Summary
פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.
Abstract
פרוטוקול זה מפרט שיטה לנתח את היכולת של אבות היווצרות הדם מטוהרים כדי ליצור תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) בתיקון של Peyer מעיים (PP). אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs, לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +) היו מטוהרים ממח העצם של עכברי C57BL6 ידי FACS והועברו לעכברי נמען שאין אוכלוסיית PDC משמעותית בPP, במקרה זה, Ifnar - / - עכברים שימשו כמקבלי העברה. בחלק מהעכברים, ביטוי יתר של גורם גדילה ליגנד תאים דנדריטים FLT3 (Flt3L) נאכף לפני מאמצי העברת CDPs, באמצעות העברת גנים הידרודינמית (HGT) של פלסמיד Flt3L הקידוד. ביטוי יתר Flt3L מרחיב אוכלוסיות DC מקורם אבות הועברו (או אנדוגני) hematopoietic. ב7-10 ימים לאחר העברת אב, pDCs שעולה מהאבות העבירו adoptively נבדלו מתאי נמען עלבסיס של ביטוי סמן CD45, עם pDCs מCDPs הועבר להיות CD45.1 + ומקבלי להיות + CD45.2. היכולת של CDPs הועבר לתרום לאוכלוסיית PDC בPP ולהגיב לFlt3L הוערכה על ידי cytometry זרימה של השעיות תא בודדות PP מעכברי נמען. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק אם אוכלוסיות אב אחרות הן מסוגלים לייצר PP pDCs. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התפקיד של גורמים שהם חזו להשפיע על התפתחות PDC בPP, על ידי העברה תת אב עם מציאה מתאימה, נוקאאוט או ביטוי יתר של הגורם ו / או התפתחותי המשוערת על ידי מניפולציה ציטוקינים במחזור באמצעות HGT . שיטה זו גם עשויה לאפשר ניתוח של כמה pDCs PP משפיע על התדירות או פונקציה של תת חיסון אחר בPPS. תכונה ייחודית של שיטה זו היא השימוש בIfnar - / - עכברים, אשר מראה מדולדל קשות ביחס PP pDCs לבעלי חיים מסוג בר, ובכך allowiהכינון מחדש ng של PP pDCs בהעדר תופעות של בלבול מקרינה קטלנית.
Introduction
הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול להעריך האם אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs) מסוגלים לתת עלייה לתאים דנדריטים plasmacytoid אוכלוסייה (PDC) בתיקון של Peyer (PP). המטרה הכללית של שימוש בשיטה זו הייתה להעריך את הרגולציה ההתפתחותי של pDCs בתיקון של Peyer (PP PDC). מהסיבה זו חשובה היא שpDCs PP שונה מpDCs נמצא ברקמות אחרות, כוללים מח עצם, דם וטחול, ולכן לא ברור אם pDCs PP ואוכלוסיות PDC אחרות הן מבחינה התפתחותית ו / או תפקודי בנושא. באופן ספציפי, pDCs ידוע נרחב על היותו הסוג העיקרי אני אינטרפרון מפיקים (IFN) בתוך מערכת hematopoietic, בתגובה לחיוג כמו קולטן 7 ו 9 גירוי (TLR7 / 9) על ידי מהיר IFN ההפרשה 1-3. יחד עם זאת, pDCs PP חסר בייצור הסוג אני IFN בתגובה לגירוי 4,5 אגוניסט TLR. זאת ועוד, PP pDCs גם שונה מpDCs נמצא במח עצם וטחול בהדורש אותות מהסוג אני אינטרפרון רצפטור (IFN) (IFNAR1) או IFN איתות STAT1 מולקולה לפיתוח ו / או ההצטברות 5 שלהם. נתונים אלה הציעו את האפשרות שמנגנוני פיקוח שונים לשלוט pDCs PP לעומת pDCs באיברים אחרים (למשל מח עצם, טחול) 5.
