDC funksjon. PP PDCs er betinget av mediatorer er tilstede i mucosal miljøet og er mangelfull i type I IFN produksjon ved TLR aktiverings 4,5. Analyse av PP PDCs rekonstituert innenfor STAT1 - / - mus demonstrerte disse cells har en forholdsvis lav evne til å fremkalle type I-IFN på TLR9 utløsende forhold til PP PDCs som oppstår naturlig (ikke vist), noe som viser PP PDCs avledet fra overførte CDPs beholde i det minste denne egenskap ved naturlig PP PDCs. Den reduserte type I IFN produksjon av PP PDCs kontraster med robust type I IFN sekresjon av andre PDC populasjoner og reiser et spørsmål om funksjonell rolle PP PDCs. Videre PP PDCs likne PDCs som utvikler i nærvær av type I IFN, PDC befolkning som demonstrerer effektiv stimulering av IL-17-produserende CD4 + T-lymfocytter (Th17 celler) 5. Mens Th17 celler er allment ansett for å være en betennelsesfremkallende befolkning, har de både verne-og sykdomsfremkallende roller i tarmen 21. Hver for seg har PDCs blitt rapportert å megle systemisk toleranse for oralt administrert antigen 15. Rollen til PP PDCs i lokal og systemisk immunitet er av betydelig interesse, som å forstå dette punktet kan avsløre new tilnærminger å manipulere tarmens immun og inflammatoriske responser i sykdomsbehandling.
Konklusjonen er at fremgangsmåten som presenteres her muliggjør evaluering av den utviklingspotensial på hematopoietiske progenitor undergrupper for generering PP PDCs. Denne fremgangsmåten gir mus med rekonstituert PP PDCs. Således kan denne tilnærming brukes ikke bare for å evaluere PP PDC hematopoetiske opphav, men også for å forstå bidraget av PP PDCs å immunfunksjoner innenfor tarm-miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker legene. Alex Gelbard og Willem Overwijk for råd om hydrodynamisk genoverføring. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (AI098099, SSW), MD Anderson Center for Cancer epigenetikk, MD Anderson Center for Betennelse og kreft (SSV), og RE Bob Smith Education Fund (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