הרציונל שהוביל לפיתוחה של שיטה זו היה מבוסס על ההתקדמות בהבנת ביולוגיה של תאים דנדריטים (DC). רוב, אם לא כולם, תת DC נובעים מאבות hematopoietic המבטאים את FMS-כמו טירוזין קינאז 3 קולט (FLT3) 6-10, עם זאת, פיתוח DC אינו מוגבל למיאלואידית הקלאסית ומסלולי הלימפה. לדוגמא, + אבות FLT3 נפוצים מיאלואידית (CMPs, לין - IL-7R - SCA-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) להצמיח CDPs (לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +), אשרשעות נוספות להבדיל לpDCs וDCs הקונבנציונלי (cDCs) 9,10. לעומת זאת, FLT3 + אבות הלימפה נפוצים (CLPs, לין - והנה + SCA-1 lo c-kit IL-7R) לפתח בעיקר לpDCs 11. לכן, מחקרים קודמים מצביעים על pDCs לנבוע מלפחות 2 אוכלוסיות אבות היווצרות הדם נפרדות לפי תקנה של Flt3L, אם כי הניתוח הטיפוסי הוגבל למח עצם, הטחול ו / או תת PDC הדם. לכן, אוכלוסיית האב (ים) שיוצרת PP pDCs נדרשת חקירה. הבנת מקורותיה של PP pDCs תשפוך אור על השאלה האם הם חולקים מסלולים התפתחותיים משותפים עם אוכלוסיות PDC אחרות, או לנצל את המנגנונים שונים בדורם בPP.
יתרון ייחודי של הגישה המתוארת כאן הוא השימוש בעכברים מראים כי מחסור חמור בPP pDCs כנמענים להעברת המאמצת של אבות היווצרות הדם. עכברים עם גןמחיקת טיק בגן המקודד IFNAR1 (Ifnar - / - עכברים) או STAT1 (Stat1 - / -) גילתה דלדול בולט בPP pDCs 5. לכן, זנים אלה מספקים סביבה שבה pDCs PP מופחתים, המאפשרים לימודי העברת מאמצת שיש לבצע בהיעדר משטרי אבלציה הסלולרי חזקים כמו קרינה קטלנית. כוח נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש בהעברת גנים הידרודינמית (HGT) כדי לעורר את הכמויות במחזור גבוהות של Flt3L. זה מספק גישה יעילה עלות לגרום Flt3L in vivo, לעומת הזרקה של חלבון רקומביננטי. מחקרים רבים, כוללים אלה במעבדה שלנו, יש מועסקי HGT לגרום כמויות ציטוקינים במגוון רחב של תנאי ניסוי 5,12,13.
חלוקת העבודה ותפקידים חיסוניים מדויקים לDCS היא עניין המרכזי באימונולוגיה. בפרט, pDCs הם מתווכים חשובים של סובלנות אוראלית ואנטי ויראלית המערכתיתתשובות, ובכל זאת הם מופיעים גם לתרום לפיתוח וההתמדה של אוטואימוניות והסרטן 14-17. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר למנגנוני התפתחות ויסות PP pDCs כדי להיחקר באופן מלא יותר. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר מחקרים כדי להעריך את תפקוד PP PDC, וניתן להארכה להבנת הוויסות והתפקוד של אוכלוסיות אחרות של מערכת חיסון בתוך PPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
יש לקבל את האישור מוסדי מראש לכל מניפולציות הניסוי שתוארו במסמך זה כרוך בעכברים. אלה כוללים שימוש בעכברי C57BL6 לבידוד של תאי אב במח עצם, Ifnar - / - עכברים כנמענים להעברת מאמצת של אבות hematopoietic ושימוש בHGT לביטוי יתר של ציטוקין in vivo. דיור הולם וטיפול בבעלי החיים גם חייבים להינתן על ידי החוקר או מוסד. יתר על כן, ייתכן שיידרש אישור מוסדי לפלסמידים המשמשים בהעברה הידרודינמית גן (כלומר אישור ה-DNA רקומביננטי). המחקרים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש ב UT MD Anderson Cancer Center.
1. ין העברה הידרודינמית (HGT)
צעד זה צריך להתבצע 2 ימים לפני העברת המאמצת של CDPs כדי לגרום למחזור Flt3L להרחבת DC in vivo 5. יחסי ציבורepare לפחות 5 עכברים / קבוצת נמען.
- כדי להשיג HGT יעיל, כלי השיט של הנמען Ifnar דם - / - עכברים (+ CD45.2) צריכים להיות מורחב על ידי חשיפת עכברים למנורת חימום ל5-10 דק '.
- מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול.
- הזרק 5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד Flt3L ב2 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. לקבוצת הביקורת, להזריק 5 מיקרוגרם של וקטור ריק (pORF) דרך וריד הזנב כפי שצוין.
- לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור למשך 2 ימים.
2. בידוד של Hematopoietic אבות מעכבר מח עצם
יש לבצע שלב זה 2 ימים לאחר HGT. השתמש CD45.1 + עכברי congenic כמקור לתאי אב במח עצם להעברת מאמצת לנמען Ifnar - /- בעלי חיים (CD45.2 +). בפרוטוקול זה, זני congenic נדרשים להבחין תורם וDCS-נגזר נמען, וכן כדי למנוע דלדול בתיווך חיסונית בשל חוסר התאמת MHC. כ 10-20 עכברים יידרשו כדי לספק כמות מספקת של תאי אבות היווצרות הדם (10 5 תאים / עכבר נמען) לניסויי ההעברה.
- להרדים CD45.1 congenic 10 + עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם.
- מניחים כל פגר על מגש נתיחה ולעקר את הבטן ורגליים עם 70% אתנול.
- עושה חתך באמצע הבטן וחתך את העור מהבטן לכל רגל, חיתוך עור לאורך רגלו.
- להסיר בעדינות את העור מכל רגל, ולחתוך ולהסיר את הרגליים מן הפגר במפרק הירך באמצעות מספריים חדים.
- מוציאים בזהירות את השרירים מהירך ועצם השוק של כל רגל באמצעות סכין חד.
- להסירשני הקצוות של עצם הירך ועצם שוק עם אזמל חד ולמקם את העצמות בצלחת תרבות המכילה מלא RPMI (RMPI 10% בסרום חום מומת שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, פירובט נתרן 1 מ"מ ו50 β-mercaptoethanol מיקרומטר) .
- הכן את מזרק המכיל 1 מיליליטר של RPMI השלם, מחובר למחט G 27.
- להכניס את מחט 27 G לתוך קצה אחד של עצם הירך או שוקה. לשטוף את מח העצם מהירך או השוקה בעדינות על ידי הזרקת RPMI להשלים לתוך העצם. ודא שתאי מח עצם הוצאתו מהעצמות, זה יכול להתבצע על ידי בחינה ויזואלית איתור מדיה גורשה שמופיעה מעונן.
- חזור על שטיפת כל 3x עצם ירך ועצם השוק כדי להסיר ביסודיות תאי מח עצם.
- הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting בעדינות תאים למעלה ולמטה 3-5x בצלחת התרבות.
- להסיר שאריות על ידי העברת תאי מח עצם דרך מסננת 40 תא מיקרומטר, הצבת התאים הקרינו לcultur חדשהצלחת דואר. לשבש כל גושי תאים המופיעים במסננת על ידי לחץ עדין עם סוף בוכנת מזרק סטרילי.
- Lyse תאי דם האדום (RBC) הנמצאים בהשעית התא במח עצם המוחלטת עם מאגר תמוגה RBC מסחרי להוראות היצרן. השתמש 2 מיליליטר buffer/4-6 תמוגה RBC x 10 7 תאים (בדרך כלל בתאים מעכבר אחד) וזמן דגירה של 5 דקות ב RT.
- לשטוף את תאי מח עצם על ידי pelleting תאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות בשעה XG 500, בעדינות aspirating מדיום התרבות, resuspending ב10 מיליליטר חיץ FACS (1x PBS + 2 מ"מ EDTA + 1% FBS), תאי pelleting ידי צנטריפוגה ובעדינות aspirating לשטוף מאגר.
- חזור על לשטוף, כמתואר בשלב 2.13, עבור סכום כולל של 2 שוטף.
3. סלולרי הקרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד CDPs
צעד זה דורש גישה למפריד תא MidiMACS ועמודות MACS LD להליך בחירה שלילית ראשוני,כמו גם מכונה FACS עם לפחות 3 בלייזרים על מנת לטהר את קבוצת משנה אב ססגוניות לאחר צביעה עם נוגדנים מצומדות fluorescently.
- לאחר לשטוף את השני בשלב 2.14, לספור את תאי מח עצם. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS כדי להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים לכל 30 μl של חיץ FACS.
- כדי להכין את התאים לFACS, תאי שושלת שלילית מועשרים ראשון על ידי טכניקת סלקציה שלילית שמסירה תאי שושלת חיובית מתערובת מח עצם באמצעות כרומטוגרפיה עמודת חרוז מגנטי. להליך הבחירה השלילי, להוסיף 1 מיקרוגרם של כל אחד מהנוגדנים הבאים החולדה מסחרית אנטי עכבר (שרירי בטן) שמזהים סמני שושלת hematopoietic: CD3, CD19, CD11c, CD11b, וטר-119 אבס. שרירי הבטן יש להוסיף בנפח של 2 μl / Ab להשעית תא 30 μl בחיץ FACS.
- דגירה ההשעיה התא על 4 מעלות צלזיוס במשך 30דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13.
- Resuspend תאים להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 cells/40 μl של חיץ FACS. הוסף 20 μl של עז אנטי עכברוש microbeads המגנטי IgG לכל 40 μl של השעיה תא. מערבבים בעדינות ולדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטוף תאים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13.
- Resuspend עד 10 תאי מח עצם ב8 500 μl של חיץ FACS.
- טען עמודת LD MACS על מפריד תא MidiMACS להוראות היצרן וprerinse הטור עם חיץ FACS 2 מיליליטר.
- החל את ההשעיה התא במח עצם לעמודה, טעינה עד 5 x 10 8 תאים ב2.5 מיליליטר של חיץ FACS. ודא צינור איסוף (צינור חרוטי 15 מיליליטר) ממוקם מתחת לעמודה. לשטוף את עמודת 3x עם 2 מיליליטר של חיץ FACS / לשטוף, ולאסוף את התאים שעוברים דרך העמודה, שיהיה מועשרת עבורתאי שושלת שלילית. ספירת התאים בחומר eluted (לשטוף דרך) מהטור.
- כדי לבצע סלקציה חיובית של תת אב hematopoietic על ידי FACS, תאי כתם עם שרירי הבטן הבאים fluorescently מצומדות:-IL-7R (פסיפיק בלו), FLT3 (PE), SCA-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit שרירי בטן (APC.Cy7), בתוספת תערובת של אבס סמן השושלת מכוון נגד CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 וTer119 (כל כותרתו עם PerCP Cy5.5). השתמש 0.5-1 μl של כל Ab בנפח כולל של 100 μl. דגירה השעיה תא על 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
- שטוף תאים כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS בריכוז של 2-3 x 10 7 תאים / מיליליטר. סנן תאים דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר כדי להסיר גושי תא. השלב אחרון זה הוא חיוני כדי למנוע סתימה במכונה FACS.
- מניחים את ההשעיה התא בצינור FACS על הבמה FACS ולמיין CDPs (לין - c-kit והנה CD115 + FLT3 +) עלבסיס פרופיל הסמן המצוין. איסוף תאים מטוהרים בצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של RPMI המלא.
- רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף ריצת FACS. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend ב סטרילית PBS לניסויי העברת מאמצת.
4. העברת מאמצת של CDPs
צעד זה נעשה בדרך כלל במתקן בעלי החיים שבו עכברי הנמען הם שוכנו. בהתאם למיקום של המכונה FACS, זה עשוי להיות כרוך בהובלה של אוכלוסיות תאים ובתאים המטוהרים למתקן בעלי החיים לפני העברת מאמצת. צריכה להיות כל הזמן השעיות תא אב סטריליים ומועברות על קרח.
- הכן השעיות תא להזרקה על ידי דילול 10 5 CDPs מטוהר בהיקף כולל של 100 סטרילי PBS μl. הנח השעיה תא במזרק המצורף למחט G 27.
- לחשוף את הנמען Ifnar - / - +) למנורת חימום ל5-10 דקות כדי להשיג זריקה יעילה דרך וריד הזנב.
- מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול.
- הזרק 10 CDPs 5 מטוהר FACS-ב100 μl PBS לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27.
- לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור.
5. בידוד של PP ומדידה של PDC סכומים
- ב7-10 ימים לאחר העברת מאמצת, להרדים עכברי הנמען. בעדינות לפתוח את העכבר על ידי לנתיחה ולחשוף את המעי.
- הסר את כל המעי ולמקם אותו במגבות נייר ספוגות PBS. לאסוף את כל PPS הגלוי לאורך הקיר של המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר. יש עכברים בדרך כלל 5-10 PP / עכבר, שהם שונים מזקיקי הלימפה מבודדים מצאו - C57BL6 וIfnar - /לאורך המעי הדק 18. שים לב שPPS הוא לעתים קרובות מבני ברור אפילו בתוך עכבר אחת, להבטיח כל כך בזהירות את כל PPS מזוהים וגזור.
- הנח PPS בצלחת פטרי המכילה PBS, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את צואה. חזור על תהליך זה פעמיים כדי לנקות PPS.
- Digest PPS עם מ"ג / IV collagenase מיליליטר 1 ב10 פתרון מיליליטר של 1x האנק מאוזן מלח (HBSS) ב50 מיליליטר בקבוקון עם ערבוב נמרץ במשך שעה 1 ב 37 ° C.
- הנח את PP מתעכל בתא העליון של תאי מסננת תא וכוח 40 מיקרומטר דרך מסננת עם בוכנת מזרק סטרילי. אסוף את ההשעיה תא PP בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- גלולה תאי PP מתוחים על ידי צנטריפוגה ב XG 500 לדקות 5 ו resuspend ב 6 מיליליטר של 37% פתרון Percoll (37% Percoll בRPMI בינוני). מניח בעדינות 6 מיליליטר של 70% פתרון Percoll (70% Percoll במדיום RPMI) מתחת להשעית התא, כדי ליצור שיפוע צעד Percoll.
- צנטריפוגה תאים ל20 דקותt XG 800 עם צנטריפוגה לנתק. תאים חד גרעיניים יעברו לממשק 37/70%. לאחר צנטריפוגה, אוכלוסיית התאים חד הגרעיניים צריכה להיות שנאספו על ידי pipetting זהיר באזור הממשק. גלולה שנאספו תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעמיים ב50 מיליליטר של RPMI / לשטוף מלא. נפח גדול משמש כדי להבטיח הסרת Percoll מלאה.
- כתם תאי PP נאספו עם הנוגדנים הבאים כדי לזהות pDCs העכברי הנובעים מהאבות העבירו adoptively (CD45.1 +), או עכברי נמען (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (פסיפיק בלו), CD11b (Cy5.5 PerCP), B220 (APC), Siglec-H (PE) וPDCA-1 (ABS FITC). לבצע ניתוח cytometry זרימה של תאי PP כפי שצוין בצעדים 3.9 ו3.10. לזהות pDCs ידי CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + פנוטיפ. מספרי PDC מוחלטים ניתן לקבוע על ידי המשוואה הבאה:% pDCs x למספר תא tal PP = PP pDCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שלנו מראות אסטרטגית gating לבידודה של CDPs מתאי מח עצם של עכבר (איור 1), כמפורט בפרוטוקולים 2 ו -3. CDPs יהווה כ 0.1% בסך הכל תאי מח עצם, ויכול להיות מבודד בערך 4-6 x 10 4 CDPs מעכבר אחד. עם העברת מאמצת, CDPs להתמיין pDCs וcDCs 10.
איור 1. אסטרטגית Gating לטיהור FACS של CDPs. תאי מוח עצם נאספו מעכברי C57BL6. תאי Lineage החיובי היו מתרוקנים עם שרירי בטן נגד סמני שושלת (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) באמצעות MACS בחירה בתיווך microbead. אוכלוסיית מח עצם הייחוס שלילי המועשר הייתה מוכתמת בfluorescently שכותרתוBS עבור סמני CDP ושושלת, ומטוהר על ידי FACS כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לזהות pDCs בPPS, אנו משתמשים ראשוניים קדימה ואסטרטגיה צד פיזור gating, ואחריו gating לCD11c + Siglec-H + תאים (2A דמויות ו2B) Ifnar -. / - עכברים לירידה משמעותית בpDCs בביחס לPPS עכברי סוג בר (איור 2) 5. לעומת זאת, CD11c + Siglec-H - cDCs נמצאים בכמויות דומות בשני גנוטיפים (איור 2). מכאן, Ifnar - / - עכברים מספקים הזדמנות לבחון את הכינון מחדש PP PDC ללא השפעות של קרינה קטלנית 5. לדוגמא, העברת המאמצת של CDPs סוג בר לIfnar - / - עכברים, כפי שמתואר בשלב 4, מגרה את העלייה בPP pDCs (איור 2). זאת ועוד, טיפול מקדים עם Flt3L HGT נוסף הרחבת PDC משופרת בPPS (איור 2) (שלב 1), רומז CDPs הועבר ו+ אבות FLT3 אנדוגני אפשרות להגיב לFlt3L ידי גרימת pDCs PP. שני התנאים גם מגורה CD11c + Siglec-H - cDCs מסתכם, בקנה אחד עם המקור ההתפתחותי של cDCs 6. pDCs בPPS להביע סמני PDC מסורתיים כולל PDCA-1, Siglec-H וB220, וחוסר CD11b (איורים 2 ב-D) 4,5. בנוסף, ניתוח של PPS מIfnar - / - עכברים שקיבלו שני Flt3L HGT והועברו CDPs הראו כי הרוב המכריע (~) 70% מpDCs נגזרו מתורם עכברים (CD45.1 +) (2E איור). באופן קולקטיבי, נתונים אלו מראים כי העברת מאמצת של CDPs גורמת אוכלוסיית PP PDC בתגובה לאותות בתיווך Flt3L in vivo.
תוכן "עבור: לשמור-together.within-page = 'תמיד'>
. / - - איור 2 ניתוח של PP PDC Ifnar בעכברים על Flt3L HGT העברת מאמצת של CDPs Ifnar -. / - עכברים הוזרקו לווריד עם Flt3L 5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד או וקטור ריק (pORF) על ידי HGT. יומיים לאחר מכן, 10 5 CDPs המטוהר FACS הועבר adoptively באמצעות הזרקה לוריד זנב. שבעה ימים שלאחר העברת CDP, PPS נאסף ונותח בסכומים PDC (A, B). CD11c + Siglec-H + pDCs בעכברים שקיבלו CDPs + Flt3L HGT נותח נוסף לPDCA-1, B220 (C), CD11b (ד '), CD45.1 וביטוי CD45.2 (E). דפוס הביטוי של PDCA-1, B220 וCD11b היה דומה בpDCs בכל 3 הקבוצות (נתוניםלא מוצג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקת העברת המאמצת המתוארת כאן העריכה תרומת CDPs באוכלוסיית PP PDC עכברים נמען כי חסרים PP pDCs (למשל Ifnar - / - עכברים). בניסויים עתידיים, זה יהיה חשוב להעריך את הפוטנציאל של תת אב אחר ביצירת pDCs PP, בפרט אם pDCs PP נובע מFLT3 + CLPs. על שאלה זו הינה משמעותית שכן עדיין לא ברור מדוע pDCs PP הם ייחודי רגיש לאותות IFNAR-STAT1 לצבירת PP 5, ואם pDCs PP לעקוב רמזים התפתחותיים דומים כמו pDCs באיברים אחרים.
בתאוריה, שיטה זו עשויה גם להתבצע בעכברים חסרי אוכלוסיות PDC בכל האיברים. לדוגמא, עכברים עם חסר בגורם השעתוק E2-2, "הרגולטור" PDC (כלומר Tcf4 - / - עכברים), דלדול PDC מופע מרשים 19. עם זאת, Tcf4 - / - מיקרופוןדואר הוא עובריים קטלני, ובכך Tcf4 - / - עכברי chimeric מח העצם הייתם צריכים לשמש כנמענים לניסויי העברת מאמצת. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם pDCs PP רגיש לקרינה ויהיה מדולדל ביעילות בTcf4 - / - מפלצות. זאת ועוד, הקרנה קטלנית יש השפעות רחבים על מערכת hematopoietic ותמיכה באוכלוסיות סטרומה שעשויה להשפיע על הכינון מחדש PP PDC. לכן, השימוש בIfnar - / - עכברים כנמענים על מנת להעריך את היכולת של adoptively תת אב הועבר להפקת pDCs PP יכולים להיות העדיפו Tcf4 - / -. מפלצות Stat1 - / - עכברים גם מראים ירידה בולטת בpDCs PP ויכולים להיות מועסקים כנמענים ללימודי העברת מאמצת ל מקורות התפתחותיים המחקר PP PDC 5. הערת אזהרה לשימוש בIfnar - / - או Stat1 - / - עכברים הוא מצב מערכת החיסון החלש שלהם, WHIch יכול להשפיע הכינון מחדש PDC PP או פונקציה בדרכים לא ידועות. לכן, גישות עצמאיות להערכת מקורות התפתחותיים PP PDC היינו לשפר את ביטחון עצמי בפרשנות הנתונים.
מבחינה טכנית, יש לציין כי אוכלוסיית CDP נמצאת בתדירות נמוכה מאוד במח עצם בסך הכל, ובכך דלדול של תאי סמן חיובי שושלת ידי כרומטוגרפיה עמודה מגנטית בתיווך חרוז לפני FACS חשוב לטיהור יעילה של התאים על ידי FACS. צעד דלדול זה מעשיר את תאי שושלת שלילית, וכתוצאה מכך זמן ירד FACS (ועלות) לטיהור אב. ההליך מדלדל המתואר כאן מנצל תערובת של נוגדנים ספציפיים לשושלת כי הוא בשילוב עבור כל ניסוי. קוקטיילים נוגדן השושלת מסחריים זמינים גם וניתן להשתמש בו להסרת של תאי שושלת חיובי, במקום של התערובת שאנו מתארים. היתרון של הגישה המתוארת הוא הגמישות שלה בלהיות ישים לdifמטרות דלדול ferent, על ידי התאמת הנוגדנים שנמצאים בתערובת.
בהכנת השעיות תא בודדות מPPS, חשוב להסיר כמה מרקמת המעי שמסביב PPS ככל האפשר. ניתן להשיג זאת על ידי נתיחה מדוקדקת של PPS. עיכול מספק של PPS עם collagenase הוא צעד מפתח כדי לשחרר לויקוציטים מרקמת המעי. טכניקת צנטריפוגה Percoll צפיפות שיפוע תיארה היא שיטה מועדפת להעשרת כדוריות דם לבנות מדגימות PP מתעכלות. בנוסף, חשוב לציין שחלבון הסמן PDC PDCA-1 יכול להיות מוסדר על ידי סוג אני IFN וגירויים אחרים 20. לכן, Siglec-H הוא העדיף כסמן PDC למחקרים שכלל מניפולציות ציטוקינים.
השימוש בHGT יש יתרון ברור במונחים של להיות מאוד חסכוני. בעוד Flt3L HGT נוצל במחקר זה, את היכולת של ציטוקינים אחרים או גורמים מסיסים כדי regpDCs ulate PP יכול להיות נבדק באמצעות HGT, בהעדר או קיומו של תא העברת מאמצת של אבות hematopoietic. עם זאת, HGT תוצאות בייצור מתמשך של ציטוקינים מפלסמיד הועבר לעומת העליות יותר חולפות נצפו במהלך הזרקת ציטוקינים רקומביננטי, אשר תלויות ב5,13 מחצית החיים ציטוקינים. ההעלאה הממושכת של מחזור ציטוקינים עלולה שלא לשקף כמויות פיסיולוגיות הושגו במהלך תגובות hematopoietic חירום או זיהום. אזהרה זו צריכה לזכור במהלך שלבי תכנון ניסוי והערכה של נתונים.
בעבודה עתידית, מניפולציה סלקטיבי של אוכלוסיית PP PDC, כפי שתוארה כאן, יכולה לסייע בהתמודדות עם פונקצית PP PDC. pDCs PP מותנה על ידי מתווכים הנמצאים בסביבה ברירית וחסרה סוג אני IFN ייצור על 4,5 הפעלת TLR. ניתוח של pDCs PP מחדש Stat1 בתוך - / - עכברים הראו ce אלהיש לי LLS יכולת comparably נמוכה כדי לגרום לסוג אני IFN על TLR9 מפעילה ביחס לpDCs PP הנובע באופן טבעי (לא מוצג), המציין pDCs PP נגזר מCDPs הועבר לשמר לפחות נכס זה טבעי PP pDCs. הסוג המופחת אני IFN ייצור של PP pDCs בניגוד לסוג חזק אני IFN הפרשת אוכלוסיות PDC אחרים ומעלה את שאלה בנוגע לתפקיד הפונקציונלי של PP pDCs. זאת ועוד, pDCs PP דומה pDCs המתפתחים בנוכחות של סוג אני IFN, אוכלוסיית PDC שמדגימה גירוי יעיל של-IL-ייצור 17 לימפוציטים מסוג CD4 + T (תאי Th17) 5. בעוד תאי Th17 נחשבים נרחב כדי להיות אוכלוסיית גרימת דלקת, יש להם את שני תפקידי המגן ופתוגניים במעיים 21. בנפרד, pDCs דווח לתווך סובלנות מערכתית למנוהלת אנטיגן 15 דרך הפה. התפקיד של pDCs PP בחסינות מקומית ומערכתית הוא עניין משמעותי, כפי שהבנת נקודה זו עשויה לחשוף neגישות w כדי לתפעל את תגובה חיסונית ודלקתית במעיים בטיפול במחלה.
לסיכום, השיטה המוצגת במסמך זה מאפשרת ההערכה של הפוטנציאל ההתפתחותי של תת אבות היווצרות הדם להפקת PP pDCs. הליך זה מספק עכברים עם pDCs PP מחדש. לכן, גישה זו עשויה לשמש לא רק להערכת מקורות hematopoietic PP PDC, אלא גם להבנת התרומה של pDCs PP לפונקציות חיסוניים בסביבת המעיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. אלכס גלברד וילם Overwijk עצה על העברת גנים הידרודינמית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIH (AI098099, מע), במרכז אנדרסון לסרטן אפיגנטיקה, מרכז MD Anderson לדלקות וסרטן (מע), וקרן RE בוב סמית החינוך (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
